Chromosoma (Berl.) t4, 347--359 (1963)

Aus den Max-Planck-Insti~uten fiir Meeresbiologie,Abt. H. BAUER, und fiir Biologie, Abt. W. B~EI~SIAXlZ,Tiibingen D I F F E R E N T I E L L E DNS-I~EPLIKATION I N DEN SPEICHELDtZUSEN-CHROMOSOMEN VON CI-IIt~ONOMUS TttUMMI Von H.-G. KEYL und C. P~I~LING Mit 7 Textabbildungen

(Eingegangen am 26. M~irz 1963) Untersuchungen fiber DNS-I~eplikation im Zellkern durch autoradiographischen Nachweis yon inkorporiertem ItS-Thymidin sind bisher in groger Zahl durehgeffihrt worden. Cytologiseh besonders aufsehlugreich sind darunter diejenigen Arbeiten, in denen strukturspezifische Differenzen im zeitlichen Ablauf der DNS-Synthese naehgewiesen werden k6nnen. DNS-Synthesen, die sieh in Form yon Replikationswellen innerhMb der Chromosomen- oder Kernstrukturen vorw~rtsbewegen, h~ben TAYLo~ (1958) in Chromosomen der Wurzelspitzenzellen yon Crepis capillaris und GALL (1959), sowie PaESCOTT und KIMBALL (1960) am bandf6rmigen Makronucleus yon Euplotes eurystomus festgestellt. Ein bemerkenswerter Untersehied im ReplikationsverhMten yon Eu- und Itetero. ehromatin wurde yon LI~A-DE-FARIA (1959) entdeekt ; in den Spermatoeyten yon Melanoplus di//erentialis beginnt und endet die DNS-Synthese des heteroehromatischen X-Chromosoms sp/~ter als in den Autosomen. An Gewebekulturzellen des ehinesisehen Hamsters (Cricetus griseus) fand TAYLO~ (1960) einen asynehronen l~eplikationsverl~uf innerhalb dessen die D N S i m Y-Chromosom, sowie in Teilen der X-Chromosomen und einiger Autosomen sp/~ter verdoppelt wird als in den fibrigen Chromosomen und Chromosomenabsehnitten. Uber verschiedene Typen einer strukturspezifisehen Thymidin-Inkorporation in den SpeieheldriisenChromosomen yon Rhynchosciara angelae beriehten FICQ und P~tvA~ (1957) und t)AVA~ (1958). AuBer einer DNS-lgeplikation, an der Mle Querseheiben beteiligt sind, sollen F/~]le auftreten, in denen nut wenige Querseheiben oder Mlein d~s Heteroehromatin DNS unabh~ngig yon einem normalen Replikationssehritt synthetisieren k5nnen. Derartige Vorg/inge mfissen zwangsl/iufig zu einer Ver/inderung des DNS-Verteilungsverh/~ltnisses im Verlauf der Chromosomenentwicklung ffihren. Ffir die eigenen Untersuehungen wurden die Speieheldrfisen-Chromosomen des Bastards Chironomus thummi thummi • Chironomus thummi Chromosoma (Berl.), Bd. 14:

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H.-G. KmrL und C. PELLI~G:

