Chromosoma (Berl.) 26, 41--75 (1969)
Die Entstehung muhipler Oocytennukleolen aus akzessorischen DNS-K(irpern bei Gryllus domestictts* W~x~nn KvNz Zoologisches Institut der Universit~t Mfinster i. Westf. Eingegangen am 15. Juli/10. September 1968
The Origin o/ Multiple Oocyte Nueleoli /rom Accessory DNA Bodies in Gryllus domesticus Abstract. The early stages of female and male germ cells have been investigated in Feulgen squash preparations, in unfixed state with phase contrast optics and in the electron microscope. The DNA axes of the ring-shaped multiple nucleoli in the growing oocytes of Gryllus arise from compact DNA bodies which are found in oogonia of young larvae and in ooeytes prior to the growth period. The nuclei of the early oogonia contain several little DNA bodies whereas young ooeytes at leptotene, zygotene and pachytene have only one body which is bigger than at earlier stages (Fig. 3). At metaphase and anaphase during oogonial mitosis the DNA body has a filamentous shape distinguishable from the compact chromosomes (Fig. 5). In oogonia as well as at leptotene and zygotene stages, nucleoli are produced in the peripheral, uncoiled parts of each DNA body whereas the compact interior is completely free of nucleolar material (Figs. 4, 12). At pachytene, the whole DNA body begins to despiralize, and single DNA strands are released into the nucleoplasm. These strands form hundreds of multiple nucleoli which finally are dispersed in the germinal vesicle (Fig. 11). - - Incorporation studies with radioactive thymidine have shown that DNA synthesis in the DNA body is not synchronous with the S-phase of the chromosomes (Fig. 7). - - The DNA body is an own formation distinct from the sex chromosomes (in contrast to the opinion of SOT~LO and WnW~STEI~, 1964). Although the positive heteropycnotic X-chromosome in the germ cells of the male cricket is very similar to the DNA body of the female (Fig. 8), there is no regular contact between sex chromosome and nucleolus neither in spermatogonia nor in spermatoeytes (Figs. 9, 14). In all probability, the site of the nueleolar organizer is autosomal. - - It is suggested that the amplification of the nucleolar genes in Gryllus oocytes results in an accumulation of ribosomal t~NA for use during the early cleavage stages of the embryo (Zusammenfassung see p. 72).
I. E i n l e i t u n g D e r 0 o c y t e n k e r n v o n Gryllus domesticus e n t h / t l t m e h r e r e h u n d e r t r i n g f S r m i g e N u k l e o l e n , die d e n m u l t i p l e n N u k l e o l e n in der w a c h s e n d e n E i z e l l e der A m p h i b i e n g l e i c h e n u n d w a h r s c h e i n l i c h a u c h eine D N S A c h s e besitzen. A u f d e r S u c h e n a c h der E n t s t e h u n g d e r m u l t i p l e n N u k l e o l e n u n d i h r e r D N S - A n l a g e n w a r in d e n ] u n g e n 0 o c y t e n k e r n e n * Mit Unterstiitzung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft.
42
W. KuNz:
ein Feulgen-positiver K6rper gefunden worden, dem die Nukleolarsubstanz peripher anhaftet (Kv~z, 1967). Dieser DNS-K6rper ist h6ehstwahrseheinlieh identiseh mit dem bereits 1909 yon BUCH~U entdeckten ,,akzessorisehen K6rper" in den Ooeyten yon Gryllus, der in Anlehnung an die Verh~ltnisse in der Spermatogenese fiir ein heteroehromatisehes Chromosomenpaar gehalten wurde. 0bwohl bereits J6uG~S~r (I913) dieser Interpretation widerspricht und den K6rper als Nukleolus bezeiehnet, hat sieh BUCg~ERS Ansehauung noeh bis heute erhalten (SoT~LO und W~WTST~I~, 1964). Da sieh der akzessorisehe DNS-K6rper des Gryllus-Weibehens jedoeh im Paehytgn vollkommen in einzelne Fasern anfzuteilen beginnt, kann es sieh dabei k a u m um ein Chromosomenpaar handeln. Da diese Fasern darfiber hinaus mit Nukleolen besetzt sind, spricht vielmehr manehes dafiir, den K6rper als ein Aggregat aus multiplen Nukleolenbildungsorten anzusprechen, die auf friihen Oocytenstadien noch stark zusammengeballt sind. Auf diese mSgliehe Interpretation des DNS-K6rpers wurde in einer vorangegangenen Arbeit bereits hingewiesen (KuNz, 1. e.). Die enge Beziehung der Nukleolen znm Feulgen-positiven K6rper in der Gryllus-Ooeyte ist - - unabh/tngig davon - - aueh yon H ~ I N o ~ und HALZKA (1967) besehrieben worden. I n Anlehnung an die Deutung des DNS-K6rpers yon Tipula dureh LI~A-D~-FA~IA (1962) und LIMADE-FAulA und MOSES (1966) haben Hm~ONE~ und HALK~A jedoeh auch die DNS des akzessorischen K6rpers von Gryllu8 als Stoffweehsel-DNS (,,metabolic DNA") bezeiehnet, d.h. als eine DNS, die nieht wie die ehromosomale DNS stabiler Informationsspeieher ist, sondern die Aufgabe haben soll, Information yon den Chromosomen hinweg an andere Orte der Zelle zu tragen. Die Einzelteile des DNS-K6rpers sollen naeh dessen Zerfall im Diplotgn ins Cytoplasma wandern und dort als PrimerZentren ftir die l~NS-Synthese dienen. Bei Gryllus l~Bt sieh die Nuk l e o l e n - D N S - - i r a Gegensatz dazu - - b i s zum Absehlug des Eiwaehstums im Ooeytenkern nachweisen. Ihre genetische Aktivit~t besteht in der Synthese yon RNS und unterseheidet sieh daher nieht von der der normalen Chromosomen. Daher soll die Nukleolen-DNS yon Gryllus im folgenden nieht ,,metabolisch", sondern ,,akzessoriseh" genannt werden, damit zum Ausdruek gebraeht wh-d, dab es sieh zwar um eine zusgtzlieh zu den Chromosomen vorliegende DNS handelt, die sieh aber nieht durch ehl abweichendes Stoffwechselverhalten auszeiehnet. Die vorliegenden Untersuehungen sollten kl~ren, wie welt sieh die mnltiplen Nukleolen und ihre DNS-Anlagen in die Vor- und Fr/ihstadien der 0ogenese zurtiekverfolgen lassen, welehe Beziehungen zu den Chromosomen vorliegen und weleher Zusammenhang zwisehen den Nukleolen und dem DNS-K6rper auf versehiedenen Entwieklungsstufen der Oogonien und Prim~roocyten besteht.
Entstehung multipler 0ocytennukleolen aus DNS-KSrpern bei Gryllus
43
II. ~Iethoden
Vitatprdiparation. Die Prgparation der Ovarien und Hoden erfolgte in saurer InsektenringerlSsung (5,00 g NaC1; 0,42 g KC1; 0,25 g CaC12 ad 1000 ml Wasser). M6glichst kleine Teile der Ovarien bzw. Hoden wurden auf einen Objekttr~ger fibertragen und hier unter sorgf~ltiger Vermeidung yon Quetschungen und Zerrungen mit einer Iridektomieschere weiter zerschnitten. Die weitgehende Zerteilung bringt den Vorteil, dab beim Absaugen der RingerlSsung nach Auflage des Deckglases viele Kerne an den Sehni~tstellen aus dem Gewebe herausflie~en, ohne dabei zu sehr verformt zu werden. W~ihrend des Absaugens mit Filterpapierstreifen besteht die MSglichkeit, zur n~heren Analyse bestimmter Vitalstrukturen nacheinander je einen Tropfen Neutralformol (3%) und Karmin-Essigs~ure unter das Deckglas zu ziehen, wodurch insbesondere die DNS-haltigen Zellbestandteile zu lokalisieren sind. Bei der Lebendpraparation ist besonders wichtig, dal~ die Fliissigkeit sehr langsam abgesaugt wird, da andernfalls der Druck des Deckglases zu rasch auf das Gewebe wirkt und zersetzende Fermente frei werden, die die Kernstrukturen in kurzer Zeit irreversibel zerstSren. Feulgenfiirbung. Die Feulgen-Quetschpriiparate wurden nach einem vereinfachten Schnellverfahren hergestelIt, welches kr~ftig gef~rbte Pr~parate liefert, die allerdings nur yon geringer I-Ialtbarkei~ sind. Nach Fixierung in AlkoholEisessig (3 : 1), Hydrolyse in nttC1 (8 rain; 60~C) und einstiindiger F~rbung in parafuchsinschwefliger S~ure wurden die Gewebe sofort in einen Tropfen 45% Essigsgure auf den Objekttr~ger iibertragen und dort durch Auflage eines Deckglases gequetscht. Ele/ctronenmi/cros/copie. Nach mSglichst schleuniger Preparation in neutralcr Ringerl6sung (mit Di~thylna~riumbarbiturat gepuffert) wurden die Ovarien in Osmiums~ure nach t~u und.K~LL~ERG~n /1958),,f,ixiert.u,nd iiber.Propylenoxid in Epon (nach LusT) eingebettet. Die Kontrastierung der Schnitte erfolgte 2~ h in ges~ttigter UranylacetatlSsung und zus~tzlich 10 rain mit Bleicitrat.
III. DNS-Kiirper u n d Nukleolen in den 0ogonien Die Oogonien v o n Gryllus domesticus, die i n gr6Berer Anzahl n u r in den Germarien der L a r v e n zu l i n d e n sind, unterscheiden sich v o n den b e n a c h b a r t liegenden pr~tsnmptiven Follikelzellen des gleichen Germ a r i u m a b s c h n i t t e s n i c h t n u r durch die beachtliche Gr6Be ihres Zellkerns (Abb. 1). I n Quetschpr~paraten a n fiberlebendem Material fgllt als weiteres Merkmal die A u s b i l d u n g des N n k l e o l a r a p p a r a t e s auf, a n dem die Zellen der K e i m b a h n y o n den mesodermalen Follikelzellen unterschieden werden k 6 n n e n . Wi~hrend die K e r n e der Follikelzellen in O b e r e i n s t i m m u n g m i t den K e r n e n anderer somatischer Gewebe n u t einen - - gelegentlich paarweise v o r h a n d e n e n - - Nukleolus e n t h a l t e n (Abb. 2a), k o m m e n die Nukleolen i n den Oogonien stets in Mehrzahl vor (Abb. 3 b u n d d). Meist enthi~lt ein Oogonienkern 6 10 verschieden groBe Nnkleolen. I m Gegensatz zu den somatischen Nukleolen, die i m unfixierten L e b e n d p r ~ p a r a t phasenoptisch einheitLich aussehen, bestehen die gr6l~eren Oogoniennukleolen aus zwei v o n e i n a n d e r gesonderten K o m p o n e n t e n , die i m P h a s e n k o n t r a s t deutlich u n t e r s c h i e d e n werden k 6 n n e n : eine optisch dichte R i n d e n s c h i c h t umhfillt eine mehr licht-
44
W. KTgNZ:
Abb. 1. a Kurzer Abschnitt der Ovariole einer jungen Larve von Gryllus domesticus. Die yon Follikelzellen umgebene Oogonie fgJlt durch ihre besondere Gr6Be und durch mehrere, z.T. deutlich ringf6rmige Nukleolen (~) auf. Demgegeniiber enthalten die Follikelzellkerne in der Regel nur einen einzigen Nukleolus. Lebendprgparat, Phasenkontras~. b Feulgen-QuetschprS~parat yon einer Oogonie und einem Leptotgmstadium, darunter drei Follikelzellkerne; Oogonie mit nur einem, Leptotgm mit zwei deutlichen DNS-KSrpern (-~). Das ,,Chromatin" des Leptotgms ist gegeniiber dem der interphasischen Oogonie sehr gleichmi~Big angefg~rbt
Abb. 2a u. b. Lebendpr~parate yon drei Follikelzellen einer weiblichen Larve (a) und einer Zelle aus dem Unterschlundganglion einer m~tnnlichen, sehr jungen Grillenlarve (b). Die Kerne somatischer Zellen enthalten meist nur einen, seltener auch zwei Nukleolen (s. S. 57). Phasenkontrast durchlgssige, diffuse I n n e n z o n e . Beim Quetschen der iiberlebenden Ovarien u n t e r d e m Deckglas werden die Oogoniennukleolen abgeplattet, wobei der schalenf6rmige R i n d e n a n t e i l teilweise zu einem Ring v e r f o r m t wird, der d e n zentral gelegenen, diffusen I n n e n b e z i r k umschlieBt (Abb. 3 b u n d d). Die Nukleolen liegen im peripheren Bereicb der Oogonienkerne u n d h a f t e n u n m i t t e l b a r a n der K e r n m e m b r a n (Abb. 3 d).
