Virchows Arch. Abt. B Zellpath. 2, 18--23 (1969)
Der EinfluB DNS-abhiingiger RNS-Synthese auf Beginn und Verlauf der DNS-Reduplikation bei L-Zellen in der Gewebekultur B. LEDERER*, C. MXTTERMAYER**, P. KADEN u n d W . SANDRITTER*** Pathologisches Institut der Universit~t Innsbruck (Vorstand: Prof. Dr. A. PROBST) und Pathologisches Institut - - Ludwig Aschoff-Haus - - der Univcrsit~t Freiburg i. Br. (Direktor: Prof. Dr. W. S A ~ D R I T T E R ) Eingegangen am 15. Mai 1968
The Role o/DNA Dependent RNA-Synthesis on DNA Replication Summary. To obtain insight in the possible mechanisms initiating DNA synthesis, 0.5 ~g/ml actinomycin D, which suppresses about 95% of total RNA synthesis, was applied for different intervals (1.5, 3, 6 hours) to randomly growing L-cells. The effect of this drug was evaluated on randomly growing tissue-culture cells (L-cells) by means of 3H thymidine autoradiography and quantitative Feulgen cytophotometry. The mitotic index, the aH labelling index and the mean grain count/nucleus decreased during application of actinomycin D,, and the distribution of DNA synthesizing cells was changed when actinomycin D, was given during the G 1 phase the start of DNA synthesis was inhibited; when given during the S-phase of the mitotic cycle the rate of DNA synthesis was reduced. The experiments suggest a specific, temporally limited transcription during Gz phase preceding the initation of DNA synthesis.
Zusammen/assung. Nach Einwirkung yon 0,5 ~zg/ml Actinomycin D (11/2, 3 und 6 Std), welches die RNS-Synthese zu 95% blockiert, werden die Ver~ndernngen des Wachstums" yon Gewebekulturzellen (L-Zellen) simultan cytophotometrisch und autoradiographi~h nach 9 . d . . . . . . . . L . Pulsmarklerung mlt 3 H-Thymldln ~tudlert. Unter Actlnomycmelnwlrkung flndet man em Absinkcn des Mitoseindcx, des aH-Markierungsindex, der mittleren Silberkornzahl/Kern und ein veriindertes Verteilungsmuster der in S-Phase befindlichen Zellen. Diese~Ergebnisse erlauben den Schlult, dab Actinomycin D w~hrend der G1-Phase appliziert, das Einse~zen der DNS-Synthese verhindert. Die DNS-Synthescrate ist vermindert, wenn es w/ihrend der S-Phase auf die Zellen einwirkt. / Diese Experimente k5nnen als Beweis fiir eine zeitlich begrenzte Transkription w/ihrend der G1-Phase angesehen werden, welche der Einleitung der DNS-Synthese vorangehen muff. Einleitung Die V e r d o p p e l u n g d e r Desoxyribonucleins/~ure (DNS) w/ihrend d e r S - P h a s e des m i t o t i s c h e n Cyclus ist a n eine Reihe y o n Voraussetzungen gebunden, welche n u r nach v o r h e r g e h e n d e r k o d i e r t e r Bildung e n t s p r e c h e n d Ribonucleins~uren (messenger R N S , r i b o s o m a l e r R N S , t r a n s f e r R N S ) erffillt werden kSnnen. U n t e r * Ein Teil der Arbeiten wurde als Forschungsstipendiat der A. v. Humboldt-Stiftung am Pathologischen Institut der Universit~it Giel3en ausgefiihrt. ** Mit Unterstiitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft und der US National Institutes of Health (5-RO 5-TWO0 24-02). *** Mit Unterstiitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft und der Stiftung Volkswagenwerk.
