Z. Krebsforsch. 74, 304--808 (1970) 9 by Springer-Verlag 1970

Die Wirkung yon Actinomycin und Tris/ithyleniminobenzochinon auf die DNS-Synthese in regenerierender Rattenleber* H. M~ASS, L. BUDDE und D.-R. Rf3~LE Universitats-Frauenklinik Hamburg-Eppendoff (Direktor: Prof. Dr. K. Thomsen) Eingegangen am 7. Januar 1970

The Egect o/Actinomycin and Trisethyleneiminobenzoqulnone on the DNS Synthesis in Regenerating Rat Liver Summary. Rats were injected with trisethyleneiminobenzoquinone (Trenimon) or actinomycin at various times before and after partial hepateetomy. The incorporation of C14-thymidine into the DNS of the regenerating liver was measured 24 hours after hepatectomy. It could be shown, that the inhibition of the thymidine incorporation into the DNA of the regenerating liver by Trenimon was observed when the drug had been administered at early as 3 weeks before the hepatectomy. Actinomycin was ineffective when applied 24 hours before the hepateetomy. On the other hand, an inhibition of the thymidine incorporation was observed 15 hours after the hepatectomy just before the onset of the DNA synthetic phase. Zusammen/assung. Trisithyleniminobenzochinon (Trenimon) bzw. Actinomycin wurde Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Hepatektomie injiziert. Die iYIessung des C14-Thymidineinbaus in die DNS der regenerierenden Leber erfolgte jewefls 24 Std nach der Hepatektomie. Es konnte nachgewiesen werden, dab Trenimon noch zu einer Hemmung des Thymidineinbaus in die DNS der regenerierenden Leber fiihrt, wenn die Substanz bis zu 3 Wochen vor der Hepatektomie injiziert wurde. Actinomycin war dagegen bereits wirkungslos, wenn die Injektion 24 Std vor der Hepatektomie erfolgte. Nach der Hepatektomie lieB sich eine Inhibierung des Thymidineinbaus in die DIqS noch nachweisen, wenn Actinomycin kurz vor Beginn der DNS-Synthesephase, nimlieh 15 Std naeh der ttepatektomie, injiziert wurde. I n einer vorangehenden Arbeit wurde fiber die Wirkung yon Tris/~thyleniminobenzoehinon (Trenimon | auf die DNS-Synthese der regenerierenden Rattenleber beriehtet (Maass, Budde, H61zel u. Sehwenke, 1966). Dabei konnte festgestellt werden, dab die alkylierende Substanz die DNS-Synthese hemmt, wenn sit vor Einsetzen der DNS.Synthesephase appliziert wird. Eine Hemmung war aber auch dann noeh naehweisbar, wenn Trenimon vor der Hepatektomie injiziert wurde. I n der vorliegenden Arbeit wird fiber weitergehende Untersuehungen beriehtet, in denen die alkylierende Substanz zu 1/~ngeren Zeiten vor der Hepatektomie injiziert wurde. Wegen des weitgehend bekannten Angriffspunktes der Aetinomyeine warden Parallelversuehe mit Aetinomyein C durehgef/ihrt. * Der Deutschen Forschungsgemeinschaft sei f~r die Unterstfitzung dieser Untersuchun-

gen gedankt.

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Material und Methodik Hinsichtlich des Tiermateria]s und der Durchfiihrung der Hepatektomie sowie der Messung des Cla-Thymidineinbaus in die DNS karm auf die vorangehende Mitteilung verwiesen werden (Maass, Budde, H61zel u. Schwenke, 1966). Actinomycin wurde als Actinomycin C (Sanamycin, Bayer AG, Leverkusen) bezogen. Die Tiere erhielten eine einmalige Injektion yon 100 y Actinomycin C/kg KSrpergewicht zu verschiedenen Zeiten vor und nach der Hepatektomie. Tris~thyleniminobenzochinon (Trenimon) wurde wie in den vorherigen Untersuchungen in einer Dosis yon 150 y/kg KSrloergewicht zu verschiedenen Zeitpunkten vor der Hepatektomie injiziert.

Ergebnisse 1. Versuche mit Trenimon: Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind in der ersten Tabelle zusammengefaBt. Die Injektion der alkylierenden Subs~anz effolgte zu den angegebenen Zeitpunkten vor der I-/epatektomie. 2-C~4-Thymidin wurde in allen Fallen 23,5 Std naeh der Hepatektomie injiziert und die Tiere 24 Std nach der Hepatektomie getStet. Wie aus der Tab. 1 hervorgeht, kommt es zu einer Itemmung des Thymidineinbaus in die DNS der regenerierenden Leber, wenn die aklylierende Substanz den Tieren zu den angegebenen Zeitpunkten vor der Hepatektomie injiziert wurde. Die sti~rkste Hemmung lieI] sich dann nachweisen, wenn die Injektion 3 Tage vor der Hepatektomie und damit 4 Tage vor der Messung der DNS-Synthese lag. Auffallenderweise war aber eine Hemmung der DNS-Synthese in der sparer regenerierenden Leber noeh naehweisbar, wenn die Injektion 20 Tage vor der Hepatektomie erfolgte.