piger herangezogen, die frir die a u t o r a d i o g r a p h i s c h e D a r s t e l l u n g s t r u k t u r spezifischer Differenzen der D N S - R e p l i k a t i o n besonders geeignet sind. J e d e s der vier C h r o m o s o m e n eines Speicheldrfisenkerns e n t h g l t n e b e n s t r u k t u r i d e n t i s c h e n Stricken einen s t r u k t u r d i f f e r e n t e n A b s c h n i t t , in d e m die H o m o l o g e n p a a r u n g u n t e r b r o c h e n ist u n d Differenzen des D N S Gehaltes vorliegen (K~YL u n d STUE~ZX~ 1956, KEYL 1957). Material und Methode ]~fir die Versuche wurden Bastard-Larven aus der Elternkombination Ch. th. piger ~ • Ch..th. thummi c~ im spaten vierten Larvenstadium oder im Vorpuppenstadium verwendet. Die injizierten radioaktiven Verbindungen waren: 1. Ha-Thymidin mit einer spezifischen Aktivit~t yon 3,0 C/raM (Schwarz Bioreseareh, Mount Vernon N.Y.); 2. C14-Thymidin mit einer spezifischen Aktivit~t yon 26 mc/g (New England Nuclear Corp., Boston, Mass.). Beide Substanzen wurden in w~ssriger, isotonischer MaltoseLSsung durch den hinteren Naehschieber der Larven in die H~molymphe eingespritzt. Die injizierten Mengen betrugen 0,25--1,0 Mikroliter. Die Inkubationszeit lag bei den H3-Thymidin-Versuchen zwischen 10 und 60 rain in einigen F~]len zwischen 24 und 60 Std. A]le Doppelmarkierungsversuche begannen mit einer 3-, 6- oder 12stiindigen Inkubation yon C14-Thymidin. Die Einwirkungszeit des an zweiter Stelle injizierten HS-Thymidins war stets 30 min. Bei der relativ ]angen Zeitspanne zwischen den Injektionen konnte damit gereehnet werden, versehiedene Stadien der DNS-Synthese zu erfassen. Da bei Doppelinjektionen das H3-Thymidin in die noeh Cl~-aktiven Larven injiziert werden mugte, wnrde die H3-Thymidin-Konzentration stets so gewghlt, dab den Speicheldriisen nach der Injektion Aktivitaten beider Isotope yon ungef~hr gleieher GrSgenordnung zur Verffigung standen. Eine Inkubation C44-markierter Driisen in tritiumhaltiger tI~molymphe wies demgegenfiber keine Vorteile auf. Zur Herstellung der Chromosomenpr~parate wurden die Speicheldriisen in Alkohol-Eisessig 3 : 1 fixiert, mit Karminessigsgure gef~rbt und in 50 % iger Essigs~ure gequetscht. Die Ubeffiihrung der Pr~parate in Aqua, dest. gesehah naeh Entfernung der Deekglgser durch Vereisung fiber eine Alkohol-Formol-Reihe. Die Autoradiographien wurden mit Kodak stripping film AR 10 hergestellt. Naeh Entwieklung und Fixierung wurden die Pr~parate in Wasser und Alkohol gewasehen und unter einem Deekglas in dem yon BoY~) (1955) ffir Phasenkontrastbeobaehtung angegebenen Medium eingesehlossen.

Befunde 1. In]ektionen yon H a. T h y m i d i n Die A u t o r a d i o g r a p h i e n dieser Vcrsuchsserie zeigen, d a b in den Speicheldrrisen-Chromosomen verschiedene Zust/~nde der D N S - S y n t h e s e a u f t r e t e n , die sich d u r c h eJn strukturspezifisches T h y m i d i n - E i n b a u m u s t e r unterscheiden. Zwei der b e o b a c h t e t e n M6glichkeiten y o n T h y m i d i n - A u f n a h m e stellen Extremf/ille in der Verteilung der R a d i o aktivit/~t i n n e r h a l b der C h r o m o s o m e n dar. I n d e m einen F a l l sind die C h r o m o s o m e n vollst/indig m a r k i e r t , in d e m a n d e r e n werden ausschliel3lich die K i n e t o c h o r r e g i o n e n der thummi thummi-Chromosomen y o n der M a r k i e r u n g betroffen.

DifferentielleDNS-l~eplik~tionbei Chironomu.s thummi

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Bei kompletter Markierung der Chromosomen sehwankt die Verteilung der gadioaktivit/~t zwisehen ann/~hernder Homogenit~t und klarer strukturspezifischer Differenzierung. Das auf Abb. 1 wiedergegebene Markierungsbild yon Chromosom III enth/tlt keine konsequente Homogenitgt der Silberkornverteilung. Einige Absehnitte des Chromosoms, die im normal gef/trbten Pr/iparat querseheibenfrei erseheinen, wurden infolge geringer Radioaktivitat sogar als Lfieken in der Markierung gekennzeiehnet.

Abb. I. H~-Thymidin-Einbau. Inkubationszeit: 30min. ChromosomIII mit komplel~ter iVfarkierung, Expositionszeit 9 T~ge. Pfeile bezeiehnen Lfieken in der Markierung an liehtoptiseh querscheibenfreien Abschnitten

