Contribution de la protéomique au diagnostic des cancers colorectaux Marie-Alice MEUWIS (1), E. LOUIS (2), Marie-Paule MERVILLE (1) (1) Clinical chemistry, CBIG, GIGA, CHU, University of Liège (2) Hepatho Gastroenterology, CHU, University of Liège (Belgium)
Contribution of proteomics to colorectal cancer diagnosis RÉSUMÉ Le cancer du colon est la seconde cause de mortalité liée au cancer dans nos pays développés. C’est un souci majeur pour les autorités en charge de santé publique qui souhaiteraient mettre sur pied des dépistages systématiques du cancer du colon, dans la mesure où le diagnostic précoce réduit les risques de mortalité. Malheureusement, le coût des méthodes classiques de diagnostic est actuellement trop important pour envisager un dépistage systématique à grande échelle. Il existe un réel besoin de développer de nouveaux outils diagnostiques, rapides, faciles, peu coûteux et efficaces pour le cancer du colon. La mise à disposition de biomarqueurs aussi sensibles que spécifiques, capables de diagnostiquer les stades précoces de cette maladie et corrélés aux méthodes cliniques classiques de diagnostic reste un idéal non atteint. Cependant, le développement constant de certaines techniques, comme les techniques protéomiques, pourrait constituer une option séduisante et adaptée à la découverte de nouveaux biomarqueurs spécifiques au cancer du colon et permettre le développement de nouveaux outils diagnostiques. Ces techniques ont déjà ouvert de nouvelles perspectives dans divers cancers et autres pathologies. Cet article présente une revue des découvertes actuelles dans le domaine de la protéomique appliquée au cancer du colon et plus précisément au diagnostic de ce type de cancer.
SUMMARY Colorectal cancer is the second cause of cancer related death in developed countries. It is of major concern for public health authorities which are interested in large population screening for CRC, as early identification leads to decreased mortality. Unfortunately classical clinical diagnosis methods are too expensive to be applied for large screening. The development of rapid, low cost, easy and accurate tools for CRC diagnosis is needed. Biomarkers as sensitive as specific, able to achieve prognosis of CRC and correlated to clinical features still remain elusive. But the growing fields of new techniques like proteomic ones might be a suitable option to discover new specific biomarkers for CRC and for developing new tools of diagnosis. These techniques have already given new insights in various cancers and other diseases. This paper reviews the current knowledge in the fields of proteomics dedicated to CRC and more precisely to CRC diagnosis.
INTRODUCTION En dépit de l’amélioration des connaissances dans l’étiologie du cancer colorectal (CCR), du développement croissant des traitements spécifiques et d’outils diagnostiques, le CCR reste encore la deuxième cause de décès dans les pays occidentaux. Le diagnostic précoce du CCR ou de toutes anomalies coliques (comprenant les polypes adénomateux et les lésions planes) est associé à une augmentation des chances de survie [1]. De nos jours, le diagnostic de CCR repose encore sur les méthodes classiques, telles que la coloscopie, le lavement baryté et plus récemment développée, la coloscopie virtuelle. Cette dernière présente l’avantage d’être moins invasive que la coloscopie classique. Elle implique moins d’irradiations que le lavement baryté et peut au prix de quelques améliorations techniques être réalisable sans aucune préparation préalable du patient, en marquant les selles avec un agent de contraste. Néanmoins, sa
sensibilité semble variable selon les études réalisées [2]. De plus, de telles techniques ne sont pas dépourvues de risques (perforations accidentelles, survenant aussi bien en coloscopie classique que virtuelle). Par ailleurs, elles sont trop coûteuses pour être utilisées comme outil de dépistage systématique à grande échelle. Seul un nombre restreint de tests diagnostiques moléculaires, réalisés dans des conditions précises, sont recommandés pour la surveillance et le diagnostic de CCR : le CEA (antigène carcinoembryonaire) sérique ou fécal, CA19-9 (antigène carbohydraté gastrointestinal 19-9) et la recherche de traces de sang dans les selles (FOBT ou Fecal Occult Blood Test). Etant donné que le diagnostic précoce de CCR est considéré comme un problème prioritaire de santé publique, plusieurs gouvernements (USA, Danemark, Angleterre et Australie) ont évalué l’impact de ces tests biologiques en temps qu’outils de dépistage, sur la mortalité causée par CCR, de façon prospective et sur de grandes populations. Le FOBT,
Tirés à part : Dr Marie-Alice MEUWIS, Clinical chemistry, CHU, B23, +3 Sart Tilman, 4000 Liège (Belgium). Mots-clés : biopsie, cancer colorectal, diagnostic, profil protéique sérique, protéomique. Key-words : biopsy, colorectal cancer, diagnosis, proteomic, serum profiling. Acta Endoscopica
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le CEA et le CA19-9 sont intéressants à divers stades du CCR ou peuvent servir de facteurs pronostiques. L’emploi du FOBT dans le dépistage du CCR a conduit à une réduction de la mortalité liée au CCR dans plusieurs études réalisées sur des populations assez conséquentes [1]. Néanmoins, cette technique est critiquée à cause de la proportion significative de faux négatifs obtenus. Le CEA et le CA19-19 n’ont pas démontré leur utilité comme test de dépistage ou de diagnostic. Ils sont essentiellement utiles dans la surveillance des récidives après chirurgie ou autres traitements [3, 4]. Mais leurs spécificités et sensibilités évaluées isolément ne sont pas satisfaisantes. C’est la raison pour laquelle de nombreuses équipes testent en plus de ces marqueurs tumoraux et des techniques classiques, de nouvelles molécules, leurs précurseurs et leurs produits métaboliques, afin d’améliorer le diagnostic de CCR [4]. Parmi ces marqueurs encore à l’étude, on remarque des facteurs génétiques tels que les mutations de la famille du gène Ras, les mutations de P53, l’instabilité