Entstehung multipler Oocytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
45
Nach Durchflul3 yon Karmin-Essigs/~ure unter dem Deekglas des Lebend-Quetsehpraparats verhalten sich die beiden Komponenten der Oogoniennukleolen verschieden. Die Rindenschicht quillt stark auf und entzieht sieh dadurch der weiteren Beobachtung; der Innenteil beh~tlt seine Form und reagiert intensiv Karmin-positiv. Din'oh eine kurze Vorbehandlung mit einem Tropfen Neutralformol 1/igt sich die Quellung der Rindenzone verhindern, so dal3 es anschliegend m6glieh wird, aueh ihr Verhalten gegeniiber Karmin-Essigsaure zu beurteilen. Die Nukleolenrinde f/trbt sich naeh diesem Verfahren deutlieh sehw~cher an als der Zentralteil, ein Merkmal, das naeh vorausgegangener Hydrolyse mit n ItC1 noeh stgrker hervortritt. Gegenfiber der Feulgenfgrbung reagieren die beiden Komponenten der Oogoniennukleolen ebenfMls nntersehiedlieh. Wghrend die Rinde dutch die Hydrolyse fast vollst/~ndig aus dem Prgparat herausgelSst wird, bleibt der Innenbezirk der Nukleolen erhalten und f~rbt sieh intensiv rotviolett an. Die starke Farbreaktion des Innenteils der Nukleolen lgl3t auf hohen DNS-Gehalt sehliegen, w~hrend die peripheren Nukleolenbestandteile fiberwiegend aus Proteinen und IgNS bestehen, wie sieh aus histoehemisehen Farbreaktionen mit Bromphenolblau und Azur B m]t parallel durehgeffihrter RNase-Kontrolle ergeben hat. Die DNS-haltigen Nukleolenzentren sind allerdings in vielen F~llen zu klein, um sieh vom gleiehfalls Feulgen-positiven Chromatin der Interphaseehromosomen eindeutig abzuheben. Doch in einigen Oogonienkernen ist die Zusammenballung der Nukleolensubstanz samt ihrer zentral gelegehen DNS-Anteile ausreiehend stark, so dag im Fenlgen- Quetsehpr/~parat eine oder mehrere groge DNS-Kugeln neben den Interphaseehromosomen auffallen (Abb. 3 a und e). Diese liegen erwartungsgem~B wie die Nukleolen des Phasenkontrast-Lebendpr/~parats vorwiegend peripher an der Kernmembran, nieht selten in einer ins Cytoplasma ausgebuehteten Kerntasehe. I m elektronenmikroskopisehen Bild bestehen die Oogoniennukleolen aus einem fibrill/s Innenraum, der dem DNS-haltigen, diffusen Nukleolenzentrum entsprieht, und peripher gelegenen, granul/~r aufgebauten Kugeln, die den Innenraum umsehliegen (Abb. 4). Diese rund um die Fibrillenmasse angeordneten Kugeln sind die im Lebendpr~parat bei positivem Phasenkontrast stark kontrastreiehe Nukleolenrinde, die Feulgen-negativ reagiert und I%NS enth~it. Nut diese peripheren Anteile der Oogoniennukleolen haben die typisehe nukleol/ire Ultrastruktur und gleiehen im Feinbau den somatisehen Nukleolen, wohingegen der DNShaltige, fibrill/s Innenraum ein besonderer Nukleolenbestandteil der Keimbahn ist, der in somatisehen Geweben fehlt. Wghrend der mitotisehen Teilungsstadien der Oogonienkerne loekern sieh die Nukleolen in zunehmendem Mage auf und fallen in einzelne
46
W . ~K~JNz :
A b b . 3 a--k
Entstehung multipler Ooeytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
47
Abb. 6. Ultrastruktur des DNS-K6rpers mit peripher gelegenen Nukleolen in einer interphasisehen 0ogonie; oben links die Kernmembran. Der /)NS-K6rper ist aus feinen Fibrillen aufgebaut, wi~hrend die Nukleolen einen granul~ren Feinbau besitzen Teilst/ieke auseinander, die schliel31ieh in der M e t a p h a s e n i e h t m e h r s i c h t b a r sind. Diese Auflockerung betrifft n i c h t n u r - - wie zu e r w a r t e n - die R N S - P r o t e i n a n t e i l e der Oogotliennukleolen, sondern auff/~lligerweise auch die D N S - K o m p o n e n t e . Die in der I n t e r p h a s e i m Feulgenpr~tparat meist sehr augenf/tlligen, k o m p a k t e n N n k l e o l e n - D N S - K u g e l n (Abb. 5 a) verlieren m e h r u n d m e h r an Deutlichkeit, je weiter die Chromosomenk o n t r a k t i o n v o n d e r P r o p h a s e zur M e t a p h a s e v o r a n s c h r e i t e t (Abb. 5 b bis e). Das liegt a m SpirMisierungsmodus der N u k l e o l e n - D N S , der d e m K o n t r a k t i o n s v e r h a l t e n der Mitosechromosomen entgegengesetzt ist. I n d e m MaBe wie sich die Pro- a n d M e t a p h a s e e h r o m o s o m e n verdiehten, lockert sich die N u k l e o l e n - D N S in feine F~tden auf, die d a n n in einem oder m e h r e r e n losen VerbSmden neben den M e t a p h a s e c h r o m o s o m e n liegen (Abb. 6, oben). Diese Auflockerung ist unterschiedlich stark. I n m a n e h e n K e r n e n erreieht die Auffaserung fast die Grenze der s i e h t b a r e n Abb. 3a--k. Feulgen-gefgrbte Quetschpr~parate und entsprechende Vitalprgpar~te der Oogonien (a d) und jungen Prim~roocyten (e--k). Die gef~rbten Zellkerne (a, c, e, g, i) zeigen die DNS-KSrper, wg~hrend in den (jeweils darunter angeordneten) Lebendkernen die Nukleolarsubstanz deutlieh zu erkennen ist, die den DNS-Kugeln augen anfsitz~. Die DNS-K6rper liegen in einigen F~llen direkt der Kernmembran an (-~). e und f friihes Leptotgn; g und h Lepto-Zygotgm; i und k Zygotgn mit beginnender Ausspulung der Lampenbiirstenschleifen
48
W. KuNz:
Abb. 5a--f. In der Oogonienmitose entspiralisiert sieh der DNS-KSrper (-+) in zunehmendem MaBe und zerfiillt in einzelne Fasern, die in der Anaphase der Teilungsspindel anliegen (f). Feulgen-Quetsehprgparate. a Interphase; b Prophase, e und d Prometaphase; e Metaphase, die beiden 15~ngsten Chromosomen sind die X-Chromosomen (X); f Anaphase Feulgen-Anf~trbbarkeit (Abb. 6), in selteneren F~llen bleibt z u m i n d e s t ein Teil der N u k l e o l e n - D N S ~hnlieh k o m p a k t wie in der I n t e r p h a s e (Abb. 5 e). I n der a n s e h l i e g e n d e n A n a p h a s e der Oogonienteilung ist das loekere F a d e n w e r k der N u k l e o l e n - D N S i m m e r noeh s i e h t b a r u n d liegt n e b e n der Teilungsspindel zwischen den a u s e i n a n d e r r f i e k e n d e n Chromosomensgtzen (Abb. 5f). Der darauffolgende EinsehluB dieses D N S - M a t e r i a l s in die T e l o p h a s e k e r n e k o n n t e ~fieht d i r e k t b e o b a e h t e t w e r d e n ; es ist aber
Entstehung multipler Oocytennukleolen aus DNS-KSrpern bei Gryllus
49
Abb. 6. Oben: Oogonien-Promet~phase mit 20Autosomen (1--20) und 2 XChromosomen (X); inmitten der s~ark entspiralisierte DNS-KSrper (-->), der nicht mit den X-Chromosomen zusammenh/~ngt. Feulgen-Quetsehpr~parat. F Follikelzellkern. - - Un~en: Karyo~yp yon Gryllus domesticus, ebenfalls von einer Oogonienmetaphase; die beiden lgngsten Chromosomen sind die X-Chromosomen. OreeinEssigs~ure a n z u n e h m e n , dab die N n k l e o l e n - D N S nicht i m Cytoplasma liegenbleibt, sondern zu den Chromosomen a n die Spindelpole w a n d e r t ; d e n n die interphasisehen Oogonienkerne u n d in noeh deutlieherem Mage die sp~teren L e p t o t g n s t a d i e n e n t h a l t e n wieder k o m p a k t e D N S - K 6 r p e r m i t peripher aufgelagerter Nukleolarsubstanz. Zwar ist die N u k l e o l e n - D N S der Metaphase viel u n d e u t l i e h e r als in der I n t e r p h a s e , doeh bietet sich in der Metaphase die M6gliehkeit, die Beziehungen zu den Chromosomen zu u n t e r s n e h e n . Die y o n BUCg~ER 4 Chromosoma(Berl.) Bd. 26
50
W. KuNz :
(1909) u n d SOT]~LO u n d WETTSTEIN (1964) v e r t r e t e n e Auffassung, w o n a c h die N u k l e o l e n - D N S - K S r p e r m i t den beiden X - C h r o m o s o m e n i d e n t i s c h sein sollen, k a n n n i c h t zutreffen; d e n n a u g e r d e r NukleolenD N S liegen noch alle 22 C h r o m o s o m e n des d i p l o i d e n Satzes vor (Abb. 6). Die N u k l e o l e n - D N S - K S r p e r sind n i c h t einmal Anh/ingsel der X-Chromosomen, die als die b e i d e n li~ngsten C h r o m o s o m e n des Satzes als solche zu e r k e n n e n sind (Abb. 5e u n d 6), s o n d e r n liegen an a n d e r e r Stelle des Zellkerns u n d sind d e m n a c h zus/~tzlich z u m d i p l o i d e n Chromosomenb e s t a n d a u f t r e t e n d e , akzessorische D N S - E l e m e n t e . Es ist nicht leicht, den Terminus ,,akzessorische DNS" genau zu definieren. Da keine Ubereinkunft besteht, auf welche Zellinien bzw. Gewebe der ,,artspezifische DNS-Gehalt" bezogen wird und auch die Spermien variierende DNSMengen enthalten k6nnen (z.B. Cyclops, BE]~RMAN~, 1966), kann unter der akzessorischen DNS night einfach eine DNS verstanden werden, die zusitzlich zu einem Normalwert auftritt; denn dann miiBte dieser Normalwert zungchst einmal definiert werden. Andererseits fehlt eine klare Abgrenzung des Begriffs ,,Chromosom", so dab auch der Terminus ,,extrachromosomale DNS" unpr~zise ist. Daher wird eine Definition vorgeschlagen, die ohne die eben genannten Bezeichnungen auskon'lmt: ,,Akzessorische DNS" ist eine DNS, die zusgtzlich zu einem konstanten Grundbestand in unterschiedlicher Menge in bestimmten Zellfolgen vorkommt und deren variierendes Quantum ohne EinfluB auf das Gengleichgewicht ist. Das V o r k o m m e n der akzessorischen N u k l e o l e n - D N S von Gryllus ist auf die K e i m b a h n b e s c h r g n k t ; somatische Zellen e n t h a l t e n in i h r e n N u k l e o l e n keine D N S - A n t e i l e v e r g l e i c h b a r e n A u s m a g e s . Es b l e i b t n u n zu prfifen, ob die N u k l e o l e n - D N S - K S r p e r bleibende B e s t a n d t e i l e der K e i m b a h n , also K e i m b a h n k S r p e r , sind oder ob sie n u r in b e s t i m m t e n E n t w i c k l u n g s s t a d i e n der K e i m z e l l e n auftreten. Der erste F a l l einer , , K e i m b a h n - D N S " ist beispielsweise bei Ascaris, Cyclops u n d bei Sciariden u n d C e c i d o m y i i d e n v e r w i r k l i c h t (BovE~I, 1899; BEERMAN~, 1966; t~I]~FFEL u n d CnousE, 1966; GEYEn-DuszY~SKA, 1961, 1966), wo die in der K e i m b a h n zusi~tzlich v o r h a n d e n e , akzessorische D N S in F o r m y o n fiberzi~hligen C h r o m o s o m e n bzw. C h r o m o s o m e n a b s c b n i ~ t e n vorliegt. Diese w e r d e n k o n t i n u i e r l i c h fiber die ganze K e i m b a h n y o n Zelle zu Zelle weitergegeben u n d in jeder I n t e r p h a s e redupliziert, gelangen jedoch n i c h t in die Zellen des Somas. D e r zweite m6gliche F a l l w~re der einer , , E x t r a - D N S " , d.h. einer ebenfalls zus~tzlich a u f t r e t e n d e n D N S , die a b e r in j e d e m I n d i v i d u a l z y k l u s y o n n e u e m gebildet wird. Diese N e u b i l d u n g ist eine E x t r a s y n these, w o r u n t e r m a n eine D N S - V e r m e h r u n g v e r s t e h t , y o n d e r n u r Teile des Genoms betroffen sind. E x t r a s y n t h e s e n k o m m e n zur n o r m a l e n R e d n p l i k a t i o n hinzu u n d erhShen den i m K e r n e n t h a l t e n e n D N S B e s t a n d . Beispie]e ffir E x t r a - D N S finden sieh in der Oogenese y o n Dytiscus (URBA~Iu n d RLISso-CAIA, 1964) u n d Tipula (BAYREUTHER, 1956).
