Zeitschrift ffir Krebsforschung 66, 155--164 (1964)

Aus dem Physiologisch-Chemischen Institut der Universit~t Hamburg (Direktor: Prof. Dr: J. KOtlXAU)

Die Schutzwirkung des Nicotinsiiureamid auf die strahlenbedingte Schiidigung der DNS-Synthese als Zellpopulationsproblem* * * Von H. HILZ u n d H. BERNDT Mit 2 Textabbildungen (Eingegangen am 14. November 1963) Die S c h u t z w i r k u n g y o n Nicotins~tureamid auf die Glykolyse, dig sigh bei Einw i r k u n g y o n X t h y l e n i m i n e n , R 6 n t g e n s t r a h l e n u n d organischen P e r o x y d e n auf A s c i t e s t u m o r e n d e m o n s t r i e r e n 1/~13t, b e r u h t auf einer V e r h i n d e r u n g des D P N Abfalls. U n t e r s u c h u n g e n unseres Arbeitskreises zeigten, da]3 auch die Schs der D N S - S y n t h e s e durch ionisierende Strahlen m i t N i c o t i n a m i d partiell oder gs v e r h i n d e r t w e r d e n k a n n (ttlLZ, GossL]~I~, OLDEKOI" U. SCI~OLZ; HILZ, HV]3MAI~I~, OI~D]~KOr, ScizoLz u. GOSSL~t~). Well jedoch die Syn~hese der Desoxyribonucleinsi~ure n u r a n einem b e s t i m m t e n A b s c h n i t t der I n t e r p h a s e (SPeriode, vgl. LAJTI~A) erfolgt u n d somit i n einer n i c h t - s y n c h r o n w a c h s e n d e n P o p u l a t i o n i m m e r n u r ein b e s t i m m t e r Prozentsatz der Zellen a k t i v D N S synthetisiert, schien eine genauere U n t e r s u c h t m g fiber den Mechanismus der D N S - S y n theseschi~digung angebracht. Methodik Die gleichzeitige Bestimmung yon Atmung, Gtykoly~e, DPN-Gehalt, DNS- und Proteinsynthese in einem Ansatz. Durch eine Erweiterung der yon WAI~BVl~Gentwickelten Ein-Gef~iL Methode ist es gelungen, alle erwghnten Parameter in einem Inkubationsansatz zu ermittelu. Dazu wurden 1,60 ml einer bes~rahlten oder nicht-bestrahlten Suspension yon EhrlichAscitestumorzellen (0,10 ml Ze]len) in Warburg-Spezialgef~i3en mi~ 0,40 ml einer LSsung inkubierL die 50/*M Glucose, 50 #M KHCOa, 1 #C 3H-Thymidin (spez. Aktivit~it 360 #C/#M) und 0,5 #C ltC-Leuein (spez. Aktivit~t 11 #C/#M) enthielt. Im grolten Seitenarm befanden sich ein Gemisch yon 2,55 ml 2 m KHC0s+0,45 ml 2 m K2C0 ~ und 2 mg Carboanhydrase (Sigma Chem., USA). Es erwies sich als vorteflhaft, die Gefi~13ekurz (1 rain) mit einem sehwachen Gass~rom aus O~/CO2 (95 v/5 v) zu begasen. Nach einer Inkubationszei~ yon 90 rain bei 370 mit I~egistrierung der Sauerstoffaufnahme wurden die Gef~13ein Eis abgek/ihl~, mit Hilfe von 2 • 0,5 ml isotonischer Sucrose in ein Zentrifugenglas mi~ eingeschliffener Pisbill iiberffihr~, mit 0,30 m170%iger tiClOa homogenisiert und zentrifugiert. Der Uberstand wurde mitGfestem KHCO3 neutralisiert und nach dem Zontrifugieren DPN-Gehalt und Lactatproduktion (Glykolyse) bestimmt. Der s~ureunlSsliche Niedersehlag wurde zweimM mit kMter 4%iger HC104 gewaschen mid in einem Zweikanalz~hler (Triearb der Fa. Packard Instruments) auf Tritium(DNS)- und laC(Protein)-Aktivit~Lt analysior~. Weitere Einzelheiten bei HILZ, HLAV/OAund BEI~TRAM. ' I Die Bestrahlung der Ze]lsuspensionen wurde in PetrisehMen bei ca. 4~ mit dem Therapietie~strahlger~ der Universit~ts-Frauenklinikvorgenommen. Die Autoradiographio wurde - - nach Inkubation der Zellen unter den oben erw~hnten Bedingungen - - in enger Anlehnung an die Vorschrift von ADAMIK(Druck der Fa. Schwartz * Herrn Prof. Dr. G. SC~V]~E~T?und Doz. Dr. It. ~V~AASS(Universit~ts-Frauenk]inik)sind wir ffir die Uberlassung der Bestrahlungseinriehtung sehr zu Dank verpflichtet. ** Der Deutschen Forsehuugsgemeinschaft und dem Ministerlum fiir Wissenscha~t und Forsehung danken wir fiir die groBzfigigeUnterstfitzung dieser Arbelt.

156

H. I-IILZmad H. BERNDT:

Bio Research, Orangeburg, USA) mit fliissiger Fotoemulsion (NTBs-Emulsion der Fa. Kodak, USA) und Entwicklung nach 5--14 Tagen durchgefiihrt.