des microsatellites, certaines translocations chromosomiques, des molécules impliquées dans l’angiogenèse, comme VEGF, les molécules d’adhésion cellulaire, les molécules liées à l’inflammation telles que le Facteur Tissulaire, S100A4, la CRP et d’autres acteurs de signalisation tels que la protéine de matrice nucléaire (NMP), l’ARN messager de la Thymidylate synthase (TS), certaines polyamines et le facteur de von Willebrand [4-9]. Malheureusement, tous ces marqueurs ne sont pas hautement spécifiques du CCR ; ils s’observent également dans d’autres types de cancer. Dès lors, de nombreux auteurs proposent d’utiliser différents marqueurs combinés dans des modèles multivariés, afin d’obtenir un diagnostic du CRC plus spécifique et plus précis [10, 11]. Dans ce contexte, les techniques émergentes de protéomique sont intéressantes dans le but de découvrir de nouveaux biomarqueurs. La protéomique clinique est une discipline en constante évolution qui révèle déjà des progrès dans le domaine du diagnostic de diverses pathologies telles que le cancer [12-14]. Ainsi, l’évaluation de protéomes particuliers est rendue possible par cette approche technologiquement très sensible et offre la possibilité d’évaluer plusieurs biomarqueurs combinés en un seul test. De plus, cette technique présente la capacité de traiter de nombreux échantillons rapidement, une caractéristique intéressante pour le dépistage. Parmi les nombreuses études publiées à ce jour, la présente revue se focalise sur la contribution de la protéomique à la découverte de nouveaux biomarqueurs spécifiques du CCR et aussi au développement de nouveaux tests de diagnostic basés sur l’utilisation de profils protéiques spécifiques du CCR CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES À PROPOS DES TECHNIQUES PROTÉOMIQUES Plusieurs technologies telles que l’électrophorèse sur gel en deux dimensions, (gels 2D), ou d’autres plus spécialisées dans l’étude des profils protéiques 296
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existent et sont destinées à l’étude comparative des protéines tissulaires exprimées dans des conditions particulières ou présentes dans un fluide biologique. Elles permettent avec l’utilisation de méthodes statistiques puissantes de détecter certaines protéines ou peptides différentiellement présents dans l’un ou l’autre des échantillons comparés. Deux stratégies rationnelles différentes sont généralement utilisées dans les travaux publiés. En général, les scientifiques étudient les biomarqueurs d’intérêt individuellement, en détails, en les purifiant, les identifiant et en les corrélant également avec les résultats des méthodes classiques. La seconde stratégie utilise toutes les données récoltées dans les profils protéiques. Des modèles de classification sont ensuite établis selon des méthodes bioinformatiques et statistiques robustes. La signature protéique obtenue peut dès lors orienter la classification de l’échantillon dans une catégorie donnée, sans pour autant connaître l’identité de tous les facteurs protéiques contribuant au diagnostic final. Néanmoins, en raison des difficultés de reproductibilité d’un diagnostic intégratif et basé sur des profils protéiques prédictifs, la communauté scientifique demeure très prudente et reste réfractaire à la seconde méthodologie. Ils préfèrent utiliser des modèles de classification construits à partir de biomarqueurs identifiés et concordant avec l’étiopathologie de la maladie. Des échantillons de différentes origines peuvent être comparés, provenant de lignées cellulaires modèles, de divers fluides biologiques (sérums, plasmas, urines, ascites, larmes,...) ou d’échantillons dérivant des modèles animaux ou de patients (biopsies, cellules sanguines,...). Ces échantillons sont dilués ou peuvent être purifiés et fractionnés, afin de détecter des protéines minoritaires. De plus, en comparant des patients sous traitements, divers, sous un régime particulier, sur une longue période ou encore présentant différents stades ou degrés de maladie, les techniques protéomiques peuvent fournir des données précieuses et complètes. Les progrès récents en protéomique clinique et les nouvelles perspectives apportées par ces techniques sont décrits dans la littérature spécialisée [15, 16]. Des techniques aussi variées que l’électrophorèse sur gel 2D et l’analyse de profils protéiques par SELDITOF-MS ou MALDI-TOF-MS, la technique de « MALDI Imaging » et la combinaison de plusieurs technologies telles que la LC/MS-MS, 2D LC/MSMS, ICAT, SILAC, les nanotechnologies constituent des plateformes offrant des capacités variées. Un des avantages réside dans la puissance de la spectrométrie de masse qui a été développée et utilisée premièrement pour le contrôle de qualité, par exemple dans l’industrie pharmaceutique. La spectrométrie de masse requiert habituellement de très petites quantités d’échantillon. En plus de sa sensibilité, elle permet d’évaluer la masse de façon très précise, un élément qui n’est pas toujours accessible par les techniques classiques. De cette façon, elle permet de détecter des modifications traductionnelles ou de différencier divers isotypes, de masses différentes qui peuvent échapper à d’autres techniques telles que les Acta Endoscopica