Autoradiographie und Cytophotometrie der DNS:SyntheseauslSsung
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suchungen an teilungssynchronen S/iugetierzellen (MuELLER U. KAJIWARA, 1966) und a m Schleimpilz Physarum polycephalum (MITTERMAYER, BRAUST U. RUSCH, 1966) bieten Anhaltspunkte fiir eine sequentielle Genaktivierung w/~hrend des mitotischen Cyclus. I m R a h m e n unserer Experimente sollte durch Beeinflussung der Transkription mittels Actinomycin D geprfift werden, wann diese zur Initiation der D N S - S y n t h e s e erforderliche Genaktivierung erfolgt und in welchem Ausmal~ zur U n t e r h a l t u n g der D N S - S y n t h e s e cistronabh~ngige R N S gebildet werden mu$. I n einer vorhergegangenen Arbeit (MITTERMAYER, KADEN, TROMMERStL~USER U. SANDRITTER, 1968) wurde diese Fragestellung an einem System teilungssynchroner L-Zellen untersucht. Wir wissen aber von diesem System, welches auf chemische Synchronisierungsmittel verzichtet, da$ w/ihrend der G1-Phase eine geringe Desynchronisierung eintritt (MITTERMAYER, LEDERER, KADEN U. SANDRITTEI% 1968). Die A n w e n d u n g einer kombinierten cytophotometrischen-autoradiographischen Methode (LEDERER, 1967) an Einzelzellen einer asynchron wachsenden Zellkultur (randomly dividing culture) sollte diese StSrfaktoren ausschliel3efi u n d eine Uberprfifung der gewonnen D a t e n ermSglichen. Material und Methodik L-Zellen (M~usefibroblasten) werden in einem modifizierten Eaglesmedium auf 1/tngs l~albierten Objekttr/igern in Gewebekulturflaschen gezfichtet. Am 3. Tag der Subkultur, w/ihrend Zellen zu diesem Zeitpunkt wieder eine exponentielle Waehstumsphase erreicht haben, wird Actinomycin D (Merck, Sharp and Dohme, Rahway, N. J., USA) 1 in einer Endkonzentration von 0,5 [zg/ml fiir 11/2, 3 und 6 Std zugegeben. Nach eigenen frfiheren Untersuchungen ist diese Konzentration ausreichend, um 95 % der RNS-Synthese zu unterdrficken. Am Ende der Inkubationszeit werden die Objekttr~ger und eine unbehandelte Kontrolle den Gewebekulturflaschen entnommen, 10 min bei 37~ in einem aH-Thymidin-haltigen Gewebekulturmedium (2 ~zC/ml, spez. Act. 3000 mC/mM) inkubiert in 96% Xthanol fixiert und anschlieBend in folgender Weise nach Fdulgen gefKrbt: 10 min saure Hydrolyse mit n HC1 bei 60~ C, F/irbung 1 Std bei Zimmertemperatur in Schiffschem Reagens nach GRAUMA~N (1953) (Herstellung des Reagens mit Pararosanilin der Firma Merck, Darmstadt), 3mal 10 min Spfilung in SOz-Wasser (5 ml 10% Na2S205 A- 5 ml HC1 auf 100 ml Aqua dest.), kurze Spfilung in flieflendem Wasser, Entw~Lsserung in aufsteigender Alkoholreihe und Eindecken mit einem Medium mit angepalltem Brechungsindex (Cargille oil, nDzo ~ 1,54, Firma Cargille, Cedar Grove, N.J.). Die Feulgenf~rbung reduziert die quantitative Ausbeute an SilberkSrnern (Lx~o u. MAURER, 1965), doch kann dieser Verlust durch Wahl einer geeigneten Expositionszeit ausgeglichen werden. Die feulgengef/~rbten Pr~parate werden zur topographischen Markierung der Einzelzellen photographiert, die Position des Kreuztisches des Photomikroskopes wird auf einem zweiten Objekttr/iger festgehalten, dadurch wird das Auffinden des photographierten Objekttr~gerabschnittes zu einem sp~teren Zeitpunkt wesentlich erleichtert. Mit einem integrierenden Mikrodensitometer nach DEELEY (1955) (Firma Barr & Stroud Ltd., Glasgow, Scotland) wird bei einer Wellenl/inge von ~t 560 nm der relative DNS-Gehalt der untersuchten Zellen ermittelt. Anschliel~end werden mit einem Kodak AR 10 Strippingfilm von den Priiparaten Autoradiogramme hergestellt (Expositionszeit 3 Tage bei Zimmertemperatur). In Verbindung mit dem Autoradiogramm sind die gemessenen Einzelzellen sehr genau den einzelnen Phasen (G1, S und G2) des mitotisehen Cyclus zuzuordnen. Zusiitzlich sind anhand yon Silberkornz~hlungen in etwa Aufschlfisse fiber die Syntheseaktivit~t der einzelnen Zellen mSglich. Weitere Aussagen fiber das Wachstum der Gewebekulturen sind von der Bestimmung des aH-Markierungsindex und der Mitoserate zu erwarten. So wurden an Kollektiven yon jeweils 5000 Zellen Markierungsindex und Mitoserate bestimmt.
