Arch. Gyn~k. 211, 595--616 (1971) 9 by J. F. Bergmann Miinchen 1971

Die Impulscytophotometrie des Vaginal- und Cervicalsmears G. REIFFENSTUIIL, E. S~VERI?r W. DITTP~ICtI u n d W . G(]HDE Frauenklinik (Direktor: Prof. Dr. G. Reiffenstuhl) und Institut fiir Strahlenbiologie (Direktor: Prof. Dr. W. Dittrich) der Westfiilischen Wilhelms-Universiti~,t Miinster/Westfalen Eingegangen am 18. September 1971 Impulscytophotometry

of V a g i n a l - a n d C e r v i c a l s m e a r s

Summary. By the new ultra rapid method of "Impulseytophotometrie" the automatic measurement of DNA stained by fluorescent dyes became possible. The rate of measurement is more than 1000 cells per second. Cell suspension flows through a relatively large measuring area parallel to the optical axis of the microscopic objectiv. After digestion of the cellplasma of eells from cervical and vaginal smears and staining of the isolated nuclei with ethidium bromide it is possible to measure the DNA constituents. Cells with appropriate staining by fluorescent dyes emit a fluorescent light signal which is proportional to the amount of the stained compound. The light signals are amplified by photoelectrical devices and classified in a multichannel analyser. The automatically recorded DNA histograms reveal details about the proliferation kinetie of the cells, as well as of the occurrence of aneuploid and higher ploid cells. Tumourcells are having a relatively high proliferation activity. In more than 1300 unsuspeet eases histograms of cervical and vaginal smear cells were performed and characteristic findings described. Furthermore shows a histogram of smear from a female patient with a carcinoma of the cervix a greater part of G 2- and S-phase cells. These irregularities of tumour cell populations can be detected by the "Impulseytophotometrie". The aim of our investigations has been to find out a basis for the automation of presereening of vaginal and cervical smears. Further clinical work has to be done before the method works sufficiently as a prescreening method. Zusammen/assung. Die Impulscytophotometrie (Dittrieh u. GShde, 1969a, b) ermSglieht es, sehr genaue Mengenverteilungen (Histogramme) wichtiger ZellinhMtstoffe mit MeBraten yon 100O Zellen pro Sekunde zu ermitteln. Histogramme des DNS- und Proteingehaltes etc. lassen sich innerhalb yon Sekunden bis zu wenigen Minuten gewinnen bei einer Meggenauigkeit, die die der herkSmmlichen Cytophotometer noeh fibertrifft. Naeh geeigneter Fluorochromierung liefert die Impulseytophotometrie yon Zellen des Cervical- und Vaginalsmears ein- und zweiparametrige Histogramme des DNS- und Proteingehaltes. Auf eine besonders einfache Fluorochromierungsmethode der DNS yon Cervical- und Vaginalzellen mit Ethidiumbromide (EB) wird hingewiesen ebenso wie auf Besonderheiten der Gewinnung und Vorbereitung des Abstriehmaterials fiir die Impulscytophotometrie.

596

G. Reiffenstuh], E. Severin, W. Dittrich und W. G6hde:

Seit langer Zeit wird die Frage diskutiert, ob und in welchem Umfang die Cytophotometrie tier Cervical- und Vaginalsmear-Diagnostik nutzbar gemacht werden kann. Wegen ihrer grol3en Schnelligkeit und ihrer grol~en Genauigkeit ist die Impulscytephotometrie dazu angetan, diese Diskussion neu zu beleben. An fiber 1300 unverd~chtigen F~llen wurden EB- und Feulgen-FluorescenzHistogramme tier Cervical- und Vaginalsmearzellen impulscytophotometrisch bestimmt. Dabei zeigten sich einige auffiillige Besonderheiten, u.a. das Auftreten cyclusabhEngiger Nebengipfel und von kleinen Signalen, die auf das Vorhandensein von Zelltriimmern hinweisen. 4c-Zellen sind relativ selten. Die genaue Kenntnis dieser Besonderheiten des unverd~chtigen Smears ist f~r die Beurteilung krebsverd~chtiger Smears unerlii$1ich. Am Beispiel eines charakteristischen DNSHistogramms bei histologisch gesichertem Carcinoma colli uteri wird auf die natfirlichen Grenzen bei der Interpretation einparametriger Histogrammc und auf die M6glichkeiten eingegangen, diese Grenzen durch Einffihrung weiterer Parameter zu fiberschreiten. Bemtihungen, die auf die Entwicklung eines automatischen Prescreening abzielen, sind in der Krebsvorsorge nicht neu. Erst die gegl/ickte Verbindung yon Mikrospektrophotometrie und Mikrofluorometrie yon Partikeln mit einem schnellen DurchfluBverfahren in der Impulscytophotometric hat jedoch hier den ersten und vielleicht entscheidenden Fortschritt gebracht. Erfolgreiche Versuche, Teilchen in einem DurchfluBverfahren auf optischem Wege zu zghlen, gehen auf Moldovan (1934), Crossland-Taylor (1958) und Gucker et ~l. (1954) zuriick. Die Teilchen bzw. Zellen wurden in einem geeigneten Medium suspendiert, durch eine besondere Durchflul3kammer geftihrt und dort mit Hilfe einer geeigneten Lichtquelle intensiv beleuchtet. Die hier entstehenden Lichtsignale wurden mit Hilfe photoelektrisoher Einrichtungen in elektrische Signale umgewandelt und nach entsprechender Verstgrkung analysiert. Insbesondere war es in dieser Weise auf optischem Wege m6glich, die Gesamtzahl aller Zellen zu ermitteln, die die DurchfluGkammer durchquert hatten und die somit in einem bekannten Volumen der Zellsuspension enthalten waren. Etwas spgter setzten dann Bestrebungen ein, mit Hflfe der bekannten Durchflul~anordnnngen und verbesserter Fgrbemethoden bilogisches Zellmaterial auf Grund seiner besonderen optischen Eigenschaften durch Hitufigkeitsverteilungen, sogenannte ,,Histogramme" genauer zu beschreiben (Kamentsky et al., 1965 ; Koenig eta]., 1968). All diesen, im Endergebnis wenig befriedigenden Bemiihungen war gemeinsam, dal3 Durchflul3verfahren zur Anwendung kamen, bei denen der Dtspersionsstrom senkrecht zur optischen Achse des Beobachtungssystems durch die MeBste]le bewegt wird. Damit ist aber die ftir die quantitative Erfassung yon Absorptionsoder Fluorescenz-Eigenschaften erforderliche Fokussierung der Zellen insofern erschwert, als diese die Mel3ste]le in unterschiedlichen Einstellebenen passieren.