techniques classiques de « Western Blotting » ou d’ELISA. Une autre force de cette stratégie globale est le fractionnement des échantillons. Cette étape de préparation est basée sur les méthodes classiques bien connues de biochimie qui peuvent être complètement standardisées et transposées à l’échelle nano, réduisant le temps, les variations et la consommation de matériel biologique précieux. Dès lors, les techniques protéomiques, évoluant rapidement vers une plus grande automatisation et reproductibilité, devraient gagner en robustesse et pourraient très rapidement satisfaire les critères requis pour le diagnostic clinique. Cela présage, dans un avenir proche, de nouveaux développements dans ce domaine. L’étude par protéomique des pathologies aussi fréquentes que le CCR suscite un intérêt grandissant, comme on peut en juger par les nombreuses publications rapportées dans ce domaine. PROTÉOMIQUE ET CRC Etude des profils protéiques sériques Le développement récent de la technique SELDITOF-MS est basé sur l’utilisation de chip array comportant des groupes chimiquement activés capables d’interaction avec les protéines qui y sont déposées. Ces protéines purifiées sur chip sont analysées par un spectromètre de masse SELDI-TOF (Surface Laser Enhanced Desorption Ionisation Time Of Flight Mass Spectrometer) qui enregistre les spectres et constitue les profils protéiques selon les protéines détectées [17, 18]. Cette technique a été utilisée pour analyser du sérum de patients atteints de CCR avec de bons résultats dans différentes études [19-22]. Les auteurs ont utilisé les sérums de patients souffrant de CCR à différents degrés ou stades (grades de Dukes et stades I to VI). Ces échantillons ont été prépurifiés directement sur chips et les profils protéiques obtenus sont différents pour chaque nature de chips utilisés. L’analyse des données provenant des profils protéiques a été réalisée par des méthodes de calcul bioinformatiques sophistiquées : « Machine Learning Algorithm » et « Artificial Neural Network Classification ». Des modèles de classification sur base de quelques biomarqueurs potentiels sélectionnés ont pu être construits. Ces modèles sont capables de différencier les patients CCR des sujets sains. La discrimination des différents grades et stades parmi les patients CCR, est aussi possible avec une sensibilité et une spécificité élevées. Néanmoins, aucune validation ou test en double aveugle n’ont été publiés à ce jour, permettant de confirmer ces résultats. D’autres travaux plus complets ont été réalisés sur SELDITOF-MS à partir de biopsies et ont été également confirmés dans des sérums des patients [19]. Enfin, Semmes et al. ont publié une étude sur le diagnostic du cancer de la prostate avec la technique SELDITOF-MS. Ils obtiennent une très bonne discrimination des patients à partir d’un modèle construit sur des données dérivant des profils protéiques. Ce modèle a d’ailleurs été validé avec succès sur plusieurs plateformes SELDI, tant aux Etats-Unis qu’en Acta Endoscopica
Europe. Ils ont également dressé une liste de modalités ou lignes directrices à respecter concernant la conception des expériences, particulièrement du point de vue des contrôles de qualité ; ce qui témoigne des efforts accomplis afin de répondre aux critiques généralement formulées à l’encontre de cette technique [20]. Biopsies de patients L’étude protéomique sur biopsie est sans doute la mieux documentée et de loin la moins critiquée. En effet, chaque patient est son propre contrôle négatif, pour la comparaison entre tissus tumoraux et tissus sains voisins. Mais, la question délicate repose davantage sur la possibilité d’utiliser des cellules tumorales sélectionnées par la technique LCM ou « Laser Capture Microdissection » ainsi séparées des cellules épithéliales ou la biopsie entière comportant les différents types tissulaires [16]. Des études par électrophorèse sur le gel 2D-DIGE très sensibles et l’identification des protéines différemment exprimées par le MALDI-TOF-MS ont été également publiées [21-22]. Ces travaux sont focalisés sur des biopsies de cellules tumorales ou de tissus adjacents non tumoraux provenant de patients CCR présentant une maladie localisée sur un seul site ou localisée à plusieurs endroit du colon. Plus de 32 protéines différentiellement représentées dans les groupes ont été sélectionnées. Cependant, seuls les derniers auteurs ont confirmé leurs résultats par « Immunoblotting » spécifique ou par détection immunohistochimique. Entre autres, ils ont confirmé différentes isoformes et une forme phosphorylée de la Vimentine, les Cytokératines 8 et 19, la Calréticuline, l’apolipoprotéine A1… Cette étude a mis en lumière une catégorie ou famille de protéines précédemment impliquée dans la carcinogenèse par une méthode génomique et par d’autres études protéomiques : MAT-1 (une protéine identifiée dans la lignée cellulaire d’adénocarcinome métastasique mammaire), la Cathepsine D et la Calréticuline [22]. Toutefois, ce type d’étude prend énormément de temps et ne peut être effectuée que sur peu d’échantillons à la fois, ce qui limite la pertinence des biomarqueurs candidats sélectionnés. Ils devraient être évalués sur de plus grandes cohortes de patients afin d’avoir une réelle valeur statistique. Contrairement au 2D-DIGE, l’analyse SELDITOF peut être réalisée sur de nombreux échantillons de lysats de tissu tumoral ou non tumoral de manière à avoir une analyse statistique significative. De nombreuses équipes ont utilisé cette stratégie avec succès aboutissant à la découverte, dans une étude relativement limitée, d’un groupe non encore identifié de peptides de masse allant de 3.4 à 3.6 kDa. Ceux-ci montrent une nette augmentation dans les cellules tumorales du CCR [23]. De plus, deux études intéressantes, réalisées par des groupes indépendants ont donné des résultats similaires et complémentaires [24,19]. Tous deux ont observé, au niveau des cellules tumorales et du sérum des patients atteints de CCR, un accroissement du taux des peptides HNP1, Volume 37 - N° 3 - 2007