1 We thank Dr. CHARLESW. MNSHETTfor this gift. 2*
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B. LEDERER, C. MITTERMAYER,P. KADEN und W. SANDRITTER:
Ergebnisse Die Wirkung von 0,5 ~g/ml Actinomycin D auf das Wachstum der untersuchten Zellpopulationen innerhalb von 6 Std ist in Abb. 1 anhand der Ver~nderungen des Markierungsindex, der Mitoserate und der mittleren Silberkornzahl/ Kern dargestellt. Naeh 11/2 Std dauernder Einwirkung findet man nur geringfiigige Veri~nderungen dieser das Zellwachstum charakterisierenden Parameter, erst nach 3 Std nehmen Mitoserate (von 4 auf 2,5%), 3H-Markierungsindex (yon 40 auf 30%) und mittlere Silberkornzahl/Kern yon 30 auf 15 SK ab. 6 Std nach 0. . . . . .
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Abb. 1. /~nderung der Mitoserate (. . . . ), des Marklerungsindex (. . . . . ) und der mittleren Silberkornzahl/Zellkern ( ) nach unterschiedlicher Einwirkungsdauer von 0,5 ~g/ml Actinomycin D Actinomycingabe ist die Proliferation in der Gewebekultur nahezu zum Stillstand gekommen. Nut mehr wenige Zellen (weniger als 8% bauen 3H-Thymidin ein, der Mitoseindex liegt mit 2,6~ bei 5% des Ausgangswertes und die mittlere Silberkornzahl hat weiter (auf 12) abgenommen. Diese Befunde kSnnen unterschiedlich interpretiert werden, eine authentische Deutung der Ergebnisse ist jedoch bei Vergleich der eytophotometrischen mit den autoradiographischen MeBdaten an einer Zelle mSglich. Somit ergibt sich, wie in Abb. 2 dargestellt, folgende Verteilung der mit 3H-Thymidin-markierten Zellen fiber die verschiedenen Abschnitte der S-Phase. Das Verteilungsmuster der unbehandelten Kontrolle und nach 11/2 Std Actinomycinwirkung entspricht dem zu erwartenden Bild einer weitgehend ungestSrten exponentiellen Zellvermehrung mit einer gegen Ende der S-Phase gering erhShten DNS-Syntheserate. Die Zellen der 1. Hi~lfte (der S-Phase) sind gegenfiber denen der 2. H~lfte vermehrt, was aus der unterschiedlichen HShe der Siiulen der Histogramme zu ersehen ist. Nach 3 bzw. in st~rkerem Ausma6 nach 6 Std dauernder Actinomycineinwirkung ~ndern sich diese Proportionen grundlegend. Die Zellen, welche auf Grund ihres DNS-Gehaltes der 2. Hi~lfte der S-Phase zuzuordnen sind, erscheinen stark vermehrt, nach
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6 Std findet m a n in dem ersten Viertel der S-Phase keine Zellen mehr. Die Verschiebung dieser Zellkollektive ist noch deutlicher in der Tabelle ersichtlich: Nach 3 Std liegen nur mehr 36% und nach 6 Std dauernder Actinomycineinwirkung nur mehr 10% der Zellen in der 1. Hiilfte der S-Phase, gegenfiber ca. 60% bei der Kontrolle und nach 11/2 Std langer Einwirkungsdauer.