Impulscytophotometrie des Vaginal-Cervicalsmears MeSstelle

ZufluSkanal fLirden Querstrom

ZufluBkanal for die Zellsuspension

597

Deckglas

AbfluBkanal ~ r die

gemessene Zellsuspension

Abb. 1. DurchfluBkammer des Impulscytophotometers (schematisch). Die Einmfindung des ZufluBkanals ffr die Zellsuspension in den Kanal ffir den zellfreien Querstrom stellt die MeBstelle dar, auf die das Mikroskopobjektiv fokussiert ist. Jede einzelne Zelle sender ihr maximales Fluorescenzlichtsignal genau beim Durchtritt durch diese MeBstelle aus. Vom Querstrom werden alle Zellen schnell yon der Mel]stelle weggefiihrt

1969 haben Dittrich und G6hde eine neuartige Durchflu$methode angegeben, mit deren Hilfe sich wesent]iche optische Nachteile der bekannten Durchstr6mungskammern vermeiden lassen. Die einheitliche Fokussierung der Teilchen bzw. Zellen zum Zeitpunkt der Messung wird auf einfache Weise dadurch erreicht, dab der Dispersionsstrom mit einer wesentlichen Teilkomponente seiner Geschwindigkeit parallel zur optischen Achse des verwendeten Mikroskops dutch die MeBstelle gelenkt wird. Abb. 1 zeigt im Querschnitt schematisch eine spezielle Ausffihrung dieser neuentwickelten Durchflu$kammer, die sich fiir die Auflichtfluorescenzmessungen ganz besonders gut eignet (Dittrich und G6hde, 1969b). Abb. 2 zeigt ein Schema des gesamten Impulscytophotometers. Ein Auflichtmikroskop dient in Verbindung mit einer QuecksilberhSchstdrucklampe (HBO 100), einem Photomu]tiplier und einem Vielkanalanalysator zur Fluorescenzanregung und zur Messung der Fluorescenzlichtsignale. Mit Hflfe gebr/tuchlicher Anordnungen werden die vom Photomultiplier erhaltenen elektrischen Signale verst/~rkt und entsprechend ihrer H6he irn Vielkanalanalysator klassifiziert. Mit dieser Anordnung kSnnen bis zu 1000 Zellen pro Sekunde gemessen werden. Die so gewonnenen H~ufigkeitsverteilungen (I-Iistogramme) entsprechen unter bestimmten Voraussetzungen, auf die im einzelnen noch n/~her

598

G. Reiffenstuhl, E. Severin, W. Dittrieh und W. GShde:

J ,2 ] 11

13

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4

32

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7

Abb. 2. Sehematisehe Darstellung des Impulseytophotometers. 1 Xenonlampe, 2 Filter, 3 Blende, 4 Linse, 5 reflektierendes Interferenzfilter, 6 0bjektiv, 7 Durehflu0kammer fiir Auflichtbeleuchtung, 8 Filter, 9 Blende, 10 Linse, 11 Photomultiplier, 12 Oscilloskop, 13 Verstgrker, 14 Peak-Detektor, 15 Vielkanalanalysator, 16 X-Y-Sehreiber

eingegangen w e r d e n wird, g e n a u der M e n g e n v e r t e i l u n g b e s t i m m t e r , biologisch besonders wichtiger Zellinhaltsstoffe. Die Histogramme werden von einem X-Y-Schreiber ausgegeben. Abb. 3 zeigt das Impulseytophotometer (kommerzielle Ausffihrung der Firma Phywe). Zur gleichmBBigen Ausleuchtnng der sehr groBen MeBstelle (100 bis 150 ~m) naeh dem KShlersehen Prinzip muB die Beleuehtung sehr genau eingestellt werden. Bei handelsfibliehen Mikroskopen ist die stabile Justierung wegen der dort fiir die optische Abbildung benStigten Zwischenbilder erheblich ersehwert. Deshalb wurde ein speziell fiir das DurchfluBverfahren geeignetes Stativ entwiekelt. Als Objektiv wurde das Objektiv Ultrafluar 100 (Zeiss) verwendet. Mit d e m I m p u l s e y t o p h o t o m e t e r (ICP) lassen sich in sehr k u r z e r Zeit groBe Zellmengen analysieren, wie sie z. B. i m A b s t r i c h m a t e r i a l vorliegen. Es erm6glicht insbesondere die a u t o m a t i s c h e Messung v o n H/~ufigkeitsverteilungen b e s t i m m t e r biologisch wichtiger Zellinhaltsstoffe. D a z u geh6ren die G e s a m t m e n g e der D N S 1 pro Zelle, der R N S 2 pro Zelle, die Menge des G e s a m t p r o t e i n s pro Zelle usw. I n d e r hier beschriebenen Ausftihrung eignet sich die A p p a r a t u r ffir Messungen an 1000 Zellen u n d m e h r pro Sekunde. D a b e i ist es m6glich, in de~welben Zeit n i e h t n u r 1 DNS = Desoxyribonueleins/~ure (fast aussehlieBlich im Zellkern). 2 lgNS = l~ibonueleins~ure (ira Zellkern und im Zelleib).

Impulscytophotometrie dos Vaginal-Cervicalsmears

599

Abb. 3. Impulscytophotometer (ICP 11) (Phywe AG, GSttingen). In dem Tischger~t befinden sich die Durchflul3kammer, die I-Iochleistungsmikroskopierleuchte mit einer QuecksilberhSchstdrucklampe (HBO 100 W/2, Osram) mit dem Ziindger/s die optisehen Teile der Auflichtfluorescenzanordnung, ein oder zwei (fiir Simultanmessungen) Photomultiplier, ein Beobachtungstubus zur Kontrolle der MeBstelle und die Saugpumpe fiir die DurchfluBkammer. Der Elektronikschrank enthKlt das Stromversorgungsger~t ffir die QueeksilberhSehstdrucklampe, die ttoehspannungsquelle fiir den Photomultiplier, einen Verst~rker mit variabler Diskriminatorschwelle, einen ImpulshShendetektor, den lmpulshShenanalysator, einen u zur automatischen Datenausgabe in Form yon Histogrammen, einen Oscillographen zur dauernden Darstellung des Kernspeicherinhaltes des ImpulshShenanalysators, einen Oseillographen zur Darstellung der Mel~impulse w~hrend des Mel3ablaufes, eine Fehleranzeige, die automatiseh die Blockierung oder Verunreinigung der Durchflu6kammer anzeigt, einen elektronischen Z~hler zur Registrierung der Zahl der gemessenen Zellen, ein Ratemeter zur Kontrolle der Zahl der Zellen pro Suspensionsvolumen, Anschlfisse zur digitalen Datenausgabe auf Loehstreifen, Magnetband, Zifferndrueker oder zum on line-Betrieb mit einem gr6Beren Computer sowie eine Bedienungstafel, yon der aus sich das ganze ICP 11 mit nur 4 Druektasten steuern 1/il3t

ein einziges, s o n d e r n gleichzeitig m e h r e r e cy~ochemisch wichtige Merkm a l e d e r Zelle q u a n t i t a t i v zu erfassen. Die MeSgenauigkeit der I m p u l s c y t o p h o t o m e t r i e v o n Zellinhaltsstoffen ~ibertrifft die d e r h e r k S m m l i c h e n C y t o p h o t o m e t r i e ( M i k r o s p e k t r o p h o t o m e t r i e , Mikrofluorometrie) oder k o m m t ihr z u m i n d e s t gleich, die MeSgeschwindigkeit ist jedoch e t w a 100000mal gr513er als in der h e r k S m m l i e h e n C y t o p h o t o m e t r i e , D u r c h solche a u t o m a t i s c h gew~hrleistete wechselseitige Z u o r d n u n g e n unter-