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2 et 3 ou α-défensines 1, 2, 3, présentant des masses de 3372, 3442 et 3486 Da respectivement. Ces observations ont été confirmées par d’autres techniques, dont l’immunohistochimie qui révèle la répartition des HNP1-3, au niveau des cellules tumorales et des tissus normaux environnants, tels les macrophages et les fibroblastes de la membrane basale de la muqueuse. Globalement, ceci plaide pour un rôle potentiel de ces petites protéines dans l’étiologie de nombreux cancers et des pathologies inflammatoires telles que la maladie de Crohn et la rectocolite ulcéro-hémorragique. Evidemment, des stratégies similaires peuvent être appliquées dans le cadre de l’étude de la métabolisation des médicaments ou du suivi des patients en fonction de leurs traitements, telles que réalisées dans une étude protéomique centrée sur le cytochrome P450 [25]. Certains auteurs ont découvert deux protéines spécifiques liées au développement du CCR, en utilisant des cellules microdisséquées tumorales provenant d’adénomes et de cellules coliques normales. Ils ont identifié HSP10, par la stratégie protéomiques utilisant l’étude différentielle des profils protéiques. Une augmentation de l’HSP 10 a été observée dans l’adénome du CCR et confirmée par immunohistochimie sur coupes tissulaires et par « Western Blotting » sur des lysats cellulaires [26]. Une comparaison entre les profils protéiques générés par SELDI-TOF-MS à partir de cellules coliques normales, adénomateuses ou de carcinomes, isolées par microdissection au laser (LCM) a été également publiée. Parmi les protéines différentiellement présentes, se trouve la Calgizzarine (ou S100A11). Cette dernière a pu être confirmée par immunodéplétion du profil protéique initial par une technique de purification via un anticorps spécifique anti-Calgizzarine. De plus, elle a été aussi confirmée au niveau des tissus par immunomarquage. Récemment, le développement de puces à protéines a été réalisé, combinant les données découvertes par les techniques de génomique et de protéomique. Par exemple, dans le diagnostic du CCR, Belluco et Lise ont utilisé une puce à phosphoprotéines. Elle regroupe 29 anticorps spécifiques ciblés sur des phosphoprotéines connues, souvent le point final des cascades d’activations impliquées dans la carcinogenèse, telles que la forme clivée de la Caspase 3, Erb2, ERK ou NF-kB P65. Cette puce a été testée sur des lysats de cellules néoplasiques exclusivement, provenant de CCR primaires, avec et sans métastases hépatiques et des cellules hépatiques métastasées. Le but poursuivi est de caractériser les protéines phosphorylées et les voies de signalisation potentiellement activées spécifiquement à ces divers stades invasifs ou non invasifs du CCR. Des outils bio-informatiques et mathématiques sophistiqués ont été utilisés afin d’associer les différents profils phosphoprotéiques aux différents stades de CCR [27]. D’après les résultats obtenus, les auteurs concluent que les micro-environnements formés par la présence des cellules tumorales de différents stades de CCR sont porteurs de différents signaux de transduction qui peuvent être mis en évidence par de telles tech298
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niques. Ils suggèrent également que ces profils sont le reflet de la pathogenèse de ces maladies. Dès lors, des outils similaires pourraient être développés afin de déterminer la signature protéique des patients en exploitant, par exemple, des biomarqueurs identifiés par d’autres études protéomiques. STRATÉGIES ET TECHNIQUES ÉMERGENTES La protéomique combine des technologies en constante évolution. Notons les progrès réalisés en spectrométrie de masse, dont le développement d’appareils à la fois robustes et efficaces, automatisés et plus faciles à utiliser en routine. Certains sont proposés pour diverses applications, telles que l’identification des protéines, l’analyse des profils protéiques, la protéomique quantitative, utilisant des méthodes telles que l’ICAT ou « Isotop Coded Affinity Tags », les isotopes marqués pour une quantification relative et absolue (iTRAQ™) ou un marquage isotopique stable des acides aminés en culture cellulaire (SILAC) et une application nouvelle apparentée aux techniques d’imagerie : le « MALDI Imaging ». De plus, ils peuvent être combinés à des plateformes de purification d’échelle variable : HPLC à microflux ou nanoflux, permettant une meilleure séparation des protéines et l’analyse d’espèces pures. Les technologies nano offrent un intérêt particulier compte tenu des développements de biomatériaux mis au point pour la purification, qui reste une étape très importante afin d’obtenir une identification correcte des protéines par séquençage. De plus, des améliorations importantes ont été générées dans les analyses sur gels 2D avec l’avènement de la technique 2D-DIGE, qui utilisent des colorants plus sensibles que les colorations conventionnelles aux sels d’argent ou au bleu de Coomassie. De plus, les différents échantillons que l’on désire comparer sont colorés avec des chromophores fluorescents différents et résolus, sur le même gel évitant les erreurs d’interprétation. Enfin, la technique de 2D LC/MS-MS permet de combiner directement les avantages de la dérivatisation chimique des échantillons ainsi marqués et la séparation de protéines non résolues sur gel 2D tels que les protéines très acides ou basiques [16]. Mais dans le contexte du diagnostic clinique, l’étude des profils protéiques obtenus avec des protéines purifiées directement sur chip ou sur microbilles activées chimiquement, le « MALDI Imaging » et les techniques dérivées sont probablement les méthodes les plus prometteuses. L’analyse des profils protéiques devrait permettre de déterminer des signatures particulières de protéines ou de peptides, représentatives et informatives des différents stades d’une pathologie. Les techniques, telles que l’analyse des profils protéiques par SELDI-TOF-MS ou MALDI-TOF-MS évoluent vers l’adaptation au diagnostic dans le domaine médical. Le « MALDI Imaging » a pour ambition de compléter les méthodes d’analyses histologiques classiques. Cette technique est basée sur l’obtention de profils protéiques direcActa Endoscopica
tement à partir de coupes tissulaires. Il deviendrait alors possible d’analyser le contenu protéique total du tissu inclus, avec une étape de préparation très minime, sans recours à la solubilisation ou la purification de l’échantillon préalablement. Néanmoins, la préparation des tissus pour l’analyse en « MALDI Imaging » doit encore être améliorée afin d’optimaliser la désorption de ces constituants moléculaires. De plus, le « MALDI Imaging » peut fournir une idée de la distribution spatiale des protéines détectées, puisque le programme informatique couplé est capable de reconstituer une image 3D, à partir de coupes sériées d’un tissu [28].