Entstehung multipler Oocyt.ennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
51
U m zu entscheiden, ob die Nukleolen-DNS-KSrper von Gryllus" Keimbahnk6rper oder Extra-DNS-K6rper sind, wurde der Einbau von SH-Thymidin in die DNS-KSrper autoradiographisch nntersucht. Nur die Ovarien seh~ junger Grillen enthalten noch eine gentigende Anzahl yon Oogonien; bei glteren Larven ~berwiegen bereits die Prim/troocyten. Daher mul3te die Injektion der radioaktiven DNS-Vorstufen bereits an den Jnngtieren des zweiten Larvalstadiums vorgenommen werden (2,5 ~C pro Tier; 22 100 mC/mM), um sicherzugehen, eventuell vorhandene Entstehungs- oder Vermehrnngssehritte der Nukleolen-DNS noeh reehtzeitig zu erfassen. Bei der Auswertung der DNS-Autoradiogramme zeigte sigh, da6 ein Teil des Oogonienkerne gleichm/i6ig gesehw~rzt war. Das sind die Stadien der Chromosomenreduplikation. Ob sich die Nukleolen-DNS zur gleichen Zeit verdoppelt, kann nicht mit Sieherheit entschieden werden, da die DNS-KSrper der Oogonien zu klein sind und daher im Autoradiogramm iiberstrahlt werden. Jedoeh treten auch Oogonienkerne auf, bei denen allein die Nukleolen-DNS-KSrper, nieht die Chromosomen markiert sind (Abb. 7e und f). Solehe F~lle geben allerdings noeh keinen eindeutigen Hinweis auf das Vorkommen yon Extrasynthesen im DNS=KSrper, da sit aueh als asynehrone Reduplikationen gedeutet werden k6nnen. Mit der autoradiographisehen Methode allein besteht keine MSgliehkeit, zwisehen diesen Alternativen zu entseheiden. Die besondere Sehwierigkeit, Extrasynthesen festzustellen, nm daran zu erkennen, ob die Nukleolen-DNS-KSrper yon Gryllus als Keimbahnk6rper oder Extra-DNS-K6rper einzustufen sind, liegt darin begrtindet, dab die akzessorisehe DNS in den Oogonienanaphasen mit groger Wahrseheinliehkeit auf die Sellwesterkerne aufgeteflt wird. Sie muB daher in der darauffolgenden Interphase aueh wieder redupliziert werden, so dab DNS-Synthesenachweise mittels Pulsmarkierung im Autoradiogramm von vornherein keinen eindeutigen Anfsehlu6 geben k6nnen. Die Situation ist bei Dytiacus und Tipula deshalb klarer, weil der akzessorisehe DNS-K6rper bei meroistisehen Insekten in den DifferentJalmitosen nieht geteilt wird, sondern jeweils nut an einen der beiden Spindelpole wandert. Daher ist bei diesen Arten keine Reduplikation des DNS-K6rpers nach den Mitosen erforderlieh, und der Einbau radioaktiven Thymidins (URsA>-I und RtrSso-CAIA, 1964; LIMA-DEFARIA, 1962) ist sehr wahrscheinlieh ein Ausdruck fiir Extrasynthesen, dureh die der DNS-Bestand des Zellkerns vermehrt wird, wofiir aueh der waehsende Umfang des DNS-K6rpers sprieht. Sollte die Nukleolen-DNS von G'ryllus ebenfalls eine Extra-DNS sein wie bei Dytiscus und Tipula, so miigte sie in fr/ihen Keimbahnstadien fehlen, etwa in den Kernen junger Oogonien, die noeh mehrere Zellteilungen zu durehlanfen haben, bevor sie in die Meiose eintreten. 4*
52
W. K v ~ z :
Abb. 7 a ~ k . 3H-Thymidineinbau in einen Oogonienkern (e und f) und in Oocytenkerne verschiedener Altersstadien (a--d, g--k). Die oberen Bilder zeigen die Zellkerne in der Ebene des Pr~parats (I~Nase-Behandlung, Gallocyaninf~rbung), in den d~runter angeordneten Bildern ist jeweils auf die SilberkSrner focussiert women, a und b Chromosomen markiert, DNS-KOrper inaktiv (Zygo-Pachyt~n, 62 h Inkubationszeit). c und d Chromosomen und DNS-K6133er markiert (ZygoPachyt~n, 62 h Inkubation). e - k Nur die DNS-K6rper sind markiert, e und f Oogonie mit mehreren DNS-K6rpern (4 h Inkubation), g und h Lepto-Zygot/~n (20 h Inkubation), i und k Pachyt/in (62 h Inkubation)
Entstehung multipler Oocy~ennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
53
Solche Stadien finder man in jungen Grillenlarven, wenige Tage nachdem sie aus den Eiern geschlfipft sind. In Feulgen-Quetsehpr/~paraten der Ovarien dieser Jungtiere scheint es in der Tat so, als enthielten die Oogonienkerne noeh keine Nukleolen-DNS, da keine deutlichen Feulgenpositiven K6rper neben den Chromosomen zu finden sind. Das besagt jedoch nicht viel; denn auch bei/ilteren Tieren sh~d die Nukleolen-DNSK6rper oft sehr klein und kSnnen nieht immer sieher als solehe erkannt werden, da sie AnlaB zur Verweehslung mit heterochromatischen Chromosomenabschnitten geben. Mit der Feulgenf/irbung 1/igt sieh also ebensowenig etwas Sicheres fiber die Entstehung der DNS-K6rper aussagen vie mit der autoradiographischen Methode, doch hat sich beim Vergleich der Larven verschiedenen Alters immerhin herausgestellt, dab die grogen, eindeutig identifizierbaren Nukleolen-DNS-K6rper (Abb. 3a und c; S. 46) erst in den ~lteren Oogonien kurz vor der meiotischen Prophase auftreten und in friihen Oogonienstadien noch nieht vorhanden sind. Trotzdem enthalten aueh die jungen Oogonien des ersten Larvalstadiums bereits mehrere Nukleolen in ihren Zellkernen, die im Elektronenmikroskop erkennbare, fgdige Chromatinzentren besitzen. Daraus geht hervor, dag die Gesamtheit der Nukleolen-DNS nieht erst in der pr/~meiotischen Interphase gebildet wird, wie HEIccosE~ und I~ALKKA (1967) vermuten, sondern daft zumindest ein Toil schon in jfingeren Oogonien vorhanden ist. Es ist nicht v611ig sicher, ob das Heranwachsen yon ein odor zwei groften DNS-KSrpern in den sps Oogonien auf Neusynthesen oder auf eine Zusammenballung bereits vorhandener, aber im Kern verteilter DNS zurfickgeht. Nur mit mikrophotometrischer Methode wird es m6glieh sein, diese Frage endgiiltig zu entscheiden. F fir don Fall, dab ein gr6fterer, d.h. fiber das Maft des chromosomalen Nukleolenbildungsortes hinausgehender Anteil der Nukleolen-DNS st/~ndiger Bestandteil aller Stadien der Keimbahn ist (Keimbahn-DNS), mfiftten aueh die m/innliehen Keimzellen diese DNS enthalten. IV. X-r und Nukleolus in den Spermatogonien I n der T a t besitzen auch die Spermatogonien der Grille eine auffallende, positiv heteropyknotische DNS-Masse, die wie in den Oogonien an der Peripherie des Zellkerns liegt und sich deutlich yon den schw/icher anfs Interphasechromosomen abhebt. Bisweilen ragt diese DNSMasse - - gleichfalls wie in den Oogonien - - in eine Kerntasche hinein, die ins Cytoplasma ausgebuchtet ist. I m Feulgen-Quetschpr/iparat sehen die Gametogonienkerne beider Geschlechter einander so ~hnlich, dab es k a u m mSglich ist, sie voneinander zu unterscheiden (vgl. Abb. 8 b, links, mit Sa). Daher wurde angenommen, dab die Chromozentren bei M/innchen und Weibchen von fibereinstimmender Natur seien (BucklER,
54
W. K v ~ z :
Abb. 8 ~ . Oogenesestadien (linke Reihe; a, c und e) und entsprechende Spermatogenesestadien (rechte Reihe; b, d und f); Feulgen-Que~schprgparate. Beide Geschlechter entwickeln in der meiotischen Prophase Lampenbiirstenchromosomen. In der Spermatogonieninterphase und im spi~ten Pachytiin sieh~ das ioositiv heteropyknotische X-Chromosom (X) der MSonnchen dem weiblichen DNS-K6rper ( ~ ) sehr 5~hnlich. Dagegen liegt das X-Chromosom in der Metaphase der Spermgtogonienteilungen negativ heteropyknotisch vor und ist dann deutlich chromosomenf6rmig gestMtet (b, rechts), a und b Gametogonien; c und d mittleres Pachytgn; e und f spiites Pachytiin
Entstehung multipler 0ocytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
55
1909), zumal auch in den Spermatogonien biswcilen ein r~umlicher Kont a k t zwischen tier heterochromatischen DNS-Masse und dem Nukleolus besteht (SOTnLO und WETTSTEIH~1964). Die t/~uschcnde J~hnlichkeit im Aussehen dcr Chromozentren ist jedoch auf die Interphase beschr/~nkt und verschwindet, sobald die Kerne in die Metaphasc eintreten. Dann /tndert die DNS-Masse der Sperrnatogenese zwar ebenso ihren Kontraktionszustand wie der Nukleolen-DNS-K6rper der Oogonien und wird negativ hetcropyknotisch, doch nimrnt das Chromozentrurn der M/~nnchen dabci eine deutlich chrornosomenf6rmige Gestalt an und unterscheidet sich dadurch vom f/s aufgelockertcn DNS-K6rpcr der weiblichen Metaphase. Das negativ heteropyknotische, chrornosornenf6rmige Gebilde der M/innchen erweist sich als eines der 21 Chromosornen des diploiden Satzes, und zwar als das dcutlich 1/s aller Chromosomen, welches kcinen homologen Partner hat und daher als X-Chromosom angesprochen werden mug (Abb. 8b, rechts). Die Befunde stirnmen mit den Verhiiltnissen in der Schistocerca-Sperrnatogenese iiberein (JoHH und H]~HDERSOH, 1962), WO alas Geschlechtschromosom beim M~nnchen ebenfalls Mlozykliseh vorliegt und sich dadurch yon den Autosornen unterscheidct. Dagegen ist der Nukleolen-DNS-K6rper dcr weiblichen Grillen nicht mit den X-Chromosomen identisch, sondern besteht als zus/~tzliches DNSElement nebcn den 22 Metaphasechrornosomen (Abb. 6). Dcr yon SOTELO und WETTSTEIN beschriebene K o n t a k t zwischen dern X-Chromosom und den Nukleolen ist nur in einern Tell der Spermatogonien zu finden, und in keinem Fall ist die Verbindung besonders fest. Daher scheint es sich wie bei Schistocerca (JOHN und H]~3HDERSOH) nur urn eine unspezifische Assoziation dcr beiden Elcmente zu handeln. In Quetschprs unfixicrter, iiberlebender Gryllus-Spermatogonien 16sen sich die Nukleolen schon bei cincm leichten Druck auf das Deckglas vom X-Chrornosom ab. Demgegentiber ist die Nukleolarsubstanz der Oogonien viel fester rnit der Nukleolen-DNS verbunden; denn in den Quetschpr/~paraten der 0varien ist es in keinern Falle gelungen, die peripher gelegenen Nukleolenkugcln vom zentralen DNS-K6rper abzutrennen. In vielen Spermatogonienkernen liegen die Nukleolen von vornherein nicht in der Nghe des X-Ohromosoms (Abb. 9e und f). Die Spermatogoniennukleolen sind vielgestaltig; sie kommen in Einzahl (Abb. 9a) oder paarweise vor (Abb. 9b) und sind entwedcr kugelf6rrnig verdichtet (Abb. 9a und b) oder traubenf6rmig aufgeloekert (Abb. 9e, d und f). Das X-Ohromosorn ist meist haarnadelf6rmig gebogen und liegt nicht selten in einer Kerntasche (Abb. 9i). DaB das positiv heteropyknotische gebilde der Interphase dem gesamten X-Ohromosom entsprieht und nieht nur einem begrenzten Abschnitt, wird in der Prophase der Spermatogonienmitose deutlieh, wenn auch die Autosomen in