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G. Reiffenstuhl, E. Severin, W. Dittrich und W. G6hde:

schiedlicher Zellinhaltsstoffe erhSht sieh der Informationsgehalt der Messungen bei gleiehbleibendem Zeitaufwand ganz erheblich; es lassen sieh demnaeh impulscytophotometriseh auch zwei- und mehrparametrige tIistogramme, z.B. des DNS-, des Proteingehaltes etc. innerhalb yon Sekunden his zu wenigen Minuten gewinnen (GShde und Dittrieh, 1970). Nun ist seit l~ngerer Zeit bekannt, dal~ sieh grS~ere Kollektive yon Krebszellen hinsiehtlich der Mengenverteilung yon biologisch bedeutsamen Zellinhaltsstoffen von Kollektiven normaler Zellen erheblieh unterscheiden k6nnen. Wegen des hohen Zeitaufwandes der herkSmmliehen cytophotometrisehen Untersuehungsmethoden liel~ sieh jedoeh diese Erkenntnis bislang fiir die medizinisehe Diagnostik kaum nutzbar machen. Die Impulscytophotometrie hat in dieser Hinsieht aber ganz neue MSglichkeiten erSffnet, so dal~ zu diskutieren war, ob und in welchem Umfang das neue Verfahren in der Cervieal-VaginalsmearDiagnostik angewandt werden kann. Wegen der sehnellen und genauen Messung der Mengenverteilung von Zellblhaltsstoffen bietet sieh die ICP im Rahmen eines zukfinftigen Krebsvorsorgeprogramms an. Um jedoeh das Endziel, die Automation des Verfahrens zu erreiehen, ist noeh weitere intensive Vorarbeit erforderlich, die sieh insbesondere auf den Vergleieh klinischer Befunde mit den impu]seytophotometrisehen Daten an einem grol]en Patientengut zu erstrecken hat. Wegen ihrer grol~en Sehnelligkeit und ihrer gro~en Genauigkeit ist jedoch die Impulseytophotometrie dazu angetan, die alte Diskussion um das Ffir und Wider einer automatisehen Auswertung yon Smearmaterial neu zu beleben. Mit l~fieksieht auf die hohe gesundheitspolitisehe Bedeutung einer automatisierten Vorsortierung von Zellabstriehmaterial wurden an mehr als 1300 Patientinnen der Universit~ts-Frauenklinik Mtinster DNS-Histogramme der Cervical- und Vaginalsmearzellen impulseytophotometriseh bestimmt. Dabei zeigten sieh einige auffs Besonderheiten, deren genaue Kenntnis fiir die Beurteilung krebsverd~tehtiger Zellabstriche unerl~Blieh ist. Zum besseren Verst~ndnis des folgenden sei hier zun/~ehst an einige Grnndbegriffe der Cytologie und Cytogenetik erinnert.

Grundbegri/]e Jede normale menschliche Zelle besitzt unmittelbar naeh der Zellteflung einen diploiden Chromosomensatz (2 c : 46; c bedeutet Anzahl der Chromosomen pro haploidem Chromosomensatz). Ws des Generationscyclus der Zelle (schematisch in Abb. 4) verdoppelt sich die Gesamtzahl der Chromosomen ( ~ 4 c). In der Mitose erh~lt dann jede Toehter-Zelle wiederum einen diploiden Chromosomensatz ( z 2 c). Der gesamte Generationseyclus wird in herkSmmlieher Weise (Howard und

Impulseytophotometrie des Vaginal-Cerviealsmears V

1 Zellzyklus

|

601

1

|

2t

t == uJ

Q

G1

G2

M

G1

0

Zeit

Abb. 4. DNS-Gehalt einer Zelle w/ihrend der einzelnen Phasen des Generationseyclus (schematisch). G 1 Pr~synthetische Phase, S DN S-Syn~hese-Phase, G 2 postsynthetisehe Phase, M Mitose. Abszisse: Zeit (willkiirlich), Ordinate: DNS-Menge pro Zelle (relativ), oben: Chromosomensatz

Pele, 1953) in verschiedene Phasen eingeteflt : die Zellen, die sich vor der DNS-Synthese befinden, werden ,,G l"-Phase-Zellen genannt, Zellen im Stadium der DNS-Synthese (Verdoppelung der DNS-Menge und Ubergang jedes Chromosoms in zwei Chromatiden oder Tochterehromosome) werden ,,S".Phase-Zellen (,,S": Synthese) genannt. An die DNS-Synthese-Phase schliel~t sich die G 2-Phase an. Auf sie folgt die Mitose (M), in der die Ghromosomen und damit aueh die DNS-Menge zu gleiehen Teilen auf die Tochterzellen vertei]t werden. Unbesehadet der sehr groBen Untersehiede in der proliferativen Aktivit~t der Gewebe des mensehlichen Organismus beansprucht im Generationscyclus einer menschlichen Zelle in der Regel die G 1-Phase die 1/~ngste Zeit. So ist es verst~ndlich, da$ sich auch z.B. die meisten Zellen des normalen Vaginalepithels in der G 1-Phase befinden, was im Histogramm in einer Anh/~ufung yon Zellen in G 1 (2 c), d.h. mit relativ niederen DNSWerten, zum Ausdruek kommt. I n den Zellen pathologiseh ver/~nderter Gewebe, etwa in Tumorzellpopulationen kann sich aueh die Dauer des Generationscyclus /~ndern, und zwar vorwiegend auf Kosten der Dauer der G 1-Phase. Diese ist in sehnellwachsenden Geweben verkfirzt. Dementspreehend finder man in tIistogrammen yon Tumorzel]popu]ationen meist relativ weniger Zellen in der G 1-Phase und sehr viel mehr Zellen in der S und (G 2 ~-M)-Phase, und es liegt nahe, dieses Kriterium zur Unterscheidung yon ,,normalen" und Tumorzellpopulationen heranzuziehen.

602

G. Reiffenstuhl, E. Severin, W. Dittrich und W. GShde:

Jede Zelle dureheilt wi~hrend ihrer Entwicklung die einzelnen Phasen des Generationscyclus in der in Abb. 4 dargestellten Reihenfolge. Links wird in der auf die Zellteilung folgenden Phase G l die Zelle mit ihrem einen einzigen diploiden Chromosomensatz entspreehendem DNS-Gehalt dargestellt (G l = 2 c). Der DNS-Gehalt einer normalen menschlichen G 1-Phase-Zelle liegt bei ann~hernd 7 pg DNS ( p g = P i c o g r a m m - 1/1000 000 000 000 g = 10-12 g). W/ihrend der DNS-Synthese steigt der DNS-Gehalt der Zelle auf das doppelte (14pg) der Menge der G1Phase-Zelle an und bleibt fiir die Dauer der G 2-Phase und bis zum Ende der Zellteilung auf dieser HShe. Es ist deshalb mSglieh, die diploiden Zellen des mensehliehen Organismus ]ediglich auf Grund ihres DNS-Gehaltes den einzelnen Phasen des Generationseyelus [G 1, S- und (G 2 -~ M)-Phase] zuzuordnen. Insbesondere 1/iBt sieh auch aus den yon Zellabstrichen angefertigten DNS-Histogrammen unmittelbar auf den prozentualen Anteil der G 1, S- und (G 2 +M)-Phase-Zellen sehlieBen, vorausgesetzt allerdings, dal? es sieh um homogene diploide Zellpopulationen handelt. Seit den grundlegenden absorptions-eytophotometrischen Untersuchungen yon Caspersson (1936) hat sieh immer wieder bestgtigt, dab nieht nur sehnellproliferierendes normales Mausergewebe, sondern aueh das Gewebe maligner Tumoren dureh einen relativ erh6hten Anteil yon S- und (G 2 _c M)-Phasenzellen eharakterisiert ist. Tumorgewebe zeichnet sieh ja i~ der gegel dutch eine vergleiehsweise erh6hte proliferative Aktivit/~t aus. Dariiber hinaus linden sieh in Tumorzellpopulationen oft aueh hyperdiploide und polyploide Zellen.