I. Nicotins~iureamid und die gleichartige Sch~idigung verschiedener Sto~weehselgriiBen durch Riintgenstrahlen Vor allem die Untersuchungen von MAAss u. Mitarb. (vgl. MAASS; HOLzEL, MAASS u. K ~ E L ) haben gezeigt, dab bei Aseitestumoren versehiedene StoffweehselgrSBen wie DPN-Abfall, Glykolyserate, Proteinsynthese mit steigender Strahlendosis eine ~hnliehe Seh/~digung erfahren und dab die Atmung nur wenig betroffen wird. Da wir mit einem Ehrlieh-Asei~esearcinom arbeiteten, das sehon bei relativ niedrigen Strahlendosen starke Stoffwechselseh/~digungen zeigt, schien es zun/~ehst wiehtig, den Verlauf der Dosis-Wirkungs-Kurve ffir einige Parameter zu bestimmen. Der Einflug ionisierender Strahlen auf DPN-Gehalt, Glykolyserate, DNS- und Proteinsynthese in dem yon uns verwandten Ehrlich-Carcinom ergibt DosisWirkungs-Kurven, wie sie in Abb. 1 dargestellt sind. Auff/~llig ist die groge ]~hnlichkeit der Kurvenbflder. AuGer der Atmung zeigen alle Parameter einen steflen Anfangsteil, der bei h6heren Dosen in eine K u r v e gr6gerer Resistenz umbieg4 (vgl. auch LAJTIIA; 1VIAASS). Lediglieh die Glykolyse seheint diesen zweiten Absehnitt nicht oder hSehstens in sehr abgesehw/~chtem Mage zu besitzen, was sehon MAAss sowie K o c h und KL]~?mwbeobaehtet haben. Die Dosis, die zu einer 50 %igen Seh/tdigung ffihrt 1, liegt ffir DPN-Gehalt, Glykolyserate und DNS-Synthese - - gemessen als Einbau yon l~adiothymidin in die s/~ureunl6sIiehe Fraktion - - in einem ghnliehen Bereieh zwischen 2500 und 3500 r, w~hrend der Einbau yon marlderten Aminos~uren in die Proteinfraktion ers~ mit etwas h6heren S~rahlendosen zur Hglfte gehemmt wird. Die Sehutzwirkung yon Nicotinsgureamid auf Mle diese Parameter ist ebenfalls aus Abb. I ersichtlieh. Sie ist nicht absotut, ~ugert sich aber in der doeh wesentlieh grSgeren ,,Resistenz" der versehiedenen Stoffweehselgr6gen. Die Sauerstoffaufnahme der Tumorzellen zeigt - - mit und ohne Nicotins/~ureamid - - einen g/~nzlich anderen Verlauf der Dosis-Wirkungs-Kurve. Selbst naeh starker Bestrahlung ist nut eine geringf/igige t I e m m u n g zu beobaehten, die dutch die bier augewandte Nieotinamidkonzentration in keiner Weise beeinflugt wird. Die Verh/iltnisse gleiehen qualitativ durehaus denen beim Yoshida-Sarkom (M~ass) und denen naeh Einwirkung bestimmter alkylierender Cytostatika. Sie sind wohl nur im Sinne der von Bol~ST, GI~IMB]~I~G U. I-IOLZEI~sowie SC]3[i~r M ~ s s u. LOCHER erhobenen Befunde yon der gesistenz des mitochondrialen D P N zu deuten. Da abet 1. auch bei strahlenresistenteren Tnmorst~mmeu die Parallelitgt zwischen DPN-Verlust, I t e m m u n g der Glykolyse und der DNS-Synthese klar zutage tritt (HILz, MAASS, H6LZET,, HmScH-HoFF~A~N u. OLDEKOP); da 2. 1 Eine vergleichbare S~rahlenschadigung tritt bei verschiedenen Tumorst/immen mit ganz ungerschiedlichen Strahlendosen in Erscheinung (MA~ss; ttILZ, lVlx~ss, H6nz]~, tImsc~HOFFMANNU. 0LDEKOt'). SCAIFEland neuerdings bei Thymocyten der Ratge schon nach 25 r einen Abfa]l der DPN-Konzentration, w/~hrend die Thymocyten des Kaninchens keine derartige Schiidigung erkermen lielgen.

Die Schutzwirkung des Nicotins~tu'eamid

157

weiterhin auch bei Einsa~z yon bestimm~en Peroxyden in g~nz analoger Weise 1 eine gleichartige Schi~digung der erw~hnten Stoffwechselgr6Ben und der Schutze~fek~ des Nicotin~mid demonstriert werden kann (HILZ u. BErTrAM); da 3. sich ein an anderer Stelle besprochener Verdfinnungseffekt (HILZ, Hr,AWCA