PERSPECTIVES ET CONCLUSION La protéomique est une discipline émergente et l’intégration de tous les travaux accomplis dans ce domaine devrait déboucher sur de nouvelles possibilités et perspectives dans le domaine du diagnostic précoce de nombreuses pathologies. Les données
générées devraient être organisées, partagées et intégrées, avec l’aide de la bioinformatique, afin d’établir une analyse du protéome humain, tel que lors du séquençage du génome humain. Mais, ces échanges d’informations demanderont encore plus d’énergie et d’organisation puisque le protéome est bien plus conséquent que le génome humain. En fait, les modifications postraductionnelles, les différents variants d’épissage d’une même protéine et la spécificité de l’expression tissulaire, multiplient et compliquent encore les données de départ. Néanmoins, l’intégration des données génomiques, transcriptomiques et protéomiques avec les informations obtenues par les études des signalisations classiques constituent probablement le meilleur moyen d’appréhender la réalité complexe d’un échantillon biologique [29]. Ce type de travail ambitieux, les nombreuses études dans ce domaine, ainsi que les différents développements techniques amélioreront certainement nos connaissances sur la physiopathologie du CCR et permettront aux scientifiques de mettre au point de nouveaux moyens diagnostiques cliniques efficaces et peut-être utiles pour le dépistage du CCR.
RÉFÉRENCES 1. Hakama M, Hoff G, Kronborg O, Pahlman L. Screening for colorectal cancer. Acta Oncol 2005; 44: 425-39. 2. Nicholson FB, Barro JL, Atkin W, Lilford R, Patnick J, Williams CB, Pignone M, Steele R, Kamm MA. Review article: Population screening for colorectal cancer. Aliment Pharmacol Ther 2005; 22: 1069-77. 3. Ouyang DL, Chen JJ, Getzenberg RH, Schoen RE. Noninvasive testing for colorectal cancer: a review. Am J Gastroenterol 2005; 100: 1393-403. 4. Kahlenberg MS, Sullivan JM, Witmer DD, Petrelli NJ. Molecular prognostics in colorectal cancer. Surg Oncol 2003; 12: 173-86. 5. Bendardaf R, Lamlum H, Pyrhonen S. Prognostic and predictive molecular markers in colorectal carcinoma. Anticancer Res 2004 24: 2519-30. 6. Hemandas AK, Salto-Tellez M, Maricar SH, Leong AF, Leow CK. Metastasis-associated protein S100A4 – a potential prognostic marker for colorectal cancer. J Surg Oncol 2006; 93: 498-503. 7. Kawakita M. Hiramatsu K. Diacetylated derivatives of spermine and spermidine as novel promising tumor markers. J Biochem (Tokyo) 2006; 139: 315-22. 8. Garcia V, Garcia JM, Pena C, Silva J, Dominguez G, Hurtado A, Alonso I, Rodriguez R, Provencio M, Bonilla F Thymidylate synthase messenger RNA expression in plasma from patients with colon cancer: prognostic potential. Clin Cancer Res 2006; 12: 2095-100. 9. Wang WS, Lin JK, Lin TC, Chiou TJ, Liu JH, Yen CC, Chen PM. Plasma von Willebrand factor level as a prognostic indicator of patients with metastatic colorectal carcinoma. World J Gastroenterol 2005; 11: 2166-70. 10. Ahlquist DA, Skoletsky JE, Boynton KA. Colorectal cancer screening by detection of altered human DNA in stool: feasibility of a multitarget assay panel. Gatsroenterology, 2000; 119: 1219-27. 11. von Kleist S, Hesse Y, Kananeeh H. Comparative evaluation of four tumor markers, CA 242, CA 19/9, TPA and CEA in carcinomas of the colon. Anticancer Res 1996; 16: 2325-31. Acta Endoscopica
12. Drake RR, Cazare LH, Semmes OJ, Wadworth JT. Serum, salivary and tissue proteomics for discovery of biomarkers for head and neck cancers. Expert Rev Mol Diagn 2005; 5: 93-100. 13. Lam YW, Mobley JA, Evans JE, Carmody JF, Ho SM. Mass profiling-directed isolation and identification of a stagespecific serologic protein biomarker of advanced prostate cancer. Proteomics 2005; 5: 2927-38. 14. Petricoin EF, Ornstein DK, Liotta LA. Clinical proteomics: Applications for prostate cancer biomarker discovery and detection. Urol Oncol 2004; 22: 322-8. 15. Alaiya A, Al-Mohanna M, Linder S. Clinical cancer proteomics: promises and pitfalls. J Proteome Res 2005; 4: 1213-22. 16. Skandarajah AR, Moritz RL, Tjandra JJ, Simpson RJ. Proteomic analysis of colorectal cancer: discovering novel biomarkers. Expert Rev Proteomics 2005; 2: 681-92. 17. Merchant M. Weinberger SR. Recent advancements in surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry. Electrophoresis 2000; 21: 1164-77. 18. Petricoin EF, Liotta LA. SELDI-TOF-based serum proteomic pattern diagnostics for early detection of cancer. Curr Opin Biotechnol 2004; 15: 24-30. 19. Melle C. Ernst G, Schimmel B, Bleul A, Thieme H, Kaufmann R, Mothes H, Settmacher U, Claussen U, Halbhuber KJ, Von Eggeling F. Discovery and identification of alpha-defensins as low abundant, tumor-derived serum markers in colorectal cancer. Gastroenterology 2005; 129: 66-73. 20. Semmes OJ, Feng Z, Adam BL, Banez LL, Bigbee WL, Campos D, Cazares LH, Chan DW, Grizzle WE, Izbicka E, Kagan J, Malik G, McLerran D, Moul JW, Partin A, Prasanna P, Rosenzweig J, Sokoll LJ, Srivastava S, Srivastava S, Thompson I, Welsh MJ, White N, Winget M, Yasui Y, Zhang Z, Zhu L. Evaluation of serum protein profiling by surface-enhanced laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry for the detection of prostate cancer: I. Assessment of platform reproducibility. Clin Chem 2005; 51: 102-12. 21. Friedman DB. Hill S, Keller JW, Merchant NB, Levy SE, Coffey RJ, Caprioli RM. Proteome analysis of human colon Volume 37 - N° 3 - 2007
299
22.