Arbeitsweise des Impulscytophotometers In der Durchflugkammer sendet jede Zelle bei Auflichtbeleuchtung (Ploem, 1967) beim Passieren der MeBstelle ein Fluorescenzliehtsignal aus, dessen H6he bei geeigneter Vorbehandlung und Fluorochromierung der in der Zelle vorhandenen DNS-Menge proportional ist. Die auf diese Weise erhaltenen HS~ufigkeitsverteilungen der DNS-Menge pro Zellkern werden yon einem X-Y-Schreiber automatisch als Histogramme aufgezeichnet. Auf der Abszisse dieser Histogramme sind die maximale FluoreseenzintensitS~t/Zelle und auf der Ordinate die Anzahl der Zellen/Kanal in linearem MaBstab aufgetragen.

Das einparametrige Histogramm Der Informationsgehalt eines einparametrigen DNS-HisCogramms soll anhand eines Schemas (Abb. 5) erl~utert werden. Dieses Schema bezieht sieh auf eine einheitliche, aus gleichen Stammzellen hervorgegangene Zellpopulation. Auf der Abszisse ist die DNS-Menge pro Zelle in Picogramm ersichtlich. Diese ist proportional der relativen Fluorescenzintensitii,t und iiberdies der Nummer des Kanals des benutzten Vielkanalanalysators, in dem die Anzahl der Ze|len mit der jeweiligen Fluorescenzintensit~t gespeiehert wird. ,,]~" bedeutet dabei eine apparaturabh/ingige und fiberdies aueh yon der Fiirbung abh~ngige Proportionalit~tskonstante. Auf

Impulscytophotometrie des Vaginal-Cervicalsmears

603

f r r

:co "1-

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5

7

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14 15

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4c

D N S I Zelle in lag Nr.des Kanals ~ k I. Fluoreszenzintensit ~,

Abb. 5. DI~S-Mengenverteilungin einer asynchronen Zellpopulation (schematisch). Abszisse: DNS-Menge pro Zelle in Picogramm (pg). Diese ist einerseits proportional der Nummer des Kanals des benutzten Vielkanalanalysators (Proportionalit~tskonstante /c) und andererseits der Fluorescenzintensit~t der Zelle im MeBbereich. Ordinate: Relative H~ufigkeit der Zellen pro Kanal. Die Fl~cheninhalte yon GI, S und (G2d-M) sind proportional der relativen H~ufigkeit der GI-, S- und (G2-~M)-Phase-Zellen in der Gesamtpopulation

der Ordinate ist die relative H~ufigkeit der Zellen pro Kanal aufgetragen, d.h. yon Zellen, denen eine bestimmte SignalhShe entspricht. Abb. 5 zeigt eine zweigipflige H~ufigkeitsverteilung (Histogramm) mit einem (linken) Gipfel bei 7 pg und einem (rechten) Gipfel bei 14 pg DNS pro Zelle. Unter dem linken Oipfel verbirgt sich die durch Querschraffierung dargestellte, ann~hernd symmetrische tt/~ufigkeitsvcrteilung der G1-Phasenzellen, unter dem rechten Gipfel die etwa doppelt so breite H~ufigkeitsverteilungder (G2 + M)-Phase-Zellen. Wie das Schema ferner zeigt, werden diese beiden, arm~hernd symmetrischen H~ufigkeitsverteilungen iiberlagert yon der H~ufigkeitsverteilung der S-Phase-Zellen (nicht schraffiertes F1/~chenstiick). Das DNS-Histogramm einer cinheitlichen diploidcn Zellpopulation entsteht somit durch l)berlagerung des GI-, des S- und des (G2-]-M)-PhaseAnteils, deren Fl~chen den relativen tt~ufigkeiten der GI-, der S- und der (G2 + M)-Phase-Zellen in der Gesamtpopulation proportional sind. A. Material und Methoden Bei 1300 Frauen, die die poliklinische Sprechstunde der Univ.-Frauenklinik Miinster aufsuchten, wurden Abstriche yon der Portio und vom Cervicalkanal mit einem Wattest~behen, vereinzelt zus~tzlich mit einem Spatel, abgenommen und sowohl nach Papanicolaou gef~rbt als auch fiir die impulscytophotometrische DNS-Bestimmung vorbereitet. Von dem untersuchenden Arzt wurden die Wattest~bchen zun~chst in der iiblichen Weise zur F~rbung nach Papanicolaou atff einen Objekttr~ger abgestrichen. AnschlieBend wurden die St~bchen in ZentrifugenrShrchen gestellt, die einige Milliliter einer als DNase-Hemmer wirksamen 39

Arch. Gyn~k. Bd. 211

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G. Reiffenstuhl, E. Severin, W. Dittrich und W. G6hde:

Citratl6sung mit Antibioticum-Zusatz enthielten (1/10 molare Na-Citratl6sung, pH 7, mit Zusatz yon 50 mg Polymyxin B Jr 500 mg Myacin auf 1000,0), wodurch sowohl der Abbau der I)NS als auch das Bakterienwachstum gehemmt werden. Die R6hrchen werden zum Versand an das Institut ffir Strahlenbiologie der Universit~t Miinster mit einem Plastikst6psel verschlossen. In unfixierten Zellen bleibt die I)NS-Menge/Zelle in dieser L6sung bei Zimmertemperatur h6ehstens his zu 1 Tag lang, im Kfihlschrank jedoch bis zu 4 Tage fang unver~ndert. Zur Aufbereitung der Zellsuspensionen im Institut ffir Strahlenbiologie werden die Zellen yon den Wattest~bchen abgespfilt, sedimentiert, in Kochsalz-L6sung resuspendiert, in der zehnfaehen Menge 96%igen Alkohols bei - - 3 0 ~ fixiert und bis zur Messung gelagert. I)er Abbau der RibonucleinsKure erfolgt in RNaseL6sung (1 m g / m l A q u a bidest.). In dieser L6sung werden die fixierten Zellen fiir 30 min bei 37~ resuspendiert und erst dann mit Ethidiumbromide (0,1 mg/ml Aqua dest.) gef/~rbt. Ein anderer Tell des fixierten Materials wird vor der Fluorochromierung einer Pepsineinwirkung ausgesetzt, um eine etwa vorhandene extranuclegre Komponente der Fluoreseenz m6glichst auszusehalten. Dies gelingt nach einem Vorschlag yon Berkhan (1971) am einfaehsten dureh eine schonende Proteolyse mit Pepsin, wonach die Probe haupts~chlich nackte, kaum miteinander verklumpende Zellkerne enth~lt.

B. F / i r b u n g der Z e l l e n Die Fluorochromierung der I)IqS der Zellen wird auf zweierlei Art vorgenommen: 1. Mit dem yon Le Peqc und Paoletti (1967) auf seine Bindungsfghigkeit an doppelstri~ngige Nucleinsi~uren genauer untersuchten Ethidiumbromid (i)ittrich und GShde, 1969) oder 2. mit Acriflavin (Feulgen-Fluorescenz-Fgrbung nach Prenna, 1966).

1. Ethidiumbromid-F~irbung ])as Ethidiumbromid (2,7 I)iamino-10 gthyl-9-phenylphenaritridinum-bromid) binder sieh nach Le Peqc und Paoletti (1967) an zweistr~ngigen Nucleins~uren (fadenfSrmige Nucleinsguremolekfile, deren Windungen eine ,,Wendel" aufbauen in Form einer I)oppelhelix im Sinne des Watson-Crick-Modells), und zwar an DNS und RNS, wobei sich seine Fluorescenzeigenschaften erheblich verbessern. Wiinseht man nicht die Gesamtmenge der doppelstrgngigen l~ucleinsiiuren, sondern nur den I)NS-Gehalt der Zelle zu bestimmen, dann kann der RNS-Anteil vor der Messung eliminiert werden. Es werden zu diesem Zwecke die fiir I)NS-Messungen bestimmten Zellen zun~ichst mit RNase (0,1%ig bei 37~ fiir 1 Std) behandelt, wodurch es zur I)epolymerisierung der RNS kommt. Erst danach werden die Zellen mit Ethidiumbromid fluorochromiert, indem man sie fiir 30 rain bei 20 ~ C in eine LSsung yon Ethidiumbromid in Natriumeitratl6sung (1:20000) bringt, ausw~ischt und in NatriumcitratlSsung suspendiert.