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Abb. 1. ]Die A b h ~ n g ~ k e i t verschledener Stoffwechselparameter yon ~ler S~r~lendosis

u. BERCRA~) auf alas AusmaI] der Strahlensch~digung bei allen Parame~ern gleichms auswirkt; da 4. schliel]lieh auch Untersuchungen mit nicotinss Verbindungen Zusammenh~nge des Vitamins mit den verschiedenen 8toffwechselgr6fien offenkundig werden lieBen (Ha~z, HLAWCA u. ROa~]~R) ; lieg t die Vermutung nahe, dab der Beeintr/~chtigung der verschiedenen 1 N~oh den Befunden yon H6LZ~L am Yoshida-Sarkom und yon LIss u. PAIM~.am EldAscitescarcinom entf~lte~ Trenimon noch zus~zliche, durch Nicotinamid nich~ zu verhinderndo Wirkungen auf Protein- und DNS-Synthese. Z. Krebsforsch., Bd. 66 11

158

H. H~LZ und H. BE~NDT:

Parameter ein einheitlicher Mechanismus zugrunde liegt, ein l~eehanismus, der in naher Beziehung zu dem Verlust der geseh/idigten Zellen an (intracellul~rem) I~icotins/~ureamid steht. Die Schutzwirkung yon zugesetztem Nicotins/~ureamid li~l~t sieh auf diesem ttintergrund zwanglos als kfinstliche Restitution der normalen intraeellul~ren Nieotins/~ureamidkonzentration deuten (]~ILZ, HLAVICA U. Br.RTgAM; ItILZ u. BERTR~). Auch der DPN-Abfall bestrahlter Zellen l~Bt sich anf dieser Basis sehr einfach als Konsequenz einer De-Inhibierung der DPN'ase erkliiren (HILZ, HLAVIC~ u. BE~T~n~). Weniger klar sind die Zusammenh/inge zwisehen lqieotinamidverlust und Sehi~digung von Protein- und DNS-Synthese. Vor allem hinsichtlieh der DNS-Synthese ergibt sich ein weiteres Problem, das mit der niehtsynchron wachsenden Zellpopulation zusammenhi~ngt.

II. Die strahlenbedingte Hemmung der DNS-Synthese als Zellpopulationsproblem Bei der Stoffwechselsch/idigung einer Zellpopulation, die sich in einem nichtsynchronen W~chstum befindet, ergibt sich noch ein weiteres Problem, das besonders bezfiglieh der DNS-Synthese einer Kliirung bedaff, aber auch fiir die anderen StoffwechselgrSBen yon Bedeutung sein kann. Wie man aus Versuehen an synchronisierten Zellen weft] (vgl. LAJTH~; LAJTHA, OLIVE~ U. ELKS), wird die Verdoppetnng der Desoxyribonucleinsi~ure nut in einem bestimmten Zeitabsehnitt der Interphase, in der sog. S-Phase, gebfldet. Das bedeutet aber, dab in einer ungeordnet waehsenden, nieht-synehronisierten Zellpopulation mit Zellen in allen mSgliehen Wachstumsphasen immer nur eine begrenzte Anzahl von Zelten die Synthese yon Desoxyribonucleinsi~ure durchgeffihrt. Eine Sch/idigung der DNS-Synthese ist demnaeh immer nur an einem bestimmten Prozentsatz der Zellpopulation zu registrieren. Tats~chlich ergibt sieh bei der autoradiographischen Auswertung, dab sowohl in vivo wie auch unter unseren Inkubationsbedingungen hSehstens 35% der Zellen im Verlaufe einer einsttindigen Inkubation markiertes Thymidin in die DN S einbauen 1. Nun haben Untersuchungen an regenerierender Rattenleber ergeben, dal] bestimmte Stadien des Teilungscyelus besonders empfindlich auf Bestrahlung reagieren (vgl. BOLLVM, A~DE~EGG, MCELYA U. POTTE~). Die Hemmung der DNS-Synthese in einer Aseiteszellsuspension kSnnte demnaeh d~durch zustande kommen, dab nnr die Zellen in einem sensitiven Stadium gesch/~digt werden und der ganze Strahleneffekt auf die DNS-Synthese - - vielleieht aber aueh auf die anderen Parameter - - auf ein Populationsproblem hinausl~uft ~. Zwei MSgliehkeiten stehen demnaeh zur Debatte : 1. eine allgemeine Sch~digung der DNS-Synthese in allen Zellen, die sieh in der Syntheseperiode befinden. Sic sollte im autoradiographischen Test erkennbar sein an einer entspreehend geringeren Markierung (Ag-KSrner/Zelle) aller synthetisierenden Zellen. 2. eine (totale) Aussehaltung yon Zellen in einem besonders sensitiven TeL lungsstadium. Diese Art tier Seh~digung wfircle sich so darstellen, daI] ein entDie autoradiographische Methode effaBt naturgem~fi nur solche Zellen, deren Thymidineinb~u deut]ich fiber dem Nullwert liegt. Dies beding~ eine grbBere Ungen~uigkeit im Vergleich zur r~diochemischen Bestimmung. Dies gilt nur bei mi~tlerer Dosierung, wo unspezifisehe Sch~digungen noah nieht stark ins Gewieht fallen.