56
W. Kv~z:
Abb. 9a--i. Vitalstrukturen der Nukleolen (N) und des X-Chromosoms (X) in den Spermatogonienkernen yon Gryllus domestieus (a--f, h und i LebendprEparate, Ph~senkontrast; g Karmin-Essigs/~ure-Fgrbung). Die Nukleolen kommen einzeln oder pagrweise v o r u n d sind kompakt gestaltet oder in Grana aufgeloekert. Das X-Chromosom ist hEufig haarnadelf6rmig gebogen und liegt stets der Kernmembran an; gelegentlieh ragt es in einer Ausbuehtung des Kerns ins Cytoplgsma hinein (h, i). a--d Verschiedene Aspekte der Nukleolen (X-Chromosom nieht siehtbar), e, f u n d i X-Chromosom und Nukleolen in der Interphase. g X-Chromosom und Nukleolus naeh einer modifizierten Karmin-EssigsEure-Fgrbung(s. S. 58) ; der Nukleolus umhfillt zwei auff~llige ,,Chromomeren ~. h Auch in der Spermatogonien-Prophase liegt das (isopyknotisehe) X-Chromosom in einer Kerntasehe; die Nukleolen befinden sieh im Bereieh der Autosomen
E r s e h e i n u n g treten. Das X-Chromosom ist d a n n isopyknotiseh u n d liegt i n m a n e h e n K e r n e n vollst/tndig i n der Kerntasehe, w/thrend die auI diesem S t a d i u m ebenfalls noeh s i e h t b a r e n Nukleolen keinen K o n t a k t m i t dem X-Chromosom haben, s o n d e r n in einer a n d e r e n Region des Zellkerns i m Bereieh der A u t o s o m e n liegen (Abb. 9h). Gegen die V e r m u t u n g y o n SOTELO u n d W~TTST~I~ (1964), der Nukleolus wiirde v o n d e m (in den S p e r m a t o g o n i e n n u r u n i v a l e n t vorh a n d e n e n ) X-Chromosom gebildet, sprieht aueh der Befund, dab zahl-
Entstehung multipler Ooeytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
57
reiche Spermatogonienkerne den Nukleolus in paariger Anzahl enthalten (Abb. 9b). Aueh eine Analyse somagiseher Zellen trggt zur Ermittlung der Lage des Nukleolenbildungsortes bei. Als X 0 - T y p (ira mgnnliehen Gesehleeht) bietet Gryllu8 ngmlieh die M6gliehkeit, durch Vergleieh der Nukleolenzahl in einander entspreehenden Geweben bei Mgnnehen und Weibehen giieksehl/isse auf die Lage des Nukleolenbildungsortes zu ziehen. Sollte der Nukleolenbildungsort in dem Geschleehtsehromosom liegen, so wgre zwisehen den Gesehleehtern ein signifikanter Untersehied zu erwarten, well d a n n die entspreehenden Genorte beim Weibehen zweimal, in den Zellen der Mgnnehen dagegen n u t in einfaehem Satz vorhanden sein diirften. Zur vergleiehenden Auszghlung der Nukleolen wurden die Untersehlundganglien gewfihlt, da in diesem Gewebe bei friseh gesehliipften Tieren noeh zahlreiehe Mitosen stattfinden und das V o r k o m m e n polyploider Zellen auf so jungen Entwieklungsstadien noeh nieht sehr wahrseheinlieh ist. Bei beiden Gesehleehtern enthalten die meisten Ganglienzellen n u t einen einzigen Nukleolus pro Zellkern, der m6glieherweise dutch Versehmelzung aus paarigen Anlagen hervorgegangen ist (vgl. S. 58). Deutlieh seltener sind die Zellkerne mit zwei Nukleolen; diese sind jedoeh nieht auf die Gewebe weiblieher Tiere besehrgnkt, sondern k o m m e n aueh in den Zellen der Mgnnchen vor, obwohl diese nur Bin einziges X-Chromosom besitzen (Abb. 2b). Aueh in der Hgufigkeit des Auftretens paariger Nukleolen konnte kein signifikanter Untersehied zwisehen Mgnnehen und Weibehen festgestellt werden (Tabelle, unten). Es ist daher sehr unwahrseheinlieh, dag der Nukleolenbildungsort auf dem X-Chromosom liegt. Bemerkenswert ist die gewebespezffiseh variierende Versehmelzungstendenz der Nukleolen. Im jungen, diploiden Follikelepithel und vor Mlem in den Spermatogonien ist die Zahl der Zellkerne mit zwei Nukleolen deutlieh gr6ger als in den Untersehlundganglien (Tabelle). Neben dem auffglligen X-Chromosom enthalten die Spermatogonien noeh ein weiteres DNS-Element, das K o n t a k t zum Nukleolus hat. Diese Tabelle. Hgu/ig/ceit des Au/tretens paariger Nu/cleolen bei Mgnnchen und Weibchen von Gryllus domesticus
Unterschlundc?c~ ganglien ~ ~_ Follikelepithel Spermatogonien
Gesamtzahl der untersuchten Kerne
Zahl der Kerne mit 2 Nukleolen
Prozentsatz der Kerne mit 2 Nukleolen
350 350 350 350
21 27 43 110
6,0 % 7,7 % 12,3 % 31,4 %
Z2-- 0,805 p > 20 %
58
W. Ku~z:
DNS liegt wie die akzessorisehe DNS der Oogonien im Innern der Nukleolen. Sic ist weniger deutlieh als die Oogoniennukleolen-DNS und fallt daher nur naeh einer besonderen Behandlung auf: Dutch Zugabe geringer Mengen yon Aqua dest. an den Rand des Deekglases, unter dem das Hodengewebe in Ringerl6sung gequetseht wurde, quillt der Spermatogoniennukleolus etwas auf und verdrangt das umgebende Chromatin der Interphaseehromosomen. Eine darauffolgende Behandlung mit Formoldampfen verhindert die weitere Quellung des Nukleolus wahrend der ansehliegenden Karmin-Essigsaurefarbung, die ebenfalls unter dem Deekglas durehgefiihrt wird. Auf diese Weise ist es m6glieh, die Form des Nukleolus trotz der Essigsaureeinwirkung zu bewahren und gleiehzeitig die im Nukleolus enthaltene DNS mit K a r m i n kraftig anzuf/~rben (Abb. 9g). Aueh zu diesem DNS-Element gibt es eine Parallele in der Spermatogenese von Schistocerca (JoHsr und HENDE~S050, und zwar das ,,nueleolar chromomere", ein gleichfalls relativ kleiner DNS-Abschnitt, der yon Nukleolarsubstanz umgeben ist. Die Frage, ob es sich bier um eine akzessorische DNS handelt, wird von den Autoren nicht angeschnitten. Falls ein Tell der in den Oogonien yon Gryllus so augenfallig in Erscheinung tretenden Nukleolen-DNS tatsachlich durch alle Stadien der Keimbahn (also auch durch die mannlichen Zellfolgen) mitgeffihrt wird, so ware zu fiberprfifen, oh diese im Innern der Spermatogoniennukleolen gelegene DNS eine ahnliche Sonderstellung im Genom einnimmt wie die DNS-K6rper der Weibchen. I n ihrer Menge dfirfte die sichtbare DNS in den Spermatogoniennukleolen allerdings deutlich hinter der Oogoniennukleo]en-DNS znrfickstehen. Dariiber hinaas gibt es einen Befund, der die gleichfalls akzessorische Natur der mannlichen Nukleolen-DNS sehr in Frage stellt. I m Gegensatz zu den Oogonien liegen die Nukleolen in den Spermatogonien in regelmagiger Zahl vor, entweder zu zweit oder in Einzahl, u n d e s ist anzunehmen, dab die einzeln auftretenden Nnkleolen dutch Verschmelzung aus zunachst ebenfalls doppelten Anlagen hervorgegangen sind. Daftir spricht, dab die DNS in solchen Einzelnukleolen haufig in zwei getrennten Komplexen vorkommt, die den beiden Anlagen entsprechen k6nnten (Abb. 9g). Sollte die Nukleolen-DNS in den Spermatogonien mit den DNS-K6rpern der Oogonien homolog sein, so bliebe unverstandlich, warum die Spermatogoniennukleolen ausgerechnet paarweise auftreten. Vielmehr mfiBten sie als Produkte einer akzessorisehen DNS wie in den Oogonien in unregelmaBiger Zahl vorkommen. Die Paarigkeit der Nukleolen in den diploiden Spermatogonien macht dagegen eine chromosomale Lage der Nukleolenbildungsorte wahrscheinlich. Die Anzahl der Nukleolen und ihre Lage zu den X-Chromosomen spreehen gleichermagen daftir, dab die Nukleolenbildungsorte bei Gryllus
Entstehung multipler Oocytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
59
in einem Autosomenpaar liegen. Das sieht man besonders deutlieh in den Spermatogonienkernen, well hier das X-Chromosom in der Interphase identifizierbar isK Abweiehende Verh/iltnisse liegen in den Zellen der weibliehen Keimbahn vor, wo die Nukleolen um eine DNS gruppiert sind, die zus/~tzlieh zu den Chromosomen auftritt. Eine dieser 0ogoniennukleolen-DNS homologe akzessorisehe DNS konnte weder in den Spermatogonien noeh in somatisehen Zellen gefunden werden. V. Lampenbiirstenchromosomen in den 0ocyten und Spermatocyten Nach der pr~meiotischen Interphase treten die nun zu den Prim~roocyten gewordenen Oogonien in das Leptotgnstadium ein. Mit diesem Schritt vers sich das guBere Erscheinungsbild der Chromosomen. Die Interphasechromosomen der Oogonien zeichnen sich wie die Interphasechromosomen somatischer Gewebe durch einen unregelm/~Sigen Kontraktionsgrad der verschiedenen Chromosomenabschnitte aus. Dadurch bekommt das ,,Chromatin" ein granul~res, geschecktes Aussehen, well stark Feulgen-positive Partien mit weniger gefgrbten Kernbezirken abwechseln (Abb. l b ; 3a und e). I m Leptot/tnstadium der Primgrooeyten verschwinden diese Unregelm/~Bigkeiten, das gesamte ,,Chromatin" f~rbt sieh gleiehmiigig an, und es erscheinen individnelle Chromosomenf~den, die sehr lang und dieht miteinander verschlungen sind (Abb. 1 b ; 3 e und g). Die Chromosomen des Leptot~ns und der folgenden Stadien der meiotisehen Prophase besitzen bis auf kurze terminale Stiicke keine heterochromatischen Abschnitte. Dieses Merkmal unterscheidet die Meiosechromosomen yon allen anderen Stadien der Keimhahn und des Somas. Die Leptotgnchromosomen sind relativ scharf nnd glatt begrenzt (Abb. 3g), im Gegensatz znm diffnsen Erscheinungsbild der Zygo-, Pachy- und Diplot~nchromosomen, wo in fortschreitendem MaBe die Lampenbfirstenstruktur ausgebfldet wird. Die ersten Anzeiehen fiir die Entwicklung lateraler ,,loops" machen sich im Zygot~n bemerkbar (Abb. 3i). I m Pachytgn werden die seitlichen Schleifen viel 1/~nger, wghrend sich die zentrale Achse, yon der die Schleifen ihren Ausgang nehmen, im Gegensatz dazu weiter verk/irzt (Abb. 10a, d und e). Auf mittleren Pachyt~nstadien k6nnen die diinnen und welt entfalteten loops dentlich yon der stark kontrahierten, Feulgenpositiven Aehse nnterschieden werden (Abb. 10b). Da die Schleifen sehr eng beieinanderliegen, lassen sie sich als Einzelbildungen allerdings nur in Ausnahmef/~llen yon ihrer Ausgangsstelle an der Chromosomenachse bis zum Endpunkt durchgehend verfolgen. I m Zygot/in finder auch die Anordnung der Chromosomen zum Bukett start, wobei sich die Chromosomenenden, die zumindest bei einigen Autosomen heterochromatisch sind, an einem Pol des Zellkerns zusammenfinden und dort einen Heterochromatinknopf bilden (Abb. 10a).