2. Feulgen-Fgrbung Zu Kontrolluntersuchungen wird die Feulgen-Fluoreseenz-F/irbung mit Acriflavin vorgenommen, da die Feulgen-F/irbung immer noch als Standardmethode zum quantitativen l~achweis der I)NS in Zellen gilt. I)ie F~irbetechnik ist ausfiihrlich beschrieben bei Prerma (1964). Protein/drbung. Soll neben dem I)NS-Gehalt auch der Protein-Gehalt der Zellen bestimmt werden, karm das Zellprotein zusiitzlich, z.B. mit den in der Immunfluorescenztechnik gebri~uchlichen Farbstoffen I)ANS oder FITC fluoro.

Impulseytophotometrie des Vaginal-Cervicalsmears

605

Kanal ( rel. Fluoreszenzintensitiit) I

5000

cco

~po

j

40o

2500 -

C

_e N

2~

,c

8~

Abb. 6. DNS-Histogramm des hyperdiploiden Ehrlieh-Aseitestumors der Maus (Linie Soeld) 54 Std naeh einer RSntgenbestrahlung mit der Dosis 3000 1~

chromiert werden. Mit Hilfe der genannten beiden Fluorochrome Ethidiumbromide und DANS oder FITC ist die gleichzeitige Erfassung yon 2 Parametern, n~mlich yon DNS und yon Protein in derselben Zelle mSglich. Mau bestimmt dami$ insbesondere auch das DNS-Proteinverh~ltnis in jeder einzelnen Zelle (Dittrich u.a., 1971). Sollen absolute Werte des DNS- oder des Proteingehaltes mit Hilfe der Fluorescenzmethode gemessen werden, so kann man der zu messenden Zellsuspension ,,Referenzzellen" mit bekanntem Nueleins~ure- bzw. Protein-Gehalt beimengen (z.B. Vogelerythroeyten). Als DNS-Referenz eignen sieh aber auch noeh Zellen yon Impftumoren. Abb. 6 zeigt das DNS-Histogramm yon 30000 hyperdiploiden Ehrlich-Aseitestumorzellen (strahlenresistente Linie Soeld), 54 h nach RSntgenbestrahlung der Zellen mit einer Dosis yon 3 000 r. Neben einer kleinen Gruppe diploider G 1-Phasezellen (2c) und tetraploider Zellen (8c) weist diese Population praktisch fast nur G2-Phasezellen auf. Die Mitose, d.h. die Neuentstehung yon G1-Phasezellen ist dureh die Bestrahlung bis zu diesem Zeitpunkt blockiert. Das Material eignet sieh gut als DNS-l~eferenz, weil diese Zellpopulation einen sehr stark betonten (G2 ~ M)Gipfel bei 18 pg DNS/Zelle aufweist.

C. Messungen Die Messungen wurden mit dem Impulscythophotometer vorgenommen, das im Xnstitut ffir Strahlenbiologie der Universit~t Mfinster entwickelt und gebaut worden war. Die Melltechnik ist an anderer Stelle ausffihrlich publiziert (Dittrich und G5hde, 1969, 1970). Trotzdem sei auf sie zum besseren Verst~ndnis fiir den Kliniker hier nochmals kurz eingegangen. Das Wesentliche des neuartigen MeBverfahrens besteht darin, dab die Zellen in Suspension parallel zur optischen Aehse dureh den Sch~,rfetiefenbereieh eines Mikroskopobjektivs bewegt werden. Jede Zelle sender im Auflicht (Ploem, 1967) beim Passieren dieser Mel3stelle ein Fluorescenzlichtsignal aus, dessen H6he bei geeigneter Vorbereitung des Materials, 39*

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G. Reiffenstuhl, E. Severin, W. Dittrich und W. GShde:

z.B. Pepsinierung und Fluorochromierung der DNS-Menge/Zelle proportional ist. Mit geeigneten elektronischen Mitteln (Sekund~relektronenvervielfacher, Verstgrker, Peak-Detektor, Vielkanalanalysator mit 400 Kaniilen) werden die Fluorescenzlichtsignale in elektrisehe Signale umgewandelt und nach ihrer maximalen HShe geordnet gespeichert. Mit Hilfe zusi~tzlicher elektronischer Mittel wird der grSBte Tell der Zufallskoinzidenzen eliminiert, so dab nur, soweit vorhanden, echte Zelloder Zellkern-Verklumpungen registriert werden. Die auf diese Weise erhaltenen Hgufigkeitsverteilungen der DNS-Menge werden von einem X-Y-Schreiber automatisch als Histogramme aufgezeichnet. Auf der Abszisse dieser Histogramme sind die maximale Fluoreseenzintensit~t pro Zelle (nach EB-F~rbung oder FeulgenFluoct~romierung) und auf der Ordinate die Hgufigkeiten der Zellen/Kanal linear aufgetragen. Fiir ein gut lesbares, d.h. ausreichend ,,glattes" I-Iistogramm werden jeweils 20000 bis 100000 Zellen ben6tigt, bei einer Mel]rate von fiber 1000 Ze|len pro Sekunde im DurehfluB.

D. Ergebnisse AuffiUligkeiten der einparametrigen Histogramme yon Cervicalund Vaginalsmears

1. Frauen im Senium Die Abb. 7A zeigt das E B - t t i s t o g r a m m des Portioabstriehs einer Frau nach E i n t r e t e n der Menopause. Zu erkennen ist zuniiehst ein hoher Berg, dessen Gipfel-Abszisse dem diploiden DNS-Gehalt ruhender KSrperzellen (G1- Stadium-~- 2 c) entsprieht, wie Vergleiehsmessungen mit zugemisehten Referenzzellen ergeben haben. Ferner entspricht ein erheblich kleinerer Gipfel bei der doppelten Fluorescenzintensit~t Zellen mit dem doppelten D N S - W e r t (G 2 - S t a d i u m : 4 c). Nicht sicher auszuschlieBen ist, dal3 diesem kleineren Berg der Abb. 7A in geringerem Umfang auch Gruppen yon jeweils zwei aneinanderh~ngenden G 1Phasezellen zugeordnet sind. 2. Geschlechtsrei/e Frauen Die Abb. 7B und C zeigen je ein E B - H i s t o g r a m m intakter fixierter Zellen von Frauen in gesehlechtsreifem Alter ohne Anhalt fiir das Vorliegen einer bSsartigen Erkrankung. Auffallend ist bei diesen Histogrammen ein neben dem 2 c-Gipfel Iiegender, unterschiedlieh hoher und yon diesem 2 c-Gipfel sieh deutlich abhebender zweiter Gipfel mit einem Abszissenwert zwischen 2 c und 4 c. Histogramme dieses Typs werden hiiufig bei gesunden geschlechtsreifen Frauen beobaehtet. Wie Untersuchungen an mehr als 1300 Frauen gezeigt haben, ergibt die Impulscytophotometrie der Cervical- und Vaginalsmears bei etwa jeder dritten geschleehtsreifen Frau ein E B - H i s t o g r a m m mit nur einem einzigen hohen Gipfel. Er entspricht zumeist dem 2 c-Wert, kann abet aueh zwischen dem 2 c- und 4 c-Wert normaler diploider menschlicher KSrperzetlen liegen (Abb. 7D). I n dieser Abbildung ist ein zweiter