Die Schutzwirkung des Nicotins~ureamid

159

sprechender Prozentsatz an synthetisierenden Zellen fiberhaupt keine Markierung mehr erkennen lieSe (markierte Zellen/1000 gez/ihlte Zellen), w/ihrend die restlichen Zellen, die sieh zur Zeit der Bestrahlung in einer strahlenresistenteren Phase befanden, eine normale Intensitat der DNS-Synthese (Ag-KSrner/Zelle) aufweisen mfiBten. Zur Prfifung dieser MSglichkeiten analysierten wir mit der radioehemisehen und der autoradiographischen Methode die Sch/idigung der DNS-Synthese nach 5000 r (Tabelle 1). Auf Grund der radiochemisehen Bestimmung ergibt sieh (aus Tabelle 1. Analyse der D21S.SynthesescMidigung aus fiinf Versuchen zusammengefaBt. Die letzte Spalte gibt die prozentuale Hemmung mit der mi~tleren Abweichung an. Die Absohtwerte der Zellmarkierung unterliegen grSBeren Schwankungen, da die einzelnen Ascitesprgparationen ziemlich unterschiedliche Thymidineinbauraten zeigen (vgl. HI,z, MAASSet al.). In der Tabelle sind die Mittelwerte

Para~neter

No1~mal

~

(5000 r)

Differenz (• ~)

15590

--49390

71,6% •

Hemmung

Radiochemisch :

~. IpM der si~ureunlSslichenFraktion (0,1 ml Zellen) . . . . . . . .

64980

1,6

A utoradiographisch :

~) Ag-K6rner/markierte Zelle . b) Markierte Zellen/10a gez~hlte Zellen . . . . . . . . . . . c) ~ Ag-KSrner/10a gezahlte Zellen

61,7

44,2

--17,5

28,3% -4-11,2

133,0 8160

57,3 2530

--75,7 --5630

56,2% ~= 7,2 69,0% ~= 5,8

vier Versuchen) eine durehschnittliche Hemraung der DNS-Synthese zu 72% gegenfiber den Kontrollen. W/ire nun die erste MSglichkeit realisiert, dann mfiBte sieh die Inhibierung gleiehm/i6ig auf alle DNS-synthetisierenden Zellen erstrecken. Es sollten zwar genauso viele Zellen markiert sein wie in den ~qormalans/itzen (mark. Zellen/10 S gez/ihlte Zellen), die Intensit/it der Markierung (Ag-KSrner/ Zelle) aber urn 72% geringer sein als normal. Wie man der Tabelle entnehmen kann, ist dies aber keineswegs der Fall. Die Zellen, die naeh Bestrahlung noch DNS synthetisieren, zeigen im Durchsehnitt nur eine tun 28 % geringere Intensit/it des Thymidineinbaus als die Kontrollans/itze. Die zuerst erw/ihnte Seh/idigungsart erkl/irt demnaeh nur zum Tell die Wirkung der Strahlen auf die DNS-Synthese. Konsequenterweise muB daher der grSl~ere Teil der Inhibierung fiber eine totale Aussehaltung yon besonders sensitiven Zellen zustande kommen. Wie die Werte in Tabelle 1 zeigen, werden naeh Bestrahlung 56% der DNS-synthetisierenden Zellen total ausgesehaltet (markierte Zellen/10 S gez/ihlte Zellen). Eine einfache Rechnung zeigt, dab dureh die totale Ausschaltung yon 56 % der DNSsynthetisierenden Zellen 83 % der gesamten Seh/idigung erkl/irt werden kSnnen: In den bestrahlten Ans/itzen sinkt die Summe der Ag-KSrner pro 103 gez/ihlte Zellen um 5630 ab ( ~ Gesamtseh/~digung, Tabelle 1, Zefle e). Dureh totalen Ausfall yon 75,7 Zellen (Zeile b) mit einer durehsebnittliehen Ag-Kornzahl yon 61,7 wetden in den bestrahlten Ans/itzen 75,7 X 61,7 = 4 6 7 0 Ag-KSrner weniger registriert. Dies bedeutet aber, da ja die Gesamtseh/idigung einen ,,Verlus~" yon 5639 AgK5rner ausmaeht, einen Anteil yon 83 % an der Gesamtseh/idigung. Nur knapp 1/5 entf/illt somit auf die partielle Inhibierung der DNS-Synthese in den noch verbleibenden, DNS-synthetisierenden Zellen. DaB es sich hierbei in der Hauptsache ii*

160

H. Hmz und H. BV,R ~ :

tats~chlich u m eine partielle Inhibierung der DNS-Synthese in den resisten~eren ZeUen handelt, ergibt sich aus einer Analyse der Markierungsverteflung (Abb. 2 a). Kontrolle und bestrahlter Ansatz entspreehen in etwa einer Normalverteflung mit leichter Verzerrung zu hSheren Markierungswerten. Der durchschnittliche Markierungsgrad nach Bestrahlung zeigt aber eine klare Versehiebung nach niedrigeren Werten. Aus diesen Befunden geht somit hervor, dal~ die beiden oben formulierten Mechanismen wirksam sind, da~ aber die zuletzt erwi~hnte MSglichkeit den grSl~en Tell des Strahleneffektes (zu etwa 83 %) erkl~rt. Nimmt man beide Wirkungen zusammen (~, Ag-KSrner/10 ~ gez~hlte Zellen), so ergibt sieh praktisch die gleiche Hemmung wie bei der radioehemischen Analyse. 2:

3001 ~

zo,~::oll~n /

"-.7:

I// ~ I i

zo ~o 6o 5'0 7oo 7zo Ag-hSrner/Yelle r Bssrrahl#ng

Kon t m llo

U,, zo

\\

:, I

~o :: 80 I00 /~0 Ag -~~:z e~/Ze //e

b)N/kot/ham/'dzus~:z

Abb. 2 a u. b. Die V e r t e f l u n g der M a r k i e r u n g s d i c h t e in der Zellpopulation n a c h B e s t r a h l u n g u n d N i c o t i n a m i d z u s a t z . a B e s t r a h l u n g . b Nicotina~nid. I n jeweils ~00 (bei a) bzw. 40 (bei b) m a r k i e r t e n Zellen w u r d e die A n z a h l der SflberkSrner b e s t i m m t u n d e n t s p r e c h e n d in Z e h n e r g r u p p e n geordnet. Die so g e g e b e n e Gleichheit tier Zetlzahl d a r f j e d o c h n i c h t darfiber h i n w e g t ~ u s c h e n , daJ3 in d e n b e s t r a h l t e n A n s ~ t z e n w e l t w e n i g e r Zellen m a r k i e r t sind als in den K o n t r o l l e n (vgl. Tabelle 1). Die u n t e r a dargestellten ~vVerte sind aus v i e r V e r s u e h e n z u s a m m e n g e z o g e n , die u n t e r b r e p r ~ s e n t i e r e n einen Versuch

~ier erhebt sich nun die Frage, ob diese Art von kombinier~er Schgdigung nur fiir die DNS-Syn~hese Gfiltigkeit besitzt oder auch auf die anderen Parameter (DP~q-Gehal~, Glykolyser~te, Proteinsynthese) anwendbar ist. Versuehe mit synchronisierten Zellkulturen zeigen ja deutlich getrennte Synthese- und Ruhephasen ffir fast alle wichtigen StoffwechselgrSJ~en (vgl. MAI~TJYA~A U. LARK; HILZ u. ECKST~,IN). Allein aus dem ~hnliehenVerlauf der Dosis-Wirkungs-Kurven (Abb. 1) li~St sich jedoch eine so weitgehende Analogie nicht ableiten. Versuche, die Zellen anstelle yon Thymidin mit 14C-Nieotinamid zu markieren, um so das Verhalten des DPN au$oradiographisch zu analysieren, sind bisher fehlgeschlagGn. Beim Wasehen und Fixieren auch nicht-bestrahlSer Zellsuspensionen trit~ stets totaler Verlust der Zellmarkierung ein. Die oben dageleg~en Versuche iindern nights an dem Konzept der allgemeinen SGh~digung der Zellen dureh Nicotinsiiureamidverlust. Bei Zusatz yon Nicotins~ureamid werden ja die strahleninduzierten Inhibierungen - - auch die der DNSSynthese - - weitgehend wieder riickgangig gemacht (vgl. Abb. 1). DiGs ist nut dann erkliirhch, wenn man dem Nicotinsi~ureamid die Fi~higkeit zuschreibt, zumindest den grS~ten Tell der Zellen, die nach der Bestrahlung fiberhaupf keine

Die Schutzwirkung des Nicotinsi~ureamid

161

DNS mehr bflden, wieder zur Synr anzuregen. Diese Folgerung lgf~t sieh auch experimen~ell belegen (Tabelle 2). Nicotinsi~ureamidzusatz bei bes~rahlten Zellen bewirk~ Normalisierung der DNS-Synthese in jeder Beziehung. Es erh6h~ in den bes~rahl~en Ans/~tzen nicht nur die Anzahl der ak~iv synthetisierenden Zelien (markierte Zellen/108 gez~h[~e Zellen), sondern auch die In~ensitEt der DNS-Synthese (Ag-KSrner/markierte Zelle). Interessanterweise bewirkt abet aueh der Zusatz yon optimalen Nicotins~ureamid-Konzentrationen ~ zu Normalzellen eine beaehtliche Stimulierung der D57S-Synthese (Tabelle 3). Viol mehr Tabelle 2. Die Restitution der DNS-Synthese durch 2Yicotins~iureamid

t Markierte

/I

Ag-K6rner / I

2;Ag-KSrner

Nioo$inamid f

§

+

~ ~hlte Zellen

240 100% 125 52% 253 105%

~

ZelIe

t~e

38,6 100% 22,7 59% 44,6 114%

/~

Zellen

lt~

9260 100% 2840 30% 11280 121%

Tabelle 3. Die Wirkung von Nicotinsdiureamid au/ normale und bestrahlte Ascitestumorzellen

Nicotinamid

--

d--

q-

ZoUen ~~ahlto Zellen --dA-

240 326 125 253

100% 136% 100% 202%

m~ar~er 1 0 ~ ~ ge~hl to to ~ Zelle ~ . Zellen 38.6 48.3 22.7 44,6

100% 125% 100% 197 %

I 9260 [ 15750 2840 I1280

100% 170% 100% 398%

Ze]len befinden sieh unter diesen Bedingungen in einer aktiven Syntheseperiode - - ein Befund, der sich auch aus der Markierungsverteflung auf die einzelnen Zellen ableiten 1/~Bt (Abb. 2b). Man gewinnt so den Eindruek, als werde unter Nieotinss der allgemeine Stoffweehsel, das Wachstum der Zellen beschleunigt. Aus Tabelle 3 is~ aueh klar ersichtlieh, dab der Zusatz yon Nicotins/~ureamid zu bestrahlten Zellen prozentual einen welt st/~rkeren Effekt ausfibt als bei normalen Ze]len (398 % gegen 170% ), dab also ein echSer Sehutzeffekt vorliegt. Diskussion