23.
24.
25.
cancer by two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 2004; 4: 793-811. Alfonso P, Nunez A, Madoz-Gurpide J, Lombardia L, Sanchez L, Casal JI. Proteomic expression analysis of colorectal cancer by two-dimensional differential gel electrophoresis. Proteomics 2005; 5: 2602-11. Krieg RC, Fogt F, Braunschweig T, Herrmann PC, Wollscheidt V, Wellmann A. ProteinChip Array analysis of microdissected colorectal carcinoma and associated tumor stroma shows specific protein bands in the 3.4 to 3.6 kDa range. Anticancer Res 2004; 24: 1791-6. Albrethsen J, Bogebo R, Gammeltoft S, Olsen J, Winther B, Raskov H. Upregulated expression of human neutrophil peptides 1, 2 and 3 (HNP 1-3) in colon cancer serum and tumours: a biomarker study. BMC Cancer 2005; 5: 8. Lane CS, Nisar S, Griffiths WJ, Fuller BJ, Davidson BR, Hewes J, Welham KJ, Patterson LH. Identification of cytochrome P450 enzymes in human colorectal metastases and the
INTRODUCTION Despite the increasing knowledge on colorectal cancer etiology and the growing development of specific therapies and diagnosis tools, CRC is still the second cause of cancer related death in western countries. The early diagnosis of CRC or any preceding stages presenting colon abnormalities (including adenomatous polyps or plane lesions) is required to increase chances of survival [1]. Nowadays, CRC diagnosis still relies on classical clinical methods like colonoscopy, double contrast barium enema, or the recent Virtual Colonoscopy (or Computed Tomographic Colonography). This last one presents the advantages of being less invasive than endoscopic colonoscopy, necessitating less radiation than contrast barium enema and following some technical improvement might even be performed without any bowel preparation, tagging the stools with contrast agent. Nevertheless its sensitivity seems to be variable depending on case reports [2]. But such techniques are to some extent risky (accidental perforations have been recognised both with endoscopic or virtual colonoscopy) and are too expensive to be used as large screening tools. Only a few molecular based diagnosis tests, performed in particular conditions, are recommended for CRC diagnosis and follow up : CEA (carcinoembryonic antigen) in blood or faeces, CA19-9 (gastrointestinal carbohydrate antigen 19-9), faecal occult blood test (FOBT). As CRC early diagnosis is an important public health consideration, many governments (United States, Denmark, UK and Australia) are involved in studying prospectively on large cohorts of people the effect of the use of molecular diagnosis testing on CRC mortality. FOBTs, CEA and CA19-9 appear to be interesting in many CRC stages or are prognosis factors. CRC screening using FOBTs has been shown to decrease the CRC-related mortality in several large population studies [1]. However this technique is flawed by a significant proportion of false negative. CEA and 300
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surrounding liver: a proteomic approach. European Journal of Cancer 2004; 40: 2127-34. 26. Melle C. Bogumil R, Ernst G, Schimmel B, Bleul A, von Eggeling F. Detection and identification of heat shock protein 10 as a biomarker in colorectal cancer by protein profiling. Proteomics 2006; 6: 2600-8. 27. Belluco C, Mammano E, Petricoin E, Prevedello L, Calvert V, Liotta L, Nitti D, Lise M. Kinase substrate protein microarray analysis of human colon cancer and hepatic metastasis. Clin Chim Acta 2005; 357: 180-3. 28. Chaurand, P, Fouchecourt S, DaGue BB, Xu BJ, Reyzer ML, Orgebin-Crist MC, Caprioli RM. Profiling and imaging proteins in the mouse epididymis by imaging mass spectrometry. Proteomics 2003; 3: 2221-39. 29. Sagynaliev E, Steinert R, Nestler G, Lippert H, Knoch M, Reymond MA. Web-based data warehouse on gene expression in human colorectal cancer. Proteomics 2005; 5: 3066-78.