Impulseytophotometrie des Vaginal-Cerviealsmears ~c 1000

4r

i

500-

0

607

23000 Zellefl

/ ',

i

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1 I

I I

100 20o 3oo Kanal rel. Fluoreszenzintensittit --:"

Abb. 7A D. I-Iistogramme der Zellen von Portioabstrichen. Fs mit Ethidiumbromid naeh Vorbehandlung mit l~Nase. A 67j~hrige Patientin (25 Jahre naeh Eintritt der Menopause). B 36j~hrige Patientin (26 Tage nach der letzten Regel nach Einnahme yon Ovulationshemmern). C 33j~hrige Patientin (3 Woehen naeh der letzten Regel nach Einnahme von Ovulationshemmern). D 48j~hrige Patientin (20 Tage nach der letzten Regel) (mit Ehrlieh-Aseitestumor-Zellen als Referenz). Abszisse: Relative Fluorescenzintensit~t entspreehend dem DNSGehalt pro Zelle, Ordinate: Anzahl der Zellen mit gleiehem DNS-Gehalt pro Kanal

kleinerer Gipfel rechts v o n 4 c zu erkennen. E r entspricht Fluorescenzsignalen y o n Ehrlich-M/iuse-Ascites-Tumorzellen, die als Referenzzellen der Zellsuspension vor der EB-F/~rbung beigemischt worden waren. Der Abzissenwert dieses ,,Referenz"-Gipfels entspricht, wie oben bereits erw/~hnt, einem D N S - G e h a l t y o n 18 pg D N S pro Zelle, w/~hrend der DlqS-Gehalt einer normalen menschlichen KSrperzelle in der G 1-Phase bei ann/~hernd 7 pg DNS/Zelle liegt.

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3. Besonderheiten Es sei hier ferner darauf hingewiesen, dab die Fluorescenz einer mehr oder minder starken Auflagerung yon DSderleinsehen Scheidenbakterien auf den Epithelzellen eine leichte Rechtsverschiebung und Verbreiterung Mler Gipfel hervorrufen kann. Als weitere Besonderheit der EB-ttistogramme ist eine hi~ufig bei Fluor (besonders im Senium) auftretende hyperbelKhnliche Verteilungskurve kleinerer Fluorescenzsignale zu erw~hnen, die yon Bruchstficken autolytiseher Zellen ausgel6st werden (vgl. Abb. 7A, ganz links). In diesen kleinen Signalen k6nnen auch Signale einer etwa vorhandenen Spermienbeimengung versteckt sein, da die haploiden SamenfKden bei der EB-Technik aus verschiedenen Grfinden, auf die bier nicht n~her eingegangen werden soil, nicht ihrer DNS-Menge proportionale, sondern etwas kleinere Fluorescenzlichtsignale liefern, als sie der DNS-Menge haploider Zellen entspricht. 4. ExtranucleSre Fluorescenz

Die Feulgen-F~rbung yon Vaginalzellen gesehlechtsreifer Frauen ffihrte zu ~hnlichen t{istogrammen +vie die EB-Fiirbung. Messungen yon Einzelzelien ergaben, dab die Fluorescenzsignale aller Zellkerne des normalen Vaginalepithels, d.h. ffir Basal-, Parabasal-, Intermedi~r- und Superficial-Zellen in der G1-Phase anni~hernd gleich hoch sind. Darfiber hinaus wurde in Ausstrichpri~paraten beobachtet, da]~ auch der Zelleib in einem gewissen AusmaB fluoresciert, und zwar sowohl nach Fluorochromierung mit EB als auch nach einer Feulgen-Fluorochromierung des Abstrichmaterials mit Acrfflavin. Demnach wird im Histogramm des Zellabstrichs junger Frauen mit unauff&lliger Portio der G1-Gipfel yon MeBsignalen gebildet, die der DNS-Menge der einzelnen Zellkerne entsprechen. Die MeBsignale des oft beobachteten Gipfels zwischen 2 c und 4c bestehen aus jeweils 2Anteilen: dem DNS-Gehalt des Zellkerns einerseits und dem extranucleKren Fluorescenzanteil andererseits. Diese zus~tzliche Fluorescenzkomponente kann aber nicht etwa auf eine Fluorochromierung yon in Plasma befindlicher RNS zurfickgefiihrt werden, da stets eine RNase-Vorbehandlung des MateriMs vorausgegangen war, womit die RNS herausgelSst wurde, vielmehr beruht die extranuclehre Fluorescenz auf anderen, biochemisch noch nicht endgfiltig identifizierten fluorochromierbaren Substanzen im Zellplasma (Ni~heres s. Punkt 6). 5. Nucle~irer DNS-Gehalt Mit l%ficksicht auf eine m6gliche Unterscheidung des ,,normalen" Abstrichs yon Tumorzell-Abstrichen interessiert in hohem Ma6e der nucleSre DNS-Gehalt der Zelie. Er l&13tsich deutlich erfassen, sobMd die extranucle~re Komponente der Fluorescenz ausgeschaltet ist. Dies

ImpulscytophotomeSriedes Vaginal-Cervicalsmears

:I_A I

I

1

I 100

609

I

20000 Zellen

I 200

I 300

Kanal

rel. Fluoreszenzintensit~it

Abb. 8A--C. A ,,DNS"-Histogramm einer gesunden gesehleehtsreifen Frau, Feulgen-F~rbung. B Derselbe Fall, EB-~/s nach RNS-Verdauung. C Der-

selbe Fall, EB-F/~rbung nach schonenderProteolyse des Zellplasmas mit Pepsin erreicht man, wie bereits erw/ihnt, naeh einem Vorschlag yon Berkhan (1971) durch sehonende Proteolyse des Plasmaproteins mit Pepsin, wonach nur fast naekte Zellkerne zuriiekbleiben. Die folgenden Histogramme der Abb. 8 demonstrieren das Gesagte: Von einer Patientin im gesehlechtsreifen Alter wurde das fixierte, suspendierte Abstriehmateldal in 3 gleiehe Teile aufgeteil~. Ein Tefl wurde mit Feulgen-Aeriflavin gef/~rbt (Abb. 8A), ein weiterer Teil wurde naeh RNS-Verdauung mit EB gef/~rbt (Abb. 8B), der dritte Tell des Materials wurde naeh schonender Proteolyse mit Pepsin mit EB fluorochromiert (Abb. 8C). Die Feulgen-F/~rbung (Abb. 8A) zeigt 2 im Vergleieh zur EB-F/~rbung (Abb. 8B) deutliehe verbreiterte Gipfel bzw. Berge, was offenbar dureh die der Feulgen-Methode anhaftende Ungenauigkeit bedingt ist. Je breiter bei gleiehem Ausgangsmaterial die ,,Berge" sind, um so unsieherer ist die Messung (die Feulgen-Fluoroehromierung ist wegen dieser EinbuBe an Mel~genauigkeit fiir die praktisehe DNS-Bestimmung daher weniger gut geeignet als die EB-F/~rbung, selbst wenn man yon der relativ grSSeren teehnischen Aufwendigkeit des Feulgen-Verfahrens absieht). Der erste Berg in Abb. 8A und B entsprieht den Zellen in der G1-Phase mit vorwiegend nuele/~rem DNS-Gehlat, der zweite Berg Zellen mit einer zus/~tzlichen extranuele/~ren Fluorescenz.