Tabelle 1, Der Einflufl yon TrisSthylenlmlnobenzochinon (150 y/kg) zu den angegebenen Zeiten au/ den Einbau yon 2-14C-Thymldin (30 rain Einbauze#) in die JDNS reffenerierenderl~attenleber. Thymidineinbau ]eweils 24 Std nach der Hepatektomie gemessen. ~1~ol 2-14C-Thymidin ] 100 ~zNIolinjiz. 2-14C-Thymidinx g Leber 4- s

Kontrolle 1,035 4-0,180

vor der Hepatektomie 5 rain 4 Std 12 Std 0,662 •

0,356 •

0,413 4-0,194

72 Std

6 Tage

0,162 0,316 4-0,033 4-0,147

14 Tage

20 Tage

0,658

0,778 4-0,196

•

2. Versuche mit Actinomycin C: I n der Tab. 2 sind zun~chst die Versuche zusammengestellt, in denen das Antibioticum zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Hepatektomie appliziert wurde. Auch in diesen Versuchen wurde der Thymidineinbau jewefls zwischen 23,5 und 24 Std nach der Hepatektomie gemessen. Wie die Tabelle erkennen l/~l]t, kommt es zu einer starken Inhibierung des Thymidineinbaus in die DNS ]e nach dem Zeitpunkt der Actinomycininjektion. Wurde das Antibiotieum wahrend der DNS-Synthesephase gemessen, land sieh nut eine geringgradige Reduktion des Thymidineinbaus in die DNS. Dagegen

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H. iVfaass,L. Budde und D.-R. Rfihle:

wurde bei Applikation der SubsSanz zu frfiheren Zeitpunkten eine praktisch komplette Hemmung des Thymidineinbaus erzielt, die am sti~rksten 4 und 12 Std nach der Hepatektomie nachweisbar war. Eine noch 90%ige Hemmung der DNSSynthese lieI] sich aber noch nachweisen, wenn Actinomycin kurz vor Beginn der DNS-Synthesephase, niimlich 15 Std nach der Hepatektomie, injiziert wurde. Tabelle 2. Der Einflufl yon Actinomyc~in C (100 y/kg) zu den angegebenen Zeiten au/ den Einbau yon 2-~4C-Thymidin (30 rain Einbauzeit) in die D N S regenerierender lCattenleber. Thymidinelnbau ]eweils 24 Std nach der Hepatektomie 9emessen.

~Mol 2-1~C-Thymidin ] 10O ~Mol injiz. 2-1~C-Thymidin x g Leber 5= s

Kontrolle

nach der Hepa~ektomie 4 Std 12 Std 15 Std

1,035 5=0,180

0,039 ::1:0,005

18 Std

22 Stcl

0,079 0,100 0,829 0,644 =t=0,042 5=0,070 ::1:0,141 4-0,080

In Tab. 3 sind die Ergebnisse dargestellt, die nach Injektion des Actinomycins vor der Hepatektomie erzielt wurden. I m Gegensatz zu den Trenimonversuchen war nur dann eine Hemmung der 24 Std nach der Hepatektomie gemessenen DNS-Synthese nachweisbar, wenn Actinomycin 12 Std vor der Hepatektomie injiziert wurde. Erfolgte die Applikation 24 bzw. 72 Std vor der Operation, kam es zu keiner Hemmung. Tabelle 3. Der Einflu]3 yon Actinomycin C (100 ~]kg) zu den angegebenen Zeiten au] den Einbau yon 2-1aC-Thymidin (30 rain Einbauzel 0 in die DNS regenerlerender Rattenleber. Thymidineinbau ]eweils 24 Std nach der Hepatektomie gemessen. ~Mol 2-1~C-Thymidin ] I00 ilMol injiz. 2-~C-Thymidin • g Leber 5= s

Kontrolle

vor der Hepatektomie 12 Std 24 Std 72 Std

1,035 5=0,180

0,122 5=[:0,050

0,924 0,983 5=0,240 5=0,200

Diskussion Aus den bier beschriebenen Versuchen geht hervor, dab Tris/ithylenimirmbenzochinon auch dann eine Hemmung der DI~S-Synthese in regenerierender Leber verursacht, wenn es ]/~ngere Zeit vor der Hepatektomie, also auf die nicht DNS-synthetisierende Leberzelle einwirkt. Demnach kommt es zu einer relativ festen und langdauernden Bindung des Trenimon an Zellstrukturen, die dann