CA19-19 have not demonstrated value as a screening or diagnostic tool. They are essentially useful for purposes like monitoring recurrence after surgery and other treatments [3, 4]. But, their specificities and sensitivities taken solely are not satisfying. That is the reason why, beside these markers of tumours burden, numerous teams are assessing with classical strategies new molecules and their producing and downstream metabolic events, in order to implement the diagnosis of CRC [4]. Among these markers still under study, one might notice genetics factors like Ras family gene mutations, P53 mutations, microsatellite instability and chromosomal translocations ; molecules involved in angiogenesis, like VEGF, cell adhesion molecule ; inflammatory related molecules like Tissue Factor, S100A4, CRP and various components involved in many pathways like nuclear matrix protein (NMP), Thymidylate synthase (TS) mRNA, some polyamins and the von Willebrand factor [4-9]. Unfortunately, these markers are not highly specific to CRC, as they are also found in other types of cancer. Thus, many authors propose to use several markers combined in multivariate model in order to obtain more specific and accurate diagnosis of CRC [10, 11]. In this context, the evolving techniques of proteomics are interesting to discover new biomarkers in various contexts. Clinical proteomics is an emerging area already reporting many advances in the field of diagnosis of various pathologies as cancer [12-14]. Hence, it allows the evaluation of particular proteomes through very sensitive technical approaches and arises with the possibility of monitoring and combining many biomarkers in one single test. Moreover, it shows high throughput screening capabilities. Among the vast ongoing publications reported to date, this paper will focus on proteomics contribution to the discovery of news potential specific CRC biomarkers and also on the development of new diagnosis tests for CRC, based on protein profiling. Acta Endoscopica
GENERAL CONSIDERATIONS ABOUT PROTEOMIC TECHNIQUES Several technologies like 2D-gel electrophoresis or others specialized in proteins profiling exist and are dedicated to the study of the comparison of proteins expressed in particular conditions by a tissue or present in a given body fluid. These allow the determination through accurate statistical methods, of some proteins or peptides differentially found present in one or the other compared sample. Two rational strategies exist in the current works reported. Generally, scientists study biomarkers of interest individually in details, purifying and identifying them, correlating either their proteomic observations with classical methods. The second strategy uses all the data collected in the profiles and designs many models of classification with robust bioinformatics and statistical tools. The protein signature obtained may therefore orientate the classification of the sample in a given category, without knowing the identity of all protein factors contributing to the final diagnosis. Nevertheless, due to the difficulty of replication of such integrative diagnostic or predictive profiles, the scientific community stay very cautious with this second option and prefers to establish models of classifications with identified biomarkers, which are consistent with the etiopathology. Samples of different origins can be compared ranging from model cell lines, body fluids (sera, plasma, urine, ascites, tears...) or cells derived from animal models and from patient tissues (biopsies, blood cells…). These samples are diluted or can even be fractionated in order to detect minor proteins. Moreover, by comparing patients subjected to various diseases managements, diets, over long periods of time, presenting different stages or grades of disease…, these proteomic techniques may provide valuable and complete data. Clinical proteomic advances made and new insights brought by these techniques are reviewed in [15-16]. Techniques as various as 2D gel electrophoresis, profiling on SELDI-TOF-MS or MALDI-TOF-MS, MALDI imaging and combinations of several technologies like LC/MS-MS, 2DLC/MS-MS, ICAT, SILAC, nanotechnologies provides strong platforms with various capabilities. One advantage is in the power of mass spectrometry which has been developed and used primarily for assessing quality controls for example, in pharmaceutical industry. Mass spectrometry usually requires very small sample quantity. In addition to its sensitivity, it brings the information on mass very precisely, which is an element not available by classical techniques. This way gives access to possible posttranslational modifications or variant isotypes, differing in mass and which can be missed by other techniques like classical Western blotting or ELISA. Another strength of the overall strategy is the fractionation of samples. This preparation step is based on classical and well known methods of biochemistry and may be completely standardized and transposed to nanoscale, reducing time, variation and consumption of precious materials. Hence, proteomic evolving very rapidly towards more automation and Acta Endoscopica
reproducibility, it should soon satisfy robustness required in clinical diagnosis, predicting in the near future new developments in this area and new diagnosis solutions. The study by proteomic of pathologies as frequent as CRC is more and more popular judging by the numerous publications reported to date. PROTEOMIC ON CRC Serum profiling The recently developed SELDI-TOF-MS technology is based on the binding of proteins on chemically activated groups coated on chip arrays. These on chip purified proteins are resolved with a Surface Laser Enhanced Desorption Ionisation Time Of Flight Mass Spectrometer, which reconstitute profiles according to the panel of proteins detected [17, 18]. This technology has been used in several studies with serum of CRC patients with good success [19-22]. Authors use serum of patients suffering from CRC at different grades or stages (Dukes grades and stages I to VI). They prepared samples by running a pre fractionation directly on chip arrays and obtained different protein patterns as they utilised different nature of chips. They all used sophisticated bioinformatic machine learning algorithm and artificial neural networks classification tools to manage data profiles and propose models of classification based on a few selected potential biomarkers. These were able in these first studies to differentiate CRC from healthy patients and even differentiate grades or stages of CRC, with excellent sensitivity and specificity. Nevertheless, none of these teams have performed or yet published validation or blind test to confirm these results. More complete works have been performed with SELDI-TOF-MS on biopsies and were confirmed in sera [19]. Finally, another group interested in prostate cancer has reported a complete study, using SELDI-TOF-MS serum profiling and achieve accurate discrimination of patients. They validated successfully their models on several SELDI platforms, located in USA and Europe. They also advised modalities to control reproducibility with this technique, attesting of efforts made to answer general criticisms on SELDI-TOF-MS [20]. Patient’s biopsy Proteomic study of biopsy is probably the more documented one and is by far less criticised. Indeed, every patient may possibly be its own negative control, in the comparison of tumour tissue and not affected neighbouring one. But, the sensitive question relies more on the possibility to use laser microdissected cells, separating tumour cells from contact epithelial cells or else the entire biopsy with every tissue types included [16]. Studies with the quite sensitive 2D-DIGE gel electrophoresis and identification of differentially expressed proteins by MALDI-TOF-MS have been recently reported [21-22]. These works focus either on biopsies from tumour cells and adjacent non tumour tissue Volume 37 - N° 3 - 2007
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from CRC patients or on biopsies from patients suffering from CRC at different sites. They identified more than 32 proteins differentially present among groups, but only the last authors confirmed part of their results by specific immunoblotting or immunohistochemistry. Among other, they confirmed several variant isoforms and a phosphorylated form of vimentin, cytokeratin 8 and 19, calreticulin, apolipoprotein A1… This work revealed category and family of proteins found previously involved in carcinogenesis by classical genomics and in other proteomic studies : MAT-1 (a protein identified from metastatic mammary adenocarcinoma cell line), cathepsin D and calreticulin [22]. However, such time consuming studies can only be run on a few samples at a time and the relevance of candidate biomarkers should be addressed in larger cohort of patients, to reach statistical significance.
known to be part of end point signalling cascades involved in carcinogenesis, like clived Caspase 3, Erb2, ERK or NF-kB P65. They utilized neoplastic microdissected cells from primary CRC, with and without liver metastases and liver metastases cells, to characterise the answers, on chip of these non invasive or invasive stages of CRC. They used sophisticated bioinformatics and mathematical tools to associate different metabolic phosphoproteomic profiles with CRC stages [27]. They assume that microenvironment involves different signalling pathways that can be sensed with this type of techniques. Thus, similar tools might be developed assessing the biomarkers or signature of patients utilising for example the well characterised biomarkers proposed in proteomic study.