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Mit der EB-F~rbung Abb. 8B wurde eine vergleiehsweise grSl3ere MeBgenauigkeit erreicht, was dureh den wesentlieh sehs G1-Gipfel, der dem DNS-Gehalt des Zellkernes entsprieht, zum Ausdruek kommt. Naeh sehonender Proteolyse des Zellplasm~s mit Pepsin (Abb. 8C) bleiben nut die ,,nackten" Zellkerne erhalten. Naeh ansehliel3ender Fluoroehromierung ist die extranucle~re Fluorescenz weitgehend ausgesehaltet. Die EB-Histogramme yon Populationen ,,nackter" Zellkerne zeigen daher keine Nebengipfel mehr. Der seh~ff begrenzte Hauptgipfel ver/~ndert dabei seine Lage nicht. 6. Ursachen der extranucleiiren Fluorescenz

Um die Ursache der extranuele/~ren Fluorescenz genauer zu ermitteln, grit es also zun~chst, wie bereits erw~hnt, den EinfluB der im Plasma und im Zellkern enthaltenen RNS auszuscha]ten. Es erfolgen daher Messungen stets nach vorangegangener RNase-Einwirkung. Dadurch wurde die H6he des Mel3signals um die der RNS-Komponente verringert. Zus/itzlieh wurden folgende weitere Untersuchungen durehge~fihrt: 1. Nach einstfindiger Behandlung der Epithelzellen mit DNase in Veronalpuffer (1 mg/ml bei p H 7, 37 ~ C, Ca ++ und Mg ++) zeigten die EB-Histogramme einen stark naeh links versehobenen ersten Gip~el (Abb. 9B), dessen Abszissenwert stets kleiner oder gleieh der Differenz 2c

4c

1000

A

500

9. .

50000 Zeller

0

'1 ol/ 1000

f

5os

~

loo

I

200

3o0 Kanal

rel. Fluoreszenzintensitw "-~

Abb. 9 A u. B. A Normales EB-Histogramm (nach Vorbehandlung mit RNase) einer gesunden Frau im geschlechtsreifen Alter. B EB-Histogramm des gleichen Abstrichmaterials nach Vorbehandlung mit RNase und DNase

Impulscytophotometriedes Vaginal-Cervicalsmears

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zwischen den Abszissenwerten der in der Vergleichsprobe noch vorhanden Doppelgipfel war (Abb. 9A). Eine Fluorescenz des Zelleibes war somit auch nach dem Abbau der gesamten DNS der Zelle noeh nachweisbar. 2. Nach 1/s Einwirkung yon ~-Amylase auf Zellen yon Abstrichen jiingerer Frauen verschwand in einigen F/~llen der Zwischengipfel im EB-tIistogramm. Aus diesen Ergebnissen folgt, da$ die extranucle/~re Komponente der EB- und Feulgen-Fluorescenz - - wenn fiberhaupt - - nur in geringem Ausmal3 auf einen Gehalt des Zellplasma an DNS beruhen kann, wobei diese z.B. dureh Karyorhexis und Karyolyse in das Zellplasma yon G2-Phase-Zellen gelangt sein kSnnte. M5glieherweise ist die extranuele/~re Komponente der Fluorescenz durch die Anwesenheit yon Glykogen (uneigentliches PAS-positives Material), das yon ~-Amylase angegriffen wird, oder aber aueh durch eigentliehes PAS-positives Material (Pundel, 1966) bedingt.

7. DNS-Histogramm beim Carcinom Die bisherigen Er5rterungen lassen erwarten, dab das einparametrige EB- oder Feulgen-Histogramm der ,,naekten Kerne" des Vaginal- und Cervicalsmears geeignet ist, das bekannte irregul/~re DNS-Verteflungsmuster in Tumorzellpopulationen aufzuzeigen, vor allem dann, wenn wie bei gezielter Abnahme - - das pathologische Zellmaterial iiberwiegt. Abb. 10 zeigt exemplarisch ein charakteristisches Pepsin-EBtIistogramm dieses Typs, das Abstrichmaterial stammt yon einem Carcinoma eolli uteri. Man erkennt in diesem Histogramm neben dem steflen G1-Gipfel beim Abszissenwert 100 im Vergleich zum Normalhistogramm (z. B. Abb. 8C) einen stark erhShten (G2-~ M)-Gipfel beim Abszissenwert 200. Die beiden Abszissenwerte verhalten sieh wie 1:2 gems der theoretischen Erwartung. Eine weitere, ffir sich allein jedoeh unspezifische Besonderheit des Histogramms der Abb. 10 liegt darin, dal~ die Histogrammkurve nicht dureh den Nullpunkt des Koordinatensystems geht, sondern die Ordinate bei einem hohen positiven Wer~ schneider. (Dieser erste Anfangsteil der Histogrammkurve ist in Abb. 10 aus teehnisehen Grfinden nicht ganz dargestellt, sie beginnt in HShe der Ordinate 250.) Wie bei der ErSrterung der Abb. 7A n/~her ausgefiihrt, beschreibt diese ,,Zerfallshyperbel" den Autolysevorgang, bei dem auch Zellbruchstiieke mit sehr kleiner SignalhShe entstehen. Es sei hier darauf hingewiesen, daI~ besonders oft bei exophytisehen Tumoren Zellzerfall und teilweise Verklumpung der Bruchstiicke eharakteristisehe Einzelheiten der intakten Tumorzellpopulation verwischen kSnnen. Die an sich charakteristisehen Ziige des einparametrigen DNS-Histogramms -

-

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G. Reiffenstuhl,E. Severin, W. Dibtrich und W. GShde: ,50O

2C

4C

18000 Zellen ~" 250 0

N

0 100

200

300

Kanal

rei. Fluoreszenzintensit~it

--~

Abb. 10. DNS-Histogramm eines Carcinoma colli uteri (schonende Proteolyse mit Pepsin und EB-Fluoroehromierung)

yon Tumorzellpopulationen kSnnen jedoeh auch dadurch etwas verwischt werden, dab dem Abstrichmaterial ein hoher Anteil normaler Epithelzellen und Leukocyten beigemischt ist. An dem Problem, die Leukocytenkomponente und die normale Epithelzellen-Komponente yon den Tumorzellen ganz abzugrenzen, wird gearbeitet. E. Diskussion

Die bisher iibliche Cytophotometrie (Absorptions- und Fluorescenzcytophotometrie an Ausstrichpr/~paraten) erfaBt wegen der geringen MeBgeschwindigkeit je Ger/~t nur zwischen 20 und 150 Zellen pro Tag in einer kleinen Auswahl von Abstrichen und bietet deshalb ffir ein automatisches Prescreening von Vaginal- und Carvicalabstrichen keinerlei MSglichkeiten. Mit der neuentwickelten Impusleytophotomctrie im DurchfluB gelingt es hingegen nicht nur, die MeBgeschwindigkeit auf alas mehr als Hunderttausendfache zu steigern, sondern auch die Mel]genauigkeit sehr wesentlich zu erhShen. Einige in der Literatur ver6ffentlichte Histogramme des mensehlichen Vaginal- und Cerviealepithels zeigen einen gegeniiber den zumeist als Referenz benutzten Lymphocyten mehr oder minder stark erhShten ,,DNS-Gehalt" der Epithelzellen (0. Caspersson, 1964; Atkin, 1964; Sandritter u.a., 1966; ttrushovetz, 1969). Der erhShte ,,DNS-Gehalt" des Vaginalepithels bei diesen Untersuchungen k6nnte durch eine extranucle/ire PAS-positive Komponente vorget~uscht sein. Diese wird nach Feulgen-F/~rbung ebenso wie nach EB-F/~rbung beobaehtet (GShde u.a., 1971). Pundels (1966) sorgfi~ltige Untersuchungen ergaben, dab mit der