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Abb. 2. Verteilungsmuster yon L-Zellen fiber die S-Phase nach Einwirkung yon 0,5 ~zg/ml Actinomycin D. Die H6he der S~ulen entspricht der Anzahl der Zellen, die unterbrochene Linie entspricht dem mittleren DNS-Gehalt der in G1- und G2-Phase liegenden Zellen (34 bzw. 67 AE). A E DNS relativer feulgenphotometrisch bestimmter DNS-Gehalt Tabelle. A'nderung des Verteilungsmusters der in S-Phase be/indlichea Zelle~t nach unterschiedlicher Einwirkungsdauer (1,5--6 Std) yon 0,5 tzg/ml Aktinomycin D. Die rSmischen Zi/fer~t entsprechen de~t Abschnitten der S-Phase
Kontrolle 1,5 Std Actinomycin D 3 Std Actinomycin D 6 Std Actinomycin D
I
II
III
IV
29% 27% 19% --
35% 34% 17% 10%
24% 22% 37.5% 70%
12% 17% 26.5% 20%
Diskussion
Folgende D e u t u n g der Versuchsergebnisse erscheint uns zul~ssig: 1. Actinomycin D, in der von uns angewandten Dosis yon 0,5 ~g/ml, blockiert mit einer li~nger als 11/2 Std und weniger als 3 Std dauernden Latenzzeit das Einsetzen der D N S - Replikation. 2. Ahnliche Verhiiltnisse dfirften auch ffir das Eintreten der Zellen in die Mitose gelten, da der Mitoseindex ebenfalls stark absinkt. 3. Die in D N S - S y n t h e s e befindlichen Zellen setzen die DNS-Replikation fort, wenn auch, wie aus der verminderten aH-Thymidineinbaurate zu v e r m u t e n ist, mit geringerer Intensit~t. Die von uns in diesen Versuchen angewendete Actinomycinmenge unterdrfickt nach MITT]~RMAYERu. Mitarb. (1968) innerhalb von 9 0 m i n 9 5 - - 9 8 % der gesamten am aH-Uridineinbau gemessenen R N S - S y n t h e s e . Die wenige noch
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B. LEDERER, C. MITTERMAYER,P. KADEN und W. SA~TDRITTER:
mit 3H-Uridin markierte RNS gehSrt der 4 s-Region an, hat also biochemisch Sedimentationseigenschaften von Transfer-RNS. Ob es sich hierbei um neu synthetisierte t-RNS, oder nur, wie HEIDELBERGER (1956) vermutete, um eine unspezifische Anlagerung radioaktiven Uridins an vorhandene t-RNS handelt, ist nicht zu entscheiden. Somit ist die unter Actinomycin beobachtete Ver~nderung des Zellwachstums die Folge einer Blockierung der Bildung vom m-RNS und r-RNS. Die rasch nach Actinomycingabe beobachteten und in Abb. 1 und 2 dargestellten Ver~nderungen des Zellwachstums erlauben den Schlu~, da~ die zur DNS-Synthese erforderliche Enzymbildung erst kurz vor der S-Phase induziert wird. Zellen, die sich in der DNS-Replikation befinden, kSnnen jedoch die DNS-Synthese, wenn auch reduziert, fortsetzen, was mit einer entsprechenden Halbwertszeit dcr gebildeten Polymerasen, bzw. mit einer ausreichenden Template-Stability fiir dieselben zu erkl~ren ware. Experimente mit Puromycin (MITTERMAYER, unpublizierte Ergebnisse), welches die Proteinsynthese auf ribosomalem Niveau stoppt und die DNS-Synthese rasch unterdriickt, unterstiitzen letztere