60
W. Ku~z :
Abb. 1 0 a ~ . Lampenbfirstenchromosomen und DNS-KSrper ( ~ ) im Pachyt~n (a, b, d und e Feulgen-Quetschpr~parate; e Vitalpr~parat). Wghrend sich die Zentralachse der Chromosomen in der ersten t-I~lfte des Pachyt~ns welter verkfirzt, werden die lateralen Lampenbfirstenschleifen im Gegensatz dazu in zunehmendem MaBe l~nger. Der im Zygot~n noch fiberwiegend kompakte DNS-KSrper lockert sich im Pachyt~n in dfinne F~den auf, die sich im peripheren Bereich des DNSKSrpers bis zur Unsichtbarkeit entspiralisieren. In dieser peripheren Region liegen einzelne ~ukleolenkugeln, die den DNS-KSrper umhfillen (c). a Zygo-Pachyt~n; b Teilstficke der Pachyt~nchromosomen und ein vollstgndiger DNS-KSrper; c--e Pachyt~n Der viel grS~ere N u k l e o l e n - D N S K S r p e r b e f i n d e t sich meist a m gegeniiberliegenden Pol des Zellkerns. I m Z y g o t a n ist das B u k e t t noch n i c h t so d e u t l i c h zu e r k e n n e n wie i m d a r a u f f o l g e n d e n P a c h y t ~ n (vgl. Abb. 3 k m i t 10c). Das liegt an der verhgltnism~6ig grol~en L a n g e der Zygotgnehromosomen, die den Zellkern auf diesem S t a d i u m noch w e i t g e h e n d ausfiillen. I m P a c h y t ~ n h a b e n sich die C h r o m o s o m e n dagegen weiter k o n t r a h i e r t , so d a 6 die B u k e t t s c h l e i f e n kiirzer u n d die Chromosomenaehsen d i c k e r g e w o r d e n sind. Es ist b e a c h t e n s w e r t , dal3 die E n t w i c k l u n g d e r L a m p e n b i i r s t e n schleifen bereits so frfih in der meiotischen P r o p h a s e einsetzt, wo doch
Entstehung multipler Oocytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
61
das H a u p t w a e h s t u m der Ooeyten erst sp/tter beginnt. Aueh die RNSSynthese ist im Paehyt/in trotz der weitgehend ausgespulten loops noeh relativ gering; sie erreicht erst im darauffolgenden, dem Diplots entspreehenden Stadium die ffir das Ooeytenwaehstum eharakteristisehen AusmaBe (BIER, KtJ~z und RIBBEt~T, 1967). I n einer zweiten Phase des Paehyt~ns (Postpaehyt~n) beginnt mit dem nun einsetzenden starken Euplasmawachstum eine sukzessive Zunahme der Kerngr66e : es bildet sieh das sog. Ke~mbl/isehen. Ws dessen ver]~ngern sieh die Paehyts in dem MaBe, wie der Kern w/~ehst (Abb. l l a und b), und k6nnen seh]iel31ieh nieht mehr mit der Feulgenreaktion dargestellt werden (Abb l l e ) . U m sie dennoeh siehtbar zu maehen, mu6 man sie aus unfixierten, iiberlebenden Kernen isolieren und ungef~rbt im Phasenkontrast betraehten (Kc~z, 1967). Unter diesen Bedingungen kann die Entwieklung der Chromosomen noeh weiter verfolgt werden. I m AnschluS an die postpaehyt~ne Streekung gehen die Chromosomen in das Diplots fiber, kenntlieh am Auseinanderweiehen der bisher gepaarten Aehsen, die dann nut noeh dureh die Chiasmen zusammengehalten werden. Die stark gestreekten Chromosomen des Postpaehytgns und Diplotgns haben noeh etwa die gleiehe loop-L/~nge wie im frfihen Paehyts jedoeh demgegen/iber erheblieh verl~tngerte Aehsen, so dab die einzelnen Sehleifen nieht mehr so dieht beieinanderliegen. Auf diesen Stadien gleiehen die Chromosomen den ans waehsenden Triturus-Ooeyten isolierten Lampenbiirstenehromosomen; sie sind jedoeh erheblieh kleiner und zerbreehlieher. Aueh die Paehyt/inehromosomen der Ms entwiekeln seitliehe Sehleifen und erlangen dadureh ein den weibliehen Chromosomen sehr ghnliehes Aussehen (vgl. Abb. 8d mit 8 e). Die Ausbildung der Lampenbfirstenstruktur bleibt bei den M~nnehen jedoeh in den Anfangsstadien steeken. Obwohl aueh im Postpaehyt~n der Spermatogenese naeh einer anf/~ngliehen Chromosomenkontraktion wieder eine deutliehe Entspiralisierung einsetzt (Abb. 8f), wird die Siehtbarkeitsgrenze der Feulgenf/irbung dabei nieht iiberschritten. Aueh ist die Dauer dieser postpaehytgnen Entspiralisierungsphase im Vergleieh zur Oogenese relativ kurz. I m AnsehluB an das Postpaehyt/~n sehrumpfen die Chromosomen erneut zusammen und bilden stark kontrahierte Diplotgnehromosomen, die ffir die Spermatogenese typiseh sind, an deren Stelle man in der Oogenese jedoeh die weir entspiralisierten Lampenbfirstenehromosomen des Amphibientyps antrifft. Voll entfaltete Lampenbfirstenehromosomen werden yon den M/tnnehen zu keinem Zeitpunkt entwiekelt. Dem entsprieht die relativ geringe RNS-Synthese (ItALJ~XA und HEINONEN, 1966; bei Schistocerca vgl. HEnDERSOn, 1964), die bei den M/~nnehen auf allen Stadien geringer ist als die Syntheseleistung der weibliehen Lampenbfirstenehromosomen w/~hrend des Ooeytenwaehstums.
62
W. KlJ~Z :
Abb. l l~--g, Chromosomen, DNS-K6rper (~) und Nukleolen im Postpachyt/in (~--c FeulgenfErbung; d ~ g entsprechende Lebendpr~,par~te, a ~ f gleiche Vergr61]erung). Achse und loops tier L~mpenbiirstenchromosomen entspirMisieren sich so stark, dab sie schlieBlich nicht mehr sichtbar sind (c). Die Fgden des DNS-
Entstehung multipler 0ocytennukleolen aus DNS-K6rpern bei GryUus u
63
DNS-KSrper und multiple Nukleolen in den 0ocyten
DNS-KSrper und Nukleolen vergrSSern sich in den jungen Oocyten und werden dadurch vie1 auffglhger als in den Oogonien. Junge Oogonien sind durch viele kleine Nukleolen gekennzeichnet, im Gegensatz zu den glteren Stadien, die nur wenige, daffir abet grSSere Nukleolen enthalten. Erwartungsgem&l~ nehmen auch die Feulgen-positiven KSrper im Innern tier Nukleolen an Zahl ab und an GrSSe zu, wenn die Oogonien glter werden. Dieser Proze$ hglt noch an, wghrend die Keimzellen in die Prophase tier Meiose eintreten, so daf3 die Oocytenstadien schliei~lich nur dutch einen bis zwei groSe DNS-KSrper und Nukleolen charakterisiert sind. Zwei Nukleolen sind noch gelegentlich im Leptot/~n zu linden (Abb. 3h), wghrend die Zygo- und Pachytgnkerne in der Regel nur einen einzigen Nukleolus enthalten (Abb. 3k), der jedoch sehr viel grSf~er ist als ein Einzelnukleolus der vorhergehenden Stadien (vgl. Abb. 3h mit 3b). Trotz dieser Gr6$endifferenz entspricht der Aufbau des Nukleolus im Lepto- bis Pachytgn im wesentlichen dem der kleinen Oogoniennukleolen: Die Nukleolarsubstanz ist peripher um einen im Zentrum liegenden DNS-KSrper angeordnet. I m Phasenkontrast-Lebendprgparat sieht man zungchst in leicht gequetschten Oocyten, dal3 der groSe Nukleolus (Sammelnukleolus) aus vielen beieinanderliegenden, optisch dichten Einzelnukleolen besteht, die insgesamt zu einem etwa kugelfSrmigen Gebilde vereinigt sind (Abb. 10c). Werden die Oocyten etwas st/~rker unter dem Deckglas gequetscht, so treten die Einzelnukleolen zur Seite. Dadurch wird ein yon den Nukleolen eingehfillter, weniger phasendichter KSrper sichtbar, dec sich aus lichtmikroskopisch erkennbaren F~den zusammensetzt (Abb. 12c). Er ist im Vergleich zu den DNS-KSrpern tier Oogoniennukleolen zwar sehr viel grbBer, reagiert abet in Ubereinstimmung mit jenen stark Feulgen-positiv (Abb. 12d) und erweist sich dadurch als ein den Oogonienverhgltnissen entsprechender Nukleolen-DNS-KSrper. I m Elektronenmikroskop erkennt man an Ultradfinnschni~ten die Fgden des DNS-K6rpers als grSi~ere Einheiten, die ihrerseits wiederum aus feinen Fibrillen au~gebaut sind (Abb. 12a und b). Die Nukleolen haben dagegen eine dichte, granul/~re Ultrastruktur. I m Bereich der KSrpers treten im Postpachytgn welt auseinander, entspiralisieren sich wie die Chromosonmnschleifen fast bis zur Unsichtbarkeit und 15sen sich schlieBlich yore Rande des DNS-K6rpers ~b. An den entfalteten F~den des DNS-KSrpers entstehen zahlreiche weitere ~ukleolen, die sich wie die DNS-Fgden vom Zentrum ablSsen und im Kern ausbreiten (d--g). Die letzten kompakten Reste des D~S-KSrpers liegen inmitten dieser Nukleolenwolke (e und f: ~). Au~erdem wgchst in den jungen Oocyten eine homogene Proteinkugel heran (B BinnenkSrper), deren Funktion noch unbekannt ist (s. BIER, Kv~z und RIB~Rr 1967)
64
W. K u N z :
Abb. 1 2 a - - d
Entstehung multipler Oocytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
65
Fgden befinden sich keine Nukleolen; diese liegen v M m e h r als rundliehe bis sehalenf6rmige Gebilde aussehlieglieh peripher um den DNS-K6rper herum angeordnet. Die Vers des DNS-K6rpers im Laufe der meiotisehen Prophase (die dutch die Feulgen-Quetschmethode am besten zu untersuehen sind) entspreehen erwartungsgem/~g dem Entwieklungsgang der Nukleolen. Wie die Anzahl der Nukleolen vermindert sieh auch die der DNS-K6rper, bis sehlieglieh im Zygot~n nut noeh ein einziger, besonders groger DNS-K6rper vorhanden ist (Abb. 3i). Es liegt nahe anzunehmen, da• dieser aus einer Vereinigung der kleineren DNS-K6rper der vorhergehenden Stadien hervorgehC. Eine andere M6gliehkeit w~re die einseitige F6rderung eines einzigen DNS-KSrpers bei gleiehzeitiger Riiekbildung aller fibrigen. Das wfirde Extra-DNS-Synthesen in diesem einen DNS-K6rper erfordern. Wie bereits besehrieben (s. S. 51), ist es jedoeh sehwer, allein mit der autoradiographisehen Methode Extrasynthesen yon asynehronen l~eduplikationen zu unterseheiden. Erst wenn die S-Phase bereits seit geraumer Zeit abgesehlossen ist und der Einbau radioaktiven Thymidins im DNS-K6rper dann immer noeh anh/~lt, k6nnte das als Hh~weis ffir Extrasynthesen gewertet werden. I n Erwartung soleher Verh/fltnisse wurden junge Grillen des dritten und vierten Larvalstadiums mit 3H-Thymidin injiziert (4 ~C pro Tier; 22100 mC/mM) und naeh variierenden Inkubationszeiten fixiert (1 bis 62 h). Die Sehnitte wurden vor dem Aufziehen des Strippingfilms 1 h bei 37~ mit RNase behandelt, um die DNS-Spezifit/it der Markierung zu sichern. Bei der Untersuehung der Autoradiogramme fanden sieh alle drei MSgliehkeiten der Aktivit/~tsverteilung: 1. Chromosomen markiert, DNS-K6rper inaktiv, 2. Markierung fiber beiden Strukturen und 3. nur DNS-K6rper markiert (Abb. 7). Aus diesen Markierungsmustern geht zwar hervor, dag die Thymidineinlagerung im DNS-K6rper in vielen Kernen zu anderen Zeiten als die Chromosomenreplikation erfolgt, jedoeh ist die Zeitdifferenz nichg sehr grog; denn die Synthesen dauern sowohl im DNS-K6rper als aueh in den Chromosomen bis in die fortgesehrittenen Meiosestadien. Die Chromosomen sind in manehen Kernen nieht nut in der pr/~meiotisehen Interphase und im Leptot/~n markiert, sondern aueh noeh im Zygo- and sogar Paehyt/~n (Abb. 7 a - - d ) . I m DNS-K6rper reieht der Thymidineinbau bis ins mittlere Paehytgn, dauert also nieht viel lgnger als die Inkorporation in den Chromosomen. Derartig sp/~te Markierungen finden sieh aueh naeh relativ kurzen Abb. 12a d. DNS-K6rper und multiple Nukleolen im Pachyt/*n einer Oocyte (a und b elektronenmikroskopische Aufnahmen, c entsprechendes Vitalprgparat, d entsprechendes Feulgen-Quetschpriiparat, c und d gleiche VergrSgerung). Der in seiner Ultrastruktur fibrillgr aufgebgute DNS-K6rper besteht aus gr6Beren Einheiten, die im Lichtmikroskop als Fiiden in Erscheirmng treten (e). Die granulgr strukturierten Nukleolen liegen nur im peripheren Bereich des DNS-K6rpers 5 Chromosoma(Berl.)Bd. 26