In contrast to 2D-DIGE, SEDLI-TOF analysis can be performed on many sample lysates of tumour and non tumour tissue to obtain statistical significance. Many teams used this strategy with success allowing the discovery, in a rather small study, of a group of not yet identified peptides in the mass range of 3.4 to 3.6 kDa, which were increased in CRC tumour cells [23]. Moreover, two very elegant and complementary works have been performed by independent groups [24, 19]. They both reported in tumour cells and in sera, that CRC patients showed increased levels of α-defensin 1, 2, 3 peptides or HNP1-3, at mass 3372, 3442 and 3486Da. These observations were confirmed through other techniques like immunohistochemistry which gave the repartition of HNP1-3 in tumour cells and in normal surrounding tissues, as macrophages and fibroblasts of the mucus membrane indicating some potential roles of these peptides in the aetiology of many cancers and in inflammatory pathologies like inflammatory bowel disease. Of course, similar strategies can be transposed to study drugs metabolism and further follow up and management of CRC patients, like proposed in the evaluation of cytochrome P450 by proteomic approach [25].
EMERGING TECHNIQUES AND STRATEGIES
Some authors reported the discovery of two proteins specifics for CRC development, using tumor microdissected cells from adenoma and normal colon cells. They identified HSP10 by proteomic profiling. This heat shock protein 10 was found increased in CRC adenoma and confirmed by direct immunolabelling of tissue sections and by Western blotting analysis on cell lysates [26]. They else reported the comparison of protein profiles generated on SELDI-TOF-MS with normal, adenoma and carcinoma microdissected cells of colon. Among proteins found differentially present, there was Calgizzarin (or S100A11), which could be further confirmed by specific immunodepletion from the original sample at expected peak position in spectra and by immunohistological analysis. Recent developments of proteins microarray analysis have been realized, combining data from genomic and proteomic discovery. For example, in CRC diagnosis, Belluco and Lise tested the use of a specific phosphoprotein chip array. This includes the use of 29 specific antibodies targeting phosphoproteins 302
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The field of proteomics combines technologies, which are in constant evolution and improvement. For example, mass spectrometry instruments constructors, which develop robust and efficient engines, automatized and easy to use. Some of these can be dedicated to various application like identification of protein, protein profiling, quantitative proteomics using methods like isotope coded affinity tag (ICAT), isotope tag for relative and absolute quantitation (iTRAQ™) or stable isotope labelling by amino acid in cell culture (SILAC) and application for imaging (MALDI imaging), which is also commercialised. Moreover, they may be combined with various scale purification platforms, microflow or nanoflow HPLC, enabling better separation of products for analysis of pure species. The nano technologies are of particular interest knowing recent developments in biomaterials designed for purification, a very important step for correct protein identification by sequencing. In addition, efforts have also been made to improve 2D gel based analysis with the 2D-DIGE technology, which uses more sensitive dyes than conventional silver staining or coomassie blue procedures. Indeed, different samples to be compared are stained with particular dyes and are resolved at the same time, on the same gel avoiding misinterpretation. Finally, 2D LC/MS-MS techniques arose combining directly the advantage of chemical derivatisation which label sample, and the separation of proteins unresolved to assess by 2D gel, like very basic or acidic ones [16]. But in the context of clinical diagnosis, protein profiling on chip or after purification steps with chemically activated microbeads, MALDI imaging and related techniques are probably the more exciting methods. Protein profiling would allow the determination of particular signatures of proteins and peptides, to be informative for different pathological states. These instruments and techniques, like SELDITOF-MS or MALDI-TOF-MS profiling are therefore moving towards an adaptation to diagnosis in medical area. MALDI imaging will probably be a complement to classical histological analysis. It is based on protein profiling directly on tissue section. Then, it may directly target total protein content of an embedded Acta Endoscopica
tissue portion with very little step of preparation and no need of presolubilization or fractionation of sample. Nevertheless, tissue preparation for MALDI analysis has to be optimized in order to enhance desorption of constituting molecules. Moreover, MALDI Imaging should also provide spatial information on proteins, with localised concentration as computer program can build 3 dimensions views of a piece of tissue, with its serial slices [28]. PERSPECTIVES AND CONCLUDING REMARKS Proteomics is certainly a very broad field and the integration of all works achieved in the area will open new perspectives in the diagnosis of malignancies.
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The data generated should be shared and organised in order to establish « proteomes analysis of human », like it was realised for human genome sequencing. But, these information exchanges would need even more energy and organisation, as proteome is certainly broader than genome. Indeed, postranslational modifications, splicing isoforms of the same protein, specificity of tissue expressions, all together multiply and complicate input data. But the integration of genomic, transcriptomic and proteomic data with classical signalling activation information is probably indicated to meet the real complexity of a biological sample [29]. This kind of very ambitious work, increasing study in every field and the development of new techniques will certainly implement our knowledge on CRC and will guide scientists towards new possibility for efficient clinical diagnosis and maybe screening of CRC.
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