Annahme. Da nach l~ngercr Actinomycineinwirkung die DNSSyntheserate der Einzelzelle signifikant abnimmt (gemessen an der mittleren Silberkornzahl/Zelle) ist zu erwarten, da~ zur vollen Fortffihrung der DNSReplikation aueh noch w~hrend der S-Phase die Neubildung von cistronabh~ngiger RNS erforderlich ist. Hierfiir kSnnten Bcobachtungen sprechen, dab eine, wenn auch sehr geringe Anzahl von Zellen unter Actinomycin w~hrend der S-Phase den Einbau von 3H-Thymidin einstellt. Die eingangs festgestellten Ver~nderungen im Verteilungsmuster der DNS-synthetisierenden Zellen ist somit Ausdruck zweier Parameter : 1. Die Zahl der in die DNS-Synthese eintretenden Zellen nimmt ab und erreicht schhel31ich einen Nullpunkt, womit in erster Linie die Abnahme der Zellzahl in der 1. Halfte der S-Phase zu erkl/~ren ist. 2. Auf Grund eines 1/ingeren Verweilens in der DNS-Synthesephase bei herabgesetzter DNS-Syntheserate vermehrt sich die Zahl der Zellen, die sich in der 2. H/ilfte der S-Phase befinden. Die Untersuchungen an unbeeinflu$t wachsenden Einzelzellen einer asynchron wachsenden Gewebekultur bestiitigen somit die an einem System teilungssynchroner Zellen gewonnenen Ergebnisse. Sie erlauben die Annahme, da$ w/~hrend des mitotischen Cyclus eine sequentielle Genaktivierung stattfindet, welche den geordneten Ablauf makromolekularer Syntheseleistungen sicherstellt. Literatur ])EELEu E.M.: An integrating mierodensitometer for biological cells. J. Sci. Instr. 32, 263--267 (1965). GRAUMANN,W.: Zur Standardisierung des Schiffschen Reagens. Z. wiss. Mikro. 61, 225~226 (1953). HEIDELBERGER,C., E. HARBERS, C. LEIBMANN, Y. TAGAKI, and V. R. POTTER: Specific incorporation of adenosine-5'-phosphate-32P into ribonucleie acid in rat liver homogenates. Biochem. biophys. Acta (Amst.) 20, 445~46 (1956). LA~G, W., u. W. MAURER: Zur Verwendbarkeit feulgengef~rbter Schnitte fiir quantitative Autoradiographie mit markiertem Thymidin. Exp. Cell Res. 39, 1--9 (1965).
Autoradiographie und Cytophotometrie der DNS-SyntheseauslSsung
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of mitosis in physarum polycephalum. Exp. Cell Res. 38, 33--41 (1965). P. KADEN, U. TROMMERSIt:4USER,and W. SANDRITTER: Initiation of DNA synthesis in a system of synchronized L-cells: Effect of actinomycinD. Histochemie 14, 113--122 (1968). - - B. LEDERER, P. KADEN U. W. SANDRITTER: Untersuehungen an teilungssynehronen Zellen: II. DNS-Synthese. Histochemie 12, 75--82 (1968). MUELLER, G. C., and K. KAJIWARA: Regulatory steps in the replication of mammalian cell nuclei. In: Developmental and metabolic control mechanisms and neoplasia, p. 4 5 2 ~ 7 3 . Baltimore: Williams & Wilkins Co. 1965. -
-
Dr. B. LEDERER Pathologisches Institut der Universit~t Innsbruck Dr. C. MITTERMAYER, Prof. Dr. W. SA:NDRITTER P. KADEN Pathol. Institut der Univ. 7800 Freiburg i. Br.