Die hier dargelegten Befunde fiber die Strahlensch/~digung yon Ascitestumorzellen unters~reichen erneu~ die Bedeutung eines ad/iquaten (in~raeellul/~ren) Nieotins/~ureamidspiegels ffir den generellen Stoffwechsel der Tumorzelle. Die autoradiographisehe Analyse der DNS-Syn~hese insbes0ndere deute~ auf eine direkte odor indirekte Funktion des Nicotins/~ureamid b e i d e r Syntheserate der DNS. 1 Zusatz s~eigender Konzentrationen Nicotins~ureamid zu normalen Ascitestumorzellen fiihrt zun~ichs~zu einer Stimulierung, bei hohen Dosierungen aber zu Inhibierung verschiedener StoffwechselgrSl3en (HLivIci, ROEME~u. HILZ).

162

H. HILZund H. BERNDT:

Besonderes Interesse verdient es, dab sich mit der autoradiographischen Methode nach Bestrahlung mit 5000 r zwei untersclfiedliche Seh~digungsmeehanismen der DNS-Synthese naehweisen lassen, die m6glieherweise mit dem biphasisehen Verlauf der Dosis-Wirkungs-Kurve in Beziehung stehen; denn aueh daraus kSnnen ja Schliisse auf zwei differente Weisen der Syntheseschadigung gezogen werden ( L A J ~ ) . Gemal~ Abb. 1 setzt sieh die (Gesamt-)Schadigung der DNSSynthese bei 5000 r - - entsprechend der untersehiedlichen Neigung der Kurve - zusammen aus einem strahlenempfindliehen und einem strahlenresistenteren Inhibiertmgsvorgang, wobei der erste in quantitativer Hinsicht fiberwiegt. Genau dasselbe ergibt sich aber aueh aus Tabelle 1 : Der strahlensensitivere Vorgang ist die totale Aussehaltung der DNS-Synthese in 56% der Zellen, die fiberhaupt DNS synthetisieren. Dieser Vorgang erkliirt 83 % der Gesamtsehadigung. Die restlichen Zellen hingegen zeigen nur eine (durchschnittliehe) Inhibierung der DRS-Synthese yon 28 %, was an der Gesamtschadigung nur knapp 1/5 ausmacht. Der fiberwiegende Tell der gesamten Sch~digung wird demnaeh durch den Proze]~ verursacht, der zur totalen Aussehaltung yon DNS-synthetisierenden Zellen ffihrt. Es ist nicht klar, ob diese negative Selektion auf eine genetiseh uneinheitlichere Zellpopulation zuriickzufiihren oder abet dureh unterschiedliehe Strahlensensitivit~t bestimmter Phasen des Teilungseyclus bedingt ist. Der strahlenbedingte Verlust der Zellen an Nicotins~ureamid (HILz, HLAVICA U. B~TRA~) per se kann aueh nicht Ursaehe der biphasischen Sehi~digung sein; denn Zusatz dieser Verbindung zu bestrahlten Zellen restituiert ja beide Defekte (Tabelle 2), und such die Dosis-Wirkungs-Kurven ffir die mit Nicotinsi~ureamid inkubierten Ansi~tze indizieren einen dualistischen Mechanismus der Restitution, da sie ebenfalls einen zweiphasigen Verlauf zeigen (Abb. 1 : ~-NA). Unklar bleibt auch, auf welehe Weise die anderen Parameter (Proteinsynthese, DPN-Gehalt, Glykolyserate) mit diesem Ph~nomen verknfipft sind. SchlieBlich erhebt sich die Frage, ob diese Schi~digungen, die doch - - direkt oder indirekt - - mat dem Nicotinamidverlust der Zellen zusammenhangen, die entscheidende Noxe darstellen, die primgr zum Zelltod fiihren. Beim YoshidaSarkom der Ratte (MAASS) und bei Itefezellen (HILz u: ECKST]~I~) sind sicherlieh andere, teilungsspezifische(?) Prozesse ffir die strahlenbedlngte Wachstumshemmung verantwortlich. M6glicherweise gilt dies sogar ffir das bier verwendete, strahlensensitivere Carcinom, da auch in diesem Fall die Angehrate noeh etwas empfindHcher reagiert als die DNS-Synthese oder die DPN-Konzentration:

Zusammenfassung Bestrahlung yon EhrHch-Ascitestumorzellen bewirkt eine ~hnliche Sch~digung yon DPI~-Geh~lt, Glykolyser&te, DNS- und Proteinsynthese, w~hrend die Atmung kaum betroffen wird. Nicotinsi~ureamid, das dem Inkubationsmilieu (80%iges Aseitesserum) zugesetzt wird, verhindert zum groi~en Tell diese Auswirkungen. Wie eine autoradiographisehe Analyse zeigt, kommt die Hemmung der DNSSynthese in einer solehen, nicht-synchron sich teflenden Zellpopulation auf zwei Wegen zustande: Naeh 5000 r verlieren die meisten der DNS-synthetisierenden Zellen vollst~ndig die Fi~higkeit, markiertes Thymidln zu inkorporieren, ws die restlichen Zellen eine nur mi~i~ig reduzierte Einbaurate zeigen. Nicotinsi~ureamid stellt die normalen Verh<nisse wieder her, indem nicht nur die Anzahl der