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noeh naeh sehr viel sp/~ter erfolgender Itepatektomie das Ingangsetzen der DNSSynthese verhindert. Der Ort dieser Bindung ist in einer frtiheren Mitteilung (HSlzel, I-Iebbeln, ItSeke u. Maass, 1967) eingehend diskutiert worden. Demnaeh ist die Bindung des Trenimons an die DNS vergMehsweise auBerordentlieh gering. Untersuehungen mit C14-Tri-/ithylenmelamin und C14-p-Benzoehinon hatten gezeigt, dag eine Bindung dieser Substanzen /iberwiegend an die RNP-Fraktion naeh Wang (1965) erfolgt. In Ubereinstimmung mit den Beobaehtungen yon Harbers u. Baekmann (1963) und den bereits zitierten eigenen Untersuehungen ist die Bindung von Aetinomyein an die DNS dagegen sehr viel labiler, da eine Hemmung der DNSSynthese in der regenerierenden Leber bereits nieht mehr naehweisbar war, wenn die Substanz 24 Std vor der Ilepatektomie appliziert wurde. Auff/Lllig an den Versuehsergebnissen naeh Aetinomyeineinwirkung ist die Tatsaehe, dal3 eine starke Inhibierung des Thymidineinbaus in die DNS noeh dann erzielt wurde, wenn Aetinomyein kurz vor Beginn der DNS-Synthesephase injiziert wtu'de. Auf Grund der Untersuehungen yon Giudiee u. Novelli (1963), Fausto u. Van Laneker (1965) sowie neuerdings yon Labow, Maley u. Maley (1969) treten die ffir den Einbau des Thymidins in die DNS notwendigen Enzyme erst kurz vor Einsetzen der DNS-Synthesephase auf. Aus den bier vorliegenden Versuehen muB nun gesehlossen werden, dab die spezifisehe Messenger-RNS fiir diese Enzyme ebenfalls erst am Ende der G1-Phase synthetisiert wird. Allerdings geht aus den Ergebnissen yon Giudiee u. Novelli hervor, dal3 der DNS-Polymerasegehalg, jeweils 28--29 Std naeh der Hepatektomie gemessen, bei Injektion yon Aetinomyein 12 Std naeh der Operation wohl gegeniiber der Kontrolle erniedrig~, aber doeh deutlieh nachweisbar ist. Eine noeh h6here Aktivit~t land sieh, wenn Aetinomyein 16 Std naeh der Ilepatektomie injiziert wurde. Entspreehende Untersuehungen hinsiehtlieh der Abhgngigkeit der Hemmung der Thymidin- und Thymidylatkinasen vom Zeitpunkt der Aetinomyein-Injektion liegen nieht vor. Immerhin wird das Auftreten der Thymidinkinase (Maley, Lorenson u. Maley, 1965) und der TMP-Kinase (Fausto u. Van Laneker, 1965) dureh Aetinomyein verhindert, wghrend die letztgenannten Autoren keine Hemmung der Thymidindiphosphokinase naeh Aetinomyein naehweisen konnten.

Literatur

Fausto, N., Van Lancker, J. L. : ~olecular mechanisms of liver regeneration. IV. Thymidylic kinase and deoxyribonucleic acid polyinerase activities in normal and regenerating liver. J. biol. Chem. 240, 1247 (1965). Giudiee, G., Novelli, G. D. : Effect of Aetinomycin D on the synthesis of DNA polymerase in hepatectoinized rats. Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 383 (1963). IIarbers, E., Backmann, R. : Untersuchungen zum Wirkungsmeehanismus der Actinoinycine. II. Vcrsuche Init 14C-Aetinomyein an Ehrlich-Ascitestumorzellen in vitro. Biochein. Z. ~37, 224 (1963). HSlzel, ~'., Hebbeln, It., HScke, E., Maass, tI.. Die Penetration und die intracellul~tre Verteilung yon Trenimon, p-Benzochinon, Aetinomycin und Tri-~thyleninelamin (TEM) bei in vitro-Untersuchungen mit Ehrlich-Ascitestumorzellen. Z. Krebsforsch. 70, 74 (1967). Labow, I~., Maley, G. F., Maley, F. : The effect of inethotrexate on enzymes induced following partial hel0atectomy. Cancer Res. 29, 366 (1969).

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Maass u. a.: Die Wirkung yon Actinomycin und Tris~thyleniminobenzochinon

Maass, H., Budde, L., HSlzel, F., Schwenke, R. : Die Einwirkung yon Tris~thyleniminobenzochinon auf die Dl~S-Synthese, den NAD- und NADP-Gehalt yon regenerierender Rattenleber. Z. Krebsforsch. 68, 326 (1966). Maley, G. F., Lorenson, NL G., Maley, F. : Inhibitors of protein synthesis: Effect on the levels of deoxycitidylate deaminase, thymidylate synthetase, and thymidine kinase in regenerating rat liver. Biochem. biophys. Res. Commun. 18, 364 (1965). Wang, T.-Y. : Solubflization and characterization of the residual proteins of the cell nucleus. J. biol. Chem. 241, 2913 (1966). Prof. Dr. H. Maass Universit~ts-Frauenklinik D-2000 Hamburg-Eppendorf, Martinistr. 52