66
W. Kv~z:
Inkubationszeiten (4 h), sand also nieht darauf zuriickzuf/ihren, daft die Chromosomenentwieklung noeh weitergelaufen ist, nachdem die Synthese bereits beendet war. Zwar sprieht der Augenschein fiir eine Vermehrung der NukleolenDNS im Lepto- his Paehytan, jedoeh stehen v611ig siehere Beweise fiir Extrasynthesen noch aus. Die vorliegenden Befunde lassen es noch denkbar erseheinen, dab die Inkorporationen im DNS-K6rper lediglieh yon einer asynehronen Replikation zeugen, dureh die der in der letzten Oogonienanaphase geteilte DNS-K6rper genauso wie die Chromosomen seine DNS-Masse verdoppelt. I m Leptotan und im friihen Zygotan ist der DNS-K6rper sehr komloakt und hebt sieh als eine intensiv Feulgen-positive Kugel yon den sehwaeher gef/trbten Chromosomen ab. Er liegt meist nahe an der Kernm e m b r a n gegeniiber dem Anheftungspunkt der Bukettchromosomen. Zum selben Zeitpunkt wie die Entfaltung der lateralen Lampenbiirstensehleifen beginnen sieh auch im DNS-K6rper Aufloekerungserseheinungen bemerkbar zu maehen. Dabei ward deutlich, dab der DNS-K6rper aus lauter diinnen, versehlungenen F i d e n zusammengesetzt ist, die in zunehmendem Mal~e auseinandertreten. Die ersten Anzeiehen ftir diese Ausdehnung maehen sieh im Zygotan bemerkbar; danaeh sehreitet der Prozeg raseh fort. I m P a e h y t a n ist der DNS-K6rper in den meisten Kernen bis in sein Zentrum fadig aufgeloekert (Abb. 10a, b und d); nur in einigen Fallen bleibt noeh eine Zeitlang ein verklumpter I{estk6rper im Innern des sonst aufgefaserten DNS-K6rpers erhalten (Abb. 10e). I m gleichen M a t e wie die Faden auseinanderweiehen und einen immer gr61~eren R a u m einnehmen, vermehrt sieh die Zahl der Einzelnukleolen an der Augenseite des DNS-K6rpers. SehlieBlieh haben sich die einzelnen DNS-Faden im Postpaehytan so weir voneinander entfernt (Abb. 11 a und b), dab die Nukleolenkfigelehen nun aueh im Innern des DNS-K6rpers entstehen. Der im frtihen P a e h y t a n noeh annahernd rundliehe Sammelnukleolus verliert dabei seine Kugelform und erreieht immer umfangreiehere AusmaBe (Abb. 11 d und e), bis er sehlieBlich als unregelmaBig begrenztes, wolkenf6rmiges Gebilde aus mehreren hundert Einzelnukleolen besteht und fast das halbe Kernvolumen erfiillt (Abb. l l f und g). Die yon den Nukleolen eingehiillten DNS-Faden sand zur gleiehen Zeit mehr und mehr aus dem Verband des urspriingliehen DNS-K6rpers herausgetreten und haben sich dabei so welt entspiralisiert, dab sie mat der Feulgenfarbung gr6Btenteils nieht mehr naehweisbar sand. Nur die im Zentrum der Nukleolenwolke gelegenen Fadenabsehnitte bleiben noeh eine Zeitlang anf/~rbbar (Abb. 11 e und 13), verlieren jedoeh sparer (4.--5. Oocyte, vom Germarium ausgehend gezahlt) ebenfalls ihre siehtbare positive l~eaktion. Wahrend der Hauptwaehstumsphase der Ooeyte
Entstehung multipler Oocytennuldeolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
67
Abb. 13. Die letzten noch sichtbaren Reste des Nukleolen-DNS-K6rpers kSnnen in ein und demselben Kern wie die multiplen Nukleolen dargestellt werden, wenn der iiberlebende Kern in RingerlSsung leieht gequetseht und anschliegend ein Tropfen Iiiarmin-Essigsiiure mit Filterpapier unter dem Deckglas hindurchgezogen wird. Unter dem Einflul] der Essigsgure quellen die Nukleolen stark anf und werden unsiehtbar, wohingegen der noch kompakte Tell des DNS-K6rpers yon der Quelhmg unbetroffen bleibt und sich krgftig mit Karmin aiff~rbt. Links: Vitalstruktur, Phasenkontrast; reehts: derselbe Zellkern nach Karmin-EssigsgmreDurehzug. B BinnenkSrper enthglt der Zellkern keinerlei Feulgen-positive Elemente mehr; denn gleiehzeitig mit dem DNS-K6rper haben sieh auch die Lampenb/irstenehromosomen sehr weir im Kern ausgebreitet und dabei die Grenze der siehtbaren Farbreaktion iiberschritten. Bei der Gegentiberstellung der 0ogonien mit den Spermatogonien war bereits darauf hingewiesen worden, da6 der DNS-K6rper der Weibchen dem X-Chromosom der Mgnnehen sehr ~thnlieh sieht. Diese Xhnliehkeit zwisehen den Gesehleehtern zeigt sieh aueh noeh in den ersten Stadien der meiotisehen Prophase (Abb. 8e--f); danach entwiekeln sieh die beiden Strukturen jedoeh untersehiedlieh welter: Das X-Chromosom der M/innehen rundet sieh im sp/~ten Paehyt/in zu einer kompakten Kugel ab (Abb. 8f und 14e), die im Diplot~n erhalten bleibt, wohingegen der weibliehe DNS-K6rper in den entspreehenden Stadien in einzelne F/~den auseinanderf/~llt, die sieh im Kern ausbreiten. Auch der Kontak~ zum Nukleolus ist bei beiden Gesehlechtern vorhanden, jedoeh yon untersehiedlieher Natnr. Der Untersehied ist derselbe wie in den Gametogonien (vgl. S. 55): Das X-Chromosom der M/~nnehen liegt dem Nukleolus nur locker an, der DNS-K6rper der weibliehen Ooeyten ist dagegen fest mit den Nukleolen verbunden. I n den Spermatocyten gentigt sehon ein leiehter meehaniseher Druek, um 5*
68
W. Kv~z :
Abb. 14a e. Spermatocyten im Pachyt~nstadium mit X-Chromosom (X) und Nukleolus (N). Der Nukleolus liegt oft in der N~he des X-Chromosoms (a), ist jedoch schon durch einen leichten Druck auf das Deckglas yore X-Chromosom abzul6sen (c). Im lnnern des Nukleolus liegen einige stark gef~trbte ,,Chromomeren" (b, d und e), die wahrscheinlich Teile eines Autosomenpagrs sind (e). - - a u n d c Lebende Pachyt~nkerne; b und d dieselben Kerne nach Karmin-Essigs~ureF~rbung; e Orcein-Essigs~ure-Quetschpri~p~rat
d e n K o n t a k t beider E l e m e n t e zu 16sen, ohne dM3 der Nukleolus dabei seine Gestalt ver/~ndert (vg]. Abb. 14c m i t a). Der Nukleolus h a t jedoch n i c h t n u r K o n t a k t m i t dem X-Chromosom, s o n d e r n andererseits auch die V e r b i n d u n g zu einem autosomMen Chromosomenp~ar (Abb. 14e). Dieser Z u s a m m e n h M t ist wesentlich stabiler u n d n i c h t durch einfaehe
Entstehung multipler Oocytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
69
meehanisehe Eingriffe zu 16sen. An der Stelle, an der der Nukleolus dem Autosomenpaar aufsitzt, fallen aueh in diesen Stadien einige krgftig anf/trbbare ,,Chromomeren" auf (Abb. i4b, d und e). Die auf Grund der Befunde an den Spermatogonien ausgesproehene Vermutung, dag die Nukleolenbildungsorte in den Autosomen liegen, bests sieh an den Spermatoeyten, wo darfiber hinaus die Anheftnngsstelle am Autosom unmittelbar siehtbar ist (Abb. 14@ Infolge der synaptisehen Paarung liegt der Nukleolus in den Spermatoeyten erwartungsgem/~B in allen FAllen nur in Einzahl vor, im Gegensatz zum paarigen Vorkommen in den Spermatogonien. Die vielen hundert Einzelnukleolen im Zellkern der waehsenden Ooeyte des Grillenweibehens (Abb l l g ) entspreehen in ihrem Aufbau den mnltiplen Nukleolen der Amphibieneizelle (Kv~z, 1967). Sie sind wie die Triturus-Nukleolen zu zahlreiehen kleinen Ringen geordnet, die weder untereinander noeh mit den Chromosomen zusammenhs Das verbindende Element innerhalb eines Nukleolenrings ist bei den Amphibien eine Aehse aus DNS (KEzER, pets. Mitt.; MILLE~, 1966). Bei Gryllus liegt vermutlieh ebenfalls eine DNS-Aehse vor, weil die Nukleolenringe unmittelbar aus dem DNS-K6rper des Zygo-/Paehyt~ns hervorgehen. Da eine derartig entspiralisierte DNS Feulgen-negativ ist, wurde versueht, die Ring-DNS der mnltiplen Grillenmlkleolen enzymatiseh naehzuweisen. Die Nukleolenringe yon Gryllus sind jedoeh um mehr als eine Zehnerpotenz kleiner als die der Amphibien und reagieren gegen/iber meehaniseher Beanspruehung sehr empfindlieh. Daher seheiterten die Experimente sehon an der AnfAlligkeit der Nukleolen gegenfiber der Brownsehen Molekularbewegung, dutch die im isolierten 0oeytenkern aueh ohne DNase-Einwirkung bereits zahlreiehe Nukleolen zerrissen wurden, so dag die m6glieherweise enzymatiseh verm'saehten Spaltungen nieht sieher als solehe erkennbar waren. Es bleibt die Frage naeh dem weiteren Sehicksal der Nukleolen-DNS. Bis zum Ende des Ooeytenwaehstums, d.h. bis zur Chorionbildung, liegen die Nukleolenringe als isolierte Gebilde neben den Lampenbiirstenehromosomen. I m Anschlug an die Chorionbildung wird die Membran des Keimbl/tsehens abgebaut, und die Nukleolen sind dann nieht mehr zu erkennen. Ihre geregelte Verteilnng in der 1. l~eifeteilung ist ebenso problematiseh wie ws der Oogonienmitosen. Es gibt jedoeh einige Befunde bei Amphibien, die eine geriehtete Wanderung yon akzessorisehem DNS-Material in der 1. Reifeteilung belegen. I n der Amphibienooeyte wurden naeh Aufl6sung der K e r n m e m b r a n etwa hundert kleine DNS-Partikel beobaehtet, die gemeinsam mit den Chromosomen zum animalen Pol des Eies wandern und sieh dort der Spindel der 1. Reifeteilung anlagern (BRAOHET, 1965). M6glieherweise handelt es sieh dabei um die DNS-Anlagen der multiplen Nukleolen.