Die Schutzwirkung des Nicotinsiiureamid

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D N S - s y n t h e t i s i e r e n d e n Zellen, s o n d e r n auch d a s AusmaB d e r ?r in d e n i n d i v i d u e l l e n Zellen e r h 6 h t wird. Diese B e f u n d e best~tigen e r n e u t die Bedeutvmg eines a d ~ q u a t e n intracellul~ren N i c o t i n s g u r e a m i d s p i e g e l s ffir d e n Stoffwechsel b e s t i m m t e r T u m o r e n . The P r o t e c t i n g Action of Nieotinamide against the R a d i a t i o n - i n d u c e d I n j u r y e l DNA-Synthesis as a Cell Population P r o b l e m Summary W h e n E h r l i c h ascites t u m o r cells are i r r a d i a t e d , t h e D P N c o n t e n t , t h e r a t e of glycolysis, a n d t h e s y n t h e s e s of D N A a n d p r o t e i n are i m p a i r e d , whereas t h e r e s p i r a t i o n h a r d l y is affected. N i c o t m a m i d e p r e v e n t s to a large exten~ these r a d i a t i o n effects when a d d e d to t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e (80 % ascites serum). As r e v e a l e d b y a u t o r a d i o g r a p h i c analysis, t h e i n h i b i t i o n of D N A s y n t h e s i s in such a n o n - s y n c h r o n o u s l y d i v i d i n g cell p o p u l a t i o n comes a b o u t in t w o ways. A f t e r 5000 r, m o s t of t h e D N A synthesizing cells c o m p l e t e l y lose t h e c a p a c i t y to i n c o r p o r a t e t r i t i a t e d t h y m i d i n e , whereas t h e r e m a i n i n g cells show a m o d e r a t e l y i m p a i r e d r a t e of u p t a k e . W h e n a d d e d a f t e r i r r a d i a t i o n , n i c o t i n a m i d e restores t h e i m p a i r m e n t n e a r l y to n o r m a l b y i n c r e a s i n g b o t h t h e n u m b e r of D N A s y n t h e s i z i n g cells a n d t h e e x t e n t of labelling w i t h t h y m i d i n e in t h e i n d i v i d u a l cells. These results a g a i n confirm t h e i m p o r t a n t role of an a d e q u a t e i n t r a c e l l u l a r level o~ n i c o t i n a m i d e for t h e m e t a b o l i s m of c e r t a i n t u m o r cells. Literatur BOLLU•, F. J., ft. W. A~D~R~GG, A. B. MCELvA, and R. vA~ POTT~a: Nucleic acid metabolism in regenerating rat liver. VII. Effect of X-radiation on enzymes of DNA synthesis. Cancer Res. 20, 138 (1960). BORST, P., H. GR~B~G, and H. HOLZER: The DPN content of mitochondria isolated from ascites tumor cells treated with a carcinostatic ethyleneimine. Biochim. biophys. Aeta (Amst.) 74, 789 (1963). Do~AG]~, G., L. J~mlNG u. J. PtiTT]~: Probleme der Chemotherapie der Tumoren. In: K. H. B A u ~ (Ed.), Medizinische Grundlagenforschung, Bd. II, S. 553. Stuttgart: Georg Thieme 1959. HILZ, H., u. B. BERTlCA~: De-Inhibierung der Ascitestumor-DPNase durch Wasserstoffperoxyd. (In Vorbereitung.) - - - - u. P. I-ILAwCA: Die Deutung des strahlenbedingten DPN-Abfalls in Ascitestumoren als Sch~digung der aktiven Nikotinamidkonzentrierung. Gem. Tagg Dtsch., Schweiz. u. Franz. Biochem., Strafiburg 1963. - - - - - - Die entscheidende Bedeutung der DPNase-Aktivierung ffir den DPN-Abfall in bestrahlten Aseitestumorzellen. Biochem. Z. 3118, 283 (1963). - - , u. H. ECKSTnrN: Hemmung der Zellteflung dutch Cytostatica und R6ntgonstrahlen bei synchronisierten Hefezellen. (In Vorbereitung.) - - M. v. GOSSLER,M. OLI)~m', and M. SeHOLZ:Effects of x-ray irradiation in asciges tumor cells. Partial restauration of DPN-content and DNA-synthesis by nicotinamide. Biochem. biophys. Res. Commun. 6, 379 (1961). - - P. tILAWeA u. V. ROEM~R: Zur Wirkung yon Nikotins/iureamid auf den Stoffwechsel yon Ascitestumorzellen. (In Vorbereitung.) - - B. t{UB~CIANN, ~ . OLDEKOP, M. SCgOLZ I1. M.V. GOSSLER: Die Wirkung yon R6ntgenstrahlen und cytostatischen Verbhldungen auf DPN-Gehalt und DNS-Synthese in Ascitestumorzellen. Biochem. Z. 886, 62 (1962). --H.I~[AAss, F. HSLzEL, A. H m s c H - H o ~ A ~ u. ~J[.OLDEKOP: Die unterschiedliche Stoffwechselsch~digung verschiedener Ascitestumorst~mme dutch RSntgenstrahlen. Biochem. Z. 389, 198 (1963).