Impulscytophotometrie des Vaginal-Cervicalsmears

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standardisierten PAS-Technik (Feulgen-F~rbung) nieht nur die DNS, sondern aueh im Vaginalepithel vorkommende Polysaecharide, z.B. Glykogen, ebenso wie Mucopolysaeeharide und Mucoproteine errant werden. Auf die Richtigkeit dieser Befunde sell noeh weiter unten eingegangen werden. Eigene Untersuehungen an fiber 1300 Vaginal- und Cerviealsmear. proben, bei denen jeweils 20000 bis 100000 Einzelzellen nach EB- und Feulgen-F/~rbung mit dem Impulscytophotometer gemessen wurden, zeigten folgende Auff~lligkeiten der tIistogramme : Die EB-Histogramme der Frauen nach Eintritt der Menopause stimmen weitgehend iiberein mit den DNS-Verteilungen in Zellen m~[~ig oder nicht proliferierender Gewebe, z.B. in Hautzellen (Schumann u.a., 1970) und Blutzellen (Bfichner u.a., 1971). Bei den mehrgipfeligen Histogrammen geschlechtsreiler Frauen entsprioht der erste ([inke) der beiden Gipfel dem DNS-Wert diploider KSrperzellen im G1-Stadium, wie Vergleiehsmessungen mit Referenzzellen ergeben haben. UnseresEraehtens stammen die Fluorescenzsignale, die diesen ersten Berg aufbauen, tefls yon Leukoeyten, die in der Mehrzahl der Abstriche zahlreich vorkommen, tefls yon Epithelzellen. Die Abszisse des zweiten (rechten) als Zwisehengipfel bezeiehneten Gipfels liegt zwisehen dem einfachen und doppelten Abszissenwert des ersten Gipfels. Die H6he des Zwisehengipfels und seine relative Lage zum ersten Gipfel (G1-Gipfel) sind yon Fall zu Fall sehr untersehiedlieh. Der Zwisehengipfel liegt in der Regel nahe beim G1-Gipfel. Er wurde nur selten naeh der Menopause beobaehtet, wobei ~ltere Patientinnen, die aus irgendwelchen Grfinden unter Oestrogeneinwirkung stehen, Ausnahmen darstellen k6nnen. Die Impulseytophotometrie des Smears jfingerer gesehleehtsreifer Frauen ergab in etwa 1/3 der F~lte ein eingipfliges Histogramm. Dieser eine Berg entspricht dann h~ufig dem ,,Zwisehengipfel" und nieht dem G1-Gipfel, wie Messungen naeh Beimisehung yon Referenzzellen zur Probe ergeben haben (vgl. Abb. 7 D). Manehmal jedoch - - n~mlieh bei Frauen mit den klinisehen Symptomen einer Ovarialinsuffizienz - - entsprieht er offensichtlich dem DNS-Gehalt normaler euploider Zellen (2 c-Wert). Gegen die Interpretation bisher ver6ffentlichter ,,DNS-Histogramme" naeh Feulgen-F~rbung, wonaeh Vaginalepithelzellen einen erhShten DNSGehalt aufweisen sollen, ergeben sieh naeh unseren Untersuehungen sehwerwiegende Bedenken. Die DlqS-Menge entspreehend der Fluorescenzintensit~t naeh EB- und Feulgen-F6rbung erweist sieh fiir ,,naekte" Zellkerne des ,,normalen" Cervical- und Vaginalepithels (nach schonender Proteolyse des Zellplasmas mit Pepsin) als ann~hernd gleich der DNS-Menge von Lymphocyten. Ein gegenfiber dem normalen Gl-Wert

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erhShter DNS-Gehalt intakter Zellen ~ird vielmehr dureh eine fluorescierende Substanz im Zellplasma bestimmter Zellen vorget&uscht, deren Fluorescenzsignale sieh den Fluoreseenzsignalen der nuclearen DNS fiberlagern und die fiir das Auftreten eines ,,Zwisehengipfels" verantwortlich sind. Wie die Ergebnisse nach einer Vorbehandlung der Epithelzelle mit DNase zeigen, ist die eytoplasmatische Fluoreseenz - - wenn fiberhaupt - - nur in geringem Ausma8 dureh DNS verursacht, ebensowenig wie durch RNS, wie Vergleiehsmessungen nach und ohne RNaseVorbehandlung beweisen. Hingegen spreehen Untersuchungen, in denen es gelang, die fluorescierenden eytoplasmatisehen Substanzen mit Amylase teilweise abzubauen und damit gleichzeitig auch die eytoplasmatische Fluoreseenz zu reduzieren, ebenso wie die Hormonabh&ngigkeit des Zwischengepfels dafiir, dab der Zwischengipfel dureh das Glykogen der Epithelzellen mitbedingt sein kSnnte. Dabei w~re allerdings zu bedenken, da~ sieh das Zellmaterial vor und naeh der AlkoholFixierung ffir l~ngere Zeit in w~Briger Suspension befindet und das Glykogen unter diesen Bedingungen leieht in LSsung zu gehen pflegt. Andererseits kSnnte wiederum dureh die Alkohol-Fixierung eine Xnderung der LSsliehkeit des an Protein gebundenen Glykogens (Stoll u.a., 1954) stattgefunden haben. Sehliel]lich l~St sich nieht aussehliel~en, da~ das eigentliehe PAS-positive Material (Pundel, 1966) an der cytoplasmatischen Fluoreseenz beteiligt ist. Ftir die eytologisehe, impulscytophotometrische Krebsdiagnostik w~re es wiinschenswert, die extranueles Komponente der Fluorescenz als solehe zu erfassen oder aber sie ganz zu eliminieren, etwa dutch sehonende Proteolyse des gesamten Cytoplasmas mit Pepsin. Es steht n~mlieh zu erwarten, dab im Krebsgewebe S-Phase- und auch aneuploide Zellen auftreten, deren Fluoreseenzsignale sieh im ,,Zwischengipfe]" (z. B. Abb. 7C) einparametriger Histogramme verbergen kSnnten und die dann der diagnostisehen Bewertung unzug&nglich blieben. Am Beispiel eines Carcinoma colli uteri wurde gezeigt (Abb. 10), dal~ eharakteristische Besonderheiten der DNS-Verteilung in Tumorzellpopulationen - - i m speziellen Fall die bedeutende Vermehrung des (G2 d-M)t~hase-Anteils - - im Pepsin-EB-Histogramm deutlich zu erkennen sind, wenn das yore entarteten Gewebe stammende gezielt entnommene Abstrichmaterial nicht mit relativ gro~en Mengen normaler Vaginalepithelzellen und Leukoeyten vermengt ist. Selbst in solchen F~llen besteht jedoch die begrtindete Erwartung nach Auswahl weiterer geeigneter Parameter, zu denen u.a. das Gesamtprotein der Zelle gehSrt, den Tumorzellanteil im mehrparametrigen Histogramm als solchen zu identifizieren (Dittrich etal., 1971) und damit die Automation des Presereening mit Hilfe der Impulscytophotometrie in greifbare N~he zu rfieken.

Impulseytophotometrie des Vaginal-Cervicalsmears

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