70
W. KlT~z:
Ahnliehe Untersuehungen der Reifeteilungen und Fnrehungsstadien werden auch bei Gryllus vorbereitet, um zu prfifen, wie lange die Nukleolen-DNS in der Keimbahn erhalten bleibt. VII. Diskussion Die Blockierung der ribosomalen RNS-Synthese durch Actinomyein und Hybridisierungsversuehe haben gezeigt, dal~ die ribosomale RNS wie jede andere R N S an der DNS-Matrize gebfldet wird (I~ITOSSA und SrlEGELMAZ% 1965). Der DNS-Bereich, der die ribosomale R N S synthetisiert, ist der Nukleolus-Bildungsort (BIRZ~STIEL, WALLACE, SI~LI~ und FISCHBEI~G,1966; RITOSSA, ATWOOD, LI~TDSLEYund SPIEGEL~A~~, ]966). Die ribosomale RNS entsteht hier zun~chst in einer sehwereren Vorstufe (40S), die erst fiber Zwisehenstufen in die 18S- und 28SFraktion umgewandelt wird (GALL, 1966). Die Syntheseleistung der Ribosomen-RNS ist in allen Zellen aul3erordentlich hoeh; bei Bakterien beispielsweise ]iegt die Gesamtproduktion der ribosomalen I~NS in einer Generation auf gleieher H6he wie die Menge aller fibrigen RNS-Fraktionen zusammen (RITOSSA und SPIEGELMAig,1965). Selbst bei maximal m6glicher Ablesegesehwindigkeit k6nnte ein einzelnes Cistron nicht im entferntesten den Bedarf einer Zelle an ribosomaler RNS deeken. Daher liegen die Gene, die der lgibosomen-RNS komplement/~r sind, in multipler Form vor : der Nukleolus-Bildungsort ist ein Polyeistron. In XenopusSomaze]len wird die pr/tribosomale RNS pro haploiden Satz an etwa 800 Einzeleistronen synthetisiert; das sind 0,2% der DNS des Genoms (BIR~STIEL, 1967). Bei Drosophila melanogaster tragt der NukleolusOrganisator mindestens 130 Gene (RITossA, 1968). I n den genannten Beispielen handelt es sieh um die Versorgung somatiseher Zellen mit ribosomaler RNS. Die vielen Gene des Nukleolenbildungsortes brauehen nur fiir eine Einzelzelle aufzukommen. Das besondere Problem der 0ogenese ist jedoeh der Aufbau einer Riesenzelle unter Steuerung yon ebenfalls nur einem einzigen Ze]lkern. Bei Vertebraten (B~owN und LITT~A, 1964), Eehinodermen (CzmAK, WITTMA~NN und HINDEI~NACIt, 1967) und Insekten (Locxsm~, 1966) hat sieh fibereinstimmend herausgestellt, dal~ die Zellkerne der frfihen E m b r y o n e n in den Furehungsstadien noeh keine ribosomale R N S synthetisieren. Das gilt aueh ffir Gryllus domestieus (HA~s]~-D]~L~Z]~SKAMP, SAVER und DvsPIvA, 1967). Andererseits ist bei versehiedenen Tiergruppen schon kurz nach der Befruehtung eine deutliehe Proteinsynthese naehweisbar (HULTI~~, 1964; GROSS und COUSI~EAU, 1964; LOCKSHIN, 1966), die ohne das Vorhandensein ribosomaler RNS nicht denkbar ist. Daher m/issen die jungen Embryonen w/~hrend der Furehungsstadien mit einem ausreiehenden Quantum an ribosomaler R N S versorgt sein, die sehon vor der Befruchtung gebfldet und
Entstehung multipler 0ocytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
71
gespeichert wird, am ehesten wohl w~hrend des Oocytenwachstums (BRow~, 1966). Es gibt in der Tat keinen Entwieklnngsabschnit~ mit so hoher Syntheseleistung an ribosomaler RNS wie die Oogenese. 98% der in der Zeiteinheit yore Genom der wachsenden Xenopus-Oocyte gebildeten hoehmolekularen I~NS sind ribosomaler Natur (DAwDSO~, CUIPPA, CUA~ER und MIRSKu 1966). Da die 0ocyte ~ls Keimbahnzelle ihre Leistungsf~higkett nicht durch ErhShung des Chromosomensatzes (Polyploidie) steigern kann, bleibt ihr nur die M6gliehkeit, einzelne Gene zum Zwecke st~rkerer Syntheseleistung unter Erhaltung der Chromosomenzahl separat zu vermehren. Diese Vervielfachung des Nukleolus-Organisators erreieht in der 0ocyte gewaltige Ausma~e. Bei Triturus wird das sehon in somatisehen Zellen aus vielen hundert Einzelcistronen bestehende Polycistron des Nukleolenbildungsortes in der 0ocyte dariiber hinaus noeh mehr ~ls vertausendfacht, wahrscheinlieh in schrittweiser Duplikation der gesamten Polycistron-Grundeinheit (MILLER, 1966). Auf diese Weise erhSht sieh der D~NS-Gehalt des Zellkerns um mehr als das Doppelte (GALL, 1967). Damit erreicht die Nukleolen-DNS in der Oocyte der Amphibien einen Wert, der hSher liegt als der DNS-Gehalt des ganzen (in der G2-Phase ) vierfaehen Chromosomensatzes. Ahnlich stark scheint die Nukleolen-DNS auch bei Gryllus vermehrt zu werden, allerdings mit dem bemerkenswerten Unterschied, dab ein ansehnlicher Tell dieser DNS bereits in den 0ogonien und zu Beginn der meiotischen Prophase vorhanden ist und w~hrend dieser Zeit gr5Btenteils in einem inaktiven, zusammengeballten Zustgnd vorliegt, wodurch die Nukleolen-DNS bei Gryllus eytologisch sehr deutlich hervortritt. Ein solcher ~kzessorischer DNS-KSrper (jedoch yon erheblieh grSl~eren Dimensionen) k o m m t auch in der Oogenese von Dytiscus v o r u n d entspiralisiert sieh ebenfalls w~thrend des 0oeytenwachstums im Zusammenhang mit der Nukleolenbildung (BIER, K u ~ z und RIp,EaT, 1967). Bei den Amphibien finder in den friihen Stadien der Oogenese keine Zusammenballung der ~ukleolenDNS zu einem DNS-KSrper start, da bei ihnen die Nukleolen-DNS erst im Paehyt/~n kurz vor Beginn ihrer genetischen Aktivit~t vervielfaeht wh~d. I n Ubereinstimmung mit Gryllus vermehrt sich die akzessorische DiNS der Amphibien haupts~chlieh im Bereich der bereits von den Chromosomen abgelSsten Nnkleolen-DNS-Elemente, wghrend der Nukleolenbildungsort in den Chromosomen keinen besonders auffallenden Thymidineinbau zeigt (GALL, 1967). Da die oogenetische Speicherung ribosomaler RNS kein Spezialproblem der Amphibien und einiger Insekten ist, sondern mehr oder weniger ~lle Tiere in der 0ogenese Vorsorge treffen miissen, den kfinftigen E m b r y o eine Zeitlang mit Ribosomen zu versorgen, sollte erwartet werden, dab multiple Ooeytennukleolen und eine ihnen zugrunde
72
W. Kv~z:
liegende akzessorische DNS ein im Tierreich weitverbreitetes Ph/inomen sind. Ob die Nukleolen-DNS cytologisch als DNS-K6rper zu erkennen ist, scheint unter anderem davon abzuhitngen, ob der Aktivitgtsphase (w/~hrend der die DNS entspiralisiert ist) eine Speicherphase vorhergeht, in der die akzessorische DNS zwar bereits gebildet wird, aber nur in unbetritchtlichen Antei]en ihre Funktion, die Nukleolenbildung, ausiibt. Zusammenfassung 1. Die interphasischen Oogonienkerne von Gryllus domesticus enthalten mehrere kleine, kugelf6rmige DNS-KSrper, die von Nukleolen umhiillt sind (Abb. 3 und 4). W/thrend der Kernteilungen lockern sich die DNS-K&rper in d/inne F/~den auf (Abb. 5 und 6) und werden in vielen Fiillen unsichtbar. Diese F~den sind zus~tzliche DNS-Elemente neben den 22 Metaphasechromosomen. Daher is~ die Annahme, DNS K6rper und X-Chromosomen seien miteinander identisch, hinf~llig (vgl. dagegen SOT~LO und W]]TTSTEI[N~1964). In den ~lteren Oogonien vermindert sich die Anzahl der DNS-KSrper zugunsten einer deutlichen Gr56enzunahme der wenigen K6rper, die fibrigbleiben. 2. Die Prim~roocyten besitzen im Lepto- und Zygot~nstadium meist nur noch einen einzigen, allerdings sehr viel grSSer gewordenen DNSK6rper. Dieser zerteilt sich im Pachy- und Diploti~n vollst~ndig in einzelne Fasern, die sich schliel~lich voneinander 15sen und im Kernraum ausbreiten (Abb. 10 und 11). Mit der Entspiralisierung des DNS-KSrpers l~uft eine Vermehrung der Nukleolen parallel, die an den DNS-Fasern entstehen und sich mit diesen gemeinsam fiber weite Bereiche des Oocytenkerns verteilen (Abb. 11). Frfihere Untersuchungen (Kv~z, 1967) batten ergeben, da[3 diese Nukleolen wie die multiplen Oocytennukleolen der Amphibien ringf6rmig gestaltet sind. Die den Nukleolen zugrunde liegende DNS geht bei Gryllus auf den DNS-K6rper der frfihen Stadien zurfick. 3. Auf autoradiographischem Wege wurde ein gegeniiber den Chromosomen asynchroner Thymidineinbau im DNS-KSrper der Oogonien und Oocyten festgestellt (Abb. 7). 4. Laterale Lampenbiirstenschleifen, die zuerst im Zygot~n sichtbar werden, entstehen nicht nut in der weiblichen Meiose, sondern auch in den entsprechenden Prophasestadien der Mi~nnchen (Abb. 8). 5. Ein auffallendes, positiv heteropyknotisches Chromozentrum ist auch in den Spermatogonien und meiotischen Prophasestadien der M~nnchen enthalten (Abb. 8), ohne jedoch regelm~l~ig mit dem Nukleolus verbunden zu sein (Abb. 9 und 14). Es handelt sich hierbei nicht um einen akzessorischen DS~S-KSrper wie in den weiblichen Keimzellen, sondern um das univalente X-Chromosom.