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H. HILZ und H. BERNDT: Die Schutzwirkung des Nicotins~ureamid

HLAV~CA, P., V. I~O~HEI~ u. H. HILZ: Die Bedeutung des Nikoflinamids flit den Ablauf von Glykolyse, DNS- und Proteinsynthese. Gem. Tagg Dtsch., Schweiz. u. Franz. Biochem., StraSburg 1963. H6LZEL, F. : Dot Einflnf$ yon 2,3,5-Trisaethyleniminobenzochinon (1.4) auf den Einbau yon l~C-markierten Aminosauren in das Protein anaerob glykolysierendes u Tumorzellen. Z. Naturforsch. 16b, 792 (1961). - - H. IV[~tss u. H. A. K ~ I ~ E L : Der EinfluB yon Nikotinss und 2,3,5-Trisi~thyleniminobenzochinon(1,4) auf den Einbau v0n l*C-Glycin in das Protein yon Yoshida-AscitesSarkomzellen. Naturwissenschaften 48, 627 (1961). HOLZm~, H., P. GI~OGI~EI~n. G. SEDLI~AYf~:Zum NIechanismns der Glykolysehemmung durch carcinostatisch wirkende Athyleniminoverbindungen. Biochem. Z. 330, 59 (1958). - - , u. H. KR6GEI~: Zum Mechanismns der Wirkung yon B 518 (Endoxan-Asta) auf das JensenSarkom und zur Hemmung der Chemotherapie yon Tmnoren dutch das Vitamin Nikotinss Klin. Wschr. 36, 677 (1958). KocH, R., u. S. KLEMM: Zum Mechanismus des Strahlenschutzeffektes yon Nicotins~ureamid am Ehrlich-Ascites-Tumor. Arzneimit~el-Forsch. 12, 465 (1962). LMTI~, L. G. : The effect of radiations on nucleic acid metabolism. In: Nucleic acids, vol. III, p. 527. New York: Academic Press 1960. - - 1~. OLivine, and F. ELLIS : Incorporation of s~P and adenine 14C into DNA by human bone marrow cells in vitro. Brit. J. Cancer 8, 367 (1954). Llss, E., u. G. PAI~IE: DPN-Gehalt anaerobe Glykolyse und DNS-Synthese yon Ascitestumorzellen unter dem EinfluB yon Trenimon. Naturwissenschaiten 50, 672 (1963). MAAss, H. : 13bet den Wirkungsmechanismus yon RSntgenstrahlen und cytostatischen Substanzen im Int~rmediarstoffwechsel der Tumorzelle. t{abil.-Schr. Hamburg 1962. - - Ober den Wirkungsmechanismns yon RSntgens%rahlen und zytost~tischen Substanzen in Tumorzellen. Zbl. Gyns 85, 209 (1963). - - , u. G. H. RATHGEN: Untersuchungen fiber den Einflul3 yon R6ntgenstrahlen auf den Kohlehydratstoffwechsel yon Tumorzel]en. Strahlentherapie 103, 668 (1957). - - - - H. A. Ki~NI~EL U. G. SCHUBERT: Versuche zur Deutung der strahleninduzierten Glyko]ysehemmung in Yoshida-Ascites-Tmnorzellen. Z. Nalburforsch. lSb, 735 (1958). MARUYAM~, Y., and I{. G. L~I~K: Periodic synthesis of b~cteri~l nucleic acids in the absence of protein synthesis. Exp. Cell l~es. 25, 161 (1961). POTTER, J. : Stoffwechselwirkungen yon Athy]enimino-Chinonen. Arzneimittel-Forsch. 10, 8 (1960). I~o~TT, J. B. : The inhibition of carbohydrate metabolism in aseites ~umor cells by ethyleneimines. Biochem. J. 63, 300 (1956). SCA~E, J. F. : Effect of ionizing radiation on the pyridine nucleotides of thymocytes. Canad. J. Bioehem. 41, 1469 (1963). SCm~IACK,W., H. MAAss u. G. LOCH:~m Die intracellui~re Vei~eilung des Diphosphopyridinnukleotids in Tumorzellen naeh R6n/sgenstrahlen. Z. t~rebs~orsch. 65, 257 (1963). WAI~SUl~o, O. : In: Weiteren~wieklnng zellphysiologiseher NieShoden. Stuttgai~: Georg Thieme 1962. WEITZEL, Cx., E. BUDDECKE, F. SCHNEIDER U. H, PFEIL: Einwirkung organiseher Persauerstoff-Verbindungen auf das M~use-Ascitescareinom in vivo. ttoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 325, 65 (1961). - - :F. SChnEiDeR, H. PFE~L U. K. SEY~SCg~: Cytostatisehe Effekte stieks~offhMgiger organiseher Peroxyde. Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 331, 219 (1963). Doz. Dr. H. HILZ,

Physiol..Chem. Institut der UniversitY,, 2 Hamburg 20, Martinistr. 52