Entstehung multipler 0ocytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
73
6. Diploide somatische Zellen e n t h a l t e n n u r zu e i n e m geringen Prozentsatz zwei Nukleolen; in den meisten F/~llen sind die beiden Nukleolen zu einem einzigen Gebilde verschmolzen. I m V o r k o m m e n zweier Nukleolen liegt zwischen M/~nnchen u n d W e i b c h e n kein signif i k a n t e r Unterschied vor. Das wird als Itinweis daffir gewertet, dab der N u k l e o l e n b i l d u n g s o r t auf einem A u t o s o m e n p a a r liegt, n i c h t auf den (beim W e i b e h e n doppelt, beim M g n n e h e n n u t i n E i n z a h l v o r h a n d e n e n ) Gesehleehtsehromosomen. 7. I n der Oogenese y o n Gryllus ist die N u k l e o l e n - D N S i n hohem MaBe vervielfaeht, w/thrend die iibrigen Gene (in der G2-Phase) n u r i n vierfaehem Satz vorliegen. Der G r u n d fiir die selektive Multiplikation der Gene des Nukleolenbildungsortes liegt wahrseheinlieh darin, dab i n der Oogenese die gesamte ribosomale R N S ffir einen vielzelligen E m b r y o a u f g e b a u t werden mug, andererseits aber i n der K e i m b a h n keine endomitotisehe D N S - V e r m e h r u n g mSglich ist.
Danksagung. Herrn Prof. Dr. K. BIER danke ieh ffir anregende Diskussion, Herrn Prof. Dr. H. I%EZSlKfiir Arbeitsm6glichkeit am Siemens Elmiskop I. Frl. MAI~IO~ NORD~ANN m6chte ieh fiir sorgf/iltige technisehe Hilfe danken. Zusiitze bei der Korrelctur. 1. Wie SOTELOund WETTSTEI~h~lt aueh FAVARDS~R~SO [J. de Mierosc. 7, 205--230 (1968)] auf Grund elektronenmikroskopiseher Untersuehungen den DNS-K6rper der jungen Ooeyten fiir das X-Chromosomenpaar. Da FAVARD-S~O keine vergleichenden Untersuehungen mit der FeulgenMethode durehgefiihrt hat, konnte sie die Entspiralisierung und Ausbreitung der Nukleolen-DNS nicht feststellen und sprach stattdessen den aus Proteinen bestehenden Binnenk6rper (s. BIEr, KVNz und RIEB~RT, 1967) der ~lteren Stadien Ms Heteroehromosoin an. Die im wachsenden Ooeytenkern in groger Zahl entstehenden Einzelnukleolenwerden yon FAVA~D-S~r Ms Degenerationsprodukte des vorher kompakten Makronukleolus aufgefaBt. Untersuehungen des RNS-Stoffwechsels (s. BIER, Kv~z und RIBBERT) zeigten jedoch, dab bei der Bildung der multiplen Einzelnukleolen die nukleol~re Syntheseleistung erst am Anfang ihrer maximMen Entfaltung steht. 2. Nachdem tInI~O~E~ und HALKKA(1967) und gleiehzeitig Kv~z (1967) und BIER, Ku~z und RIm~E~T (1967) den DNS-K6rper yon Gryllus im Zusammenhang mit den multiplen Oocytennukleolen beschrieben haben, sind aueh ]~IMA-DE-FARIA, NILSSON, CAVE, PUGA und JAWORSKA [Chromosoma (Berl.) 2~, 1--20 (1968)] zu 5~hnlichenResultaten gelangt, Mlerdings wurde die Beziehung zu den Heterosomen nicht untersueht.
Literatur B~tY]~EUT~[ER,K. : Die Oogenese der Tipuliden. Chromosoma (Ber].) 7, 508--557 (1956). BEEnMA~, S.: A quantitative study of chromatin diminution in embryonic mitoses of Cyclops/urci/er. Genetics ~4, 567--576 (1966). BIER, K., W. Kvl,~z u. D. RIBBERT: Struktur und Funktion der Oocytenchromosomen und Nuk]eo]en sowie der Ex~ra-DNS w~hrend der Oogenese panoistischer und meroistischer Insekten. Chromosom~ (Berl.) 211, 214--254 (1967).
74
W. K v ~ z :
BIRNSTIEL, M.: Some experiments relating to the homogeneity and arrangement of the ribosomal t~NA genes of Xenopu8 laevis. I n : Cell differentiation (A. V. S. DE REUCK and J. KXlGHT, ed.). London: Churchill Ltd. 1967. , H. WALLACE, J. L. SIRLIN, and M. FISCtIBERO: Localization of the ribosomal DNA complements in the nucleolar organizer region of Xenopus laevis. Nat. Cancer Inst. Monogr. 23, 4 3 1 ~ 4 7 (1966). BOVERI, T. : Die Entwickelung yon Ascaris megalocephala mit besonderer Riieksight auf die KernverhSJtnisse. Festsehrift fiir C. v. KUPFFER. J e n a : G. Fischer 1899. BRACKET, J. : Emission of Feulgen-positive particles during the in vitro m a t u r a t i o n of toad ovocytes. Nature (Lond.) 208, 596--597 (1965). BROW_<, D. D. : The nucleolus and synthesis of ribosomal R N A during oogenesis and embryogenesis. Nat. Cancer Inst. Monogr. 23, 297--309 (1966). - - , and E. LITTNA: R N A synthesis during the development of Xenopus laevis, the South African clawed toad. J. molec. Biol. 8, 669--687 (1964). BUCI~NER, P.: Das aecessorische Chromosom in Spermatogenese und 0ogenese der Orthopteren. Arch. Zellforsch. 3, 335--430 (1909). CZlHAK, G., H. G. WITTMANN U. I. I-IINDENNACH: Uridineinbau in die NukleinsS~uren yon Furehungsstadien der Eier des Seeigels Paracentrotus lividus. Z. Naturforsch. 22b, 1176--1182 (1967). DAVIDSO~, E. H., M. CRIPPA, F. R. CRA~ER, and A. E. ~IRSKu Genomic function during the lampbrush chromosome stage of amphibian oogenesis. Proc. nat. Acad. Sei. (Wash.) 56, 856--863 (1966). GALL, J. G.: Nuclear R N A of the salamander ooeyte. Nat. Cancer Inst. Monogr. 23, 475--488 (1966). - - Synthesis of nueleolar DNA in amphibian ooeytes. J. Cell Biol. 35, 43 A - 44 A (1967). GEYER-DUSZYgrSKA, I. : Chromosome behavior in spermatogenesis of Ceeidomyiidae (Diptera). Chromosoma (Berl.) l l , 499 513 (196]). - - Genetic factors in oogenesis and spermatogenesis in Cecidomyiidae. Chromosomes today 1, 174--178 (1966). GROSS, P. R., a n d G. It. COUSINEAII: Macromolecule synthesis and the influence of actinomyein on early development. Exp. Cell Res. 33, 368--395 (1964). HALKKA, 0., and L. HEI~O~E~: Radioautographie studies on the gonads of Acheta domestieus (L.). Ann. Med. exp. Fenn. 44, 120--124 (1966). HANS~N-DEnKESKAMP, E., H. W. SAVER u. F. DUSPIVA: t~ibonukleinsSmren in der Embryogenese von Aeheta domestica L. Z. Naturforseh. 22b, 540--545 (1967). HEINO~E~, L., and O. HALKKA: Early stages of oogenesis and metabolic DNA in the oocytes of the house cricket, Aeheta domestieus (L). Ann. Med. exp. Fenn. 4~, 101--109 (1967). HENDERSON, S.A.: I~NA synthesis during male meiosis and spermatogenesis. Chromosoma (Berl.) 15, 345--366 (1964). H~LTI~, T.: On the mechanism of ribosomal activation in newly fertilized sea urchin eggs. Develop. Biol. 10, 305--328 (1964). JoHn, B., and S. A. HE~nERSO~: Asynapsis and polyploidie in Sehistocerca paranensis. Chromosoma (Berl.) 13, 111--147 (1962). J6RGENSEN, M.: Zellenstudien. I. Morphologische BeitrS~ge zum Problem des Eiwachstums. Arch. Zellforsch. 10, 1--126 (1913). Ku~z, W. : Lampenbiirstenehromosomen und multiple Nukleolen bei Orthopteren. Chromosoma (Berl.) 21, 446--462 (1967). LIMA-DE-FARIA, A.: Metabolic DNA in Tipula oleracea. Chromosoma (Berl.) 13, 47--59 (1962). - - , a n d M. J. MOSES: Ultrastructure a n d cytoehemistry of metabolic DNA in Tipula. J. Cell Biol. 30, 177--192 (1966).
E n t s t e h u n g multipler 0ocytennukleolen aus DNS-K6rpern bei Gryllus
75
LoexsIti~r R. A. : Insect embryogenesis : maeromoleeular syntheses during early development. Science 154, 775--776 (1966). MILLER, O. L. : Structure and composition of peripheral nueleoli of salamander oocytes. Nat. Cancer Inst. Monogr. 23, 53--66 (1966). ~:~IEFFEL,S. M., and H. V. CROUSE: The elimination and differentiation of chromosomes in the germ line of Sciara. Chromosoma (Berl.) 19, 231--276 (1966). RITOSSA, ~. M. : Unstable redundancy of genes for ribosomal RNA. Proe. nat. Acad. Sci. (Wash.) ~0, 509 516 (1968). - - , K. C. ATWOOD, D . L . LINDSLEY, and S. SPIEGELMAN: On the chromosomal distribution of DNA complementary to ribosomal and soluble I~NA. Nat. Cancer Inst. Monogr. "2g, 4 4 9 4 7 2 (1966). - - , and S. SPIEGELMaN: Localization of DNA complementary to ribosomal R N A in the nucleolus organizer region of Drosophila melanogaster. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.) 53, 737--745 (]965). RYTER, A , et E . KELLENBERGER: Etude microscope 6lectronique de plasmas contenant de l'aeide d6soxyribonucl6ique. I. Les nucl6oides des bact6ries en croissance active. Z. Naturforsch. l g b , 597 605 (1958). SOTELO, J. R., and R. WETTSTEI~-: Electron microscope study on meiosis. The sex chromosome in spermatocytes, spermatids and ooeytes of Gryllus argentinus. Chromosoma (Berl.) 15, 3 8 9 4 1 5 (1964). URBANI, E., e S. RUSsO-CAIA: Osservazioni citochimiche e autoradiografiche sul metabolismo degli acidi nucteici nella oogenesi di ,,Dytiscus marginalis" L. Rend. Ist. Sci. Camerino ~, 19 50 (1964). Dr. WER~1~R KI;NZ Zoologisches I n s t i t u t der Universitgt 44 Mtinster i.Westf., Badestr. 9