Der zweite ExtremfM1, bei dem die Thymidinaufnahme auf die verdiek~en Kinetoehorregionen der thummi thummi-Chromosomen besehr/tnkt ist, weist auf ein spezifisehes Verhalten dort liegender, offenbar heteroehromatischer Querseheiben bei der DNS-Synthese hin; die thummi piger-Strgnge, denen gleiehartige Heteroehromatinstrukturen an den Kinetoehoren fehlen, sind in diesem Stadium der DNS-Synthese stets markierungsfrei (Abb. 2). Dar/iber hinaus wurde in den Prgparaten eine Serie yon Stadien gefunden, in denen auger dem Heteroehromatin eine mehr oder weniger groBe Anzahl einzelner Querscheiben Thymidin aufgenommen hatte. Werden diese Stadien naeh der Zahl der an der DNS-Synthese beteiligten Querseheiben geordnet, dann bilden sie eine Folge yon Uberg~ngen zwisehen den beiden Extremfgllen yon vollst/~ndiger und lokaler heteroehromatinspezifiseher Thymidin-Inkorporation. Thymidin-Aufnahme an einer relativ geringen Anzahl yon Querseheiben zeigen die vier Chromosomen eines Kerns auf Abb. 3 a--d. Eine intensive Markierung befindet sich an den Kinetoehorregionen Mler vier Chromosomen von thummi thummi (Id 2, IIe 3, IIIb 2, IVe 2), demgegenfiber enthalten die homologen Orte bei thummi piger nut in Chromosom I (Absehnitt d 2) Radioaktivit~t yon vergleiehsweise sehr geringer St~rke. Die Absehnitte I d 3, III b 1 und III b 3 yon thummi thummi sind fast ebenso dieht markiert 24*

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H.-G. KEYLund C. 1bELLING:

wie die Kinetochorregionen; schwacher Tritium-Einb~u liegt in den Abschnitten Ia 2, I b 1, I b 4, I e 3, I I b 2, I I d 3, I I I a 5, I I I d 2 an dicken Querscheiben vor. In den gepaarten strukturidentischen Chromosomenabschnitten differiert die Stgrke der Markierungen zwischen den Querscheiben yon thummi thummi und thummi piger nicht. Ein Beispiel

Abb. 2. II3-Thyrnidin-Einbau. Inkubationszeit: 7 Std. ChromoSomen I, If, III mit lokalen Markierungen an den heterockromatischen Kinetochorregionen der Ch. lhum~rd thummiChromosomen

i~r lokalen Thymidin-Einbau gr61~eren Ausmaites mit sehr unterschiedricher Markierungsdichte bieten die Chromosomen auf Abb. 4a und b. Die starksten Markierungen befinden sich wiederum in den Kinetochorregionen der thummi thummi-Chromosomen, deutlich schwachere in den Abschnitten Ia 2, I b 4, I c 2, I e 3, I f 4, I I b 2, I I d 3, I I I a 2, I I I a 5, I I I b 4, I I I c 1, I I I d 2 sowie im Kinetochorabschnitt d 2 des Chromosore I yon thummi piger. I)azu kommt eine Reihe durch wenige Silberk6rner gekennzeichneter Inkorporationen an bestimmten Querscheiben in den strukturidentischen Abschnitten (Ib 1, I b 3, I e 2, I f 2, I I b 4~ I I d 2, I I e 1--e 3, I I f 1, i I I ~ 1, I I I a 3, I I I c 2 - - d 1).

Differentielle DNS-Replikation bei Chironomus thummi

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Die Analyse der versehiedenen Stadien mit lokalen Markierungen hat ergeben, dag bei gleiehem Umfang des Thymidin-Einbaus aueh stats die gleiehen Querscheiben beteiligt waren. In Abb. 5 ist f/it das Chromosom I I I die Zugeh6rigkeit einiger Querseheiben zu seehs definierten Klassen lokaler MarMernng vermerkt. Die zu Klasse I gehSrenden

Abb. 3~d. H 3 T h y m i d l n - E i n b a u . I n k n b a t i o n s z e i t : 2~ S t d . a C h r o m o s o m I I , b C h r o m o som IV, e Chromosom I, d Chromosom III a~s demselben Kern mit nur wenigen schwachen 5'[arkierungen auflerhalb der heterochromatischen Strukt~ren. Chromosom III enth~It in Abschnitt b 3 einen zusgtzlichen H~terochroma.tinblock (Heterochromatin -M11tation)

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H.-G. KEYLund C. PELLIlVG:

Chromosomenorte sind immer markiert, sofern fiberhaupt ein ThymidinEinbau stattgefunden bat. Diese Klasse umfaBt ~usschlieBlich die heterochromatischen Strukturen der thummi thummi-Chromosomen. Den Klassen I I - - V I gehSren Querscheiben an, die stets gemeinsam mit den niedriger bezifferten Querscheibenk]assen markiert wurden.

Abb. ~a u.b. t:Ia-Thymidin-Einbau. I n k u b a t i o n s z e i t : 2~ S t d . a C h r o m o s o m I , b C h r o moson] II, III, IV aus demselben Kern mit lokalem Thymidin-Einbau unterschiedlicher S t ~ r k e . D i e i n t e n s i v e n l V f a r k i e r u n g e n i n d e n A b s c h n i t t e n I d 2, I I c 3, llIb 2 l i e g e n a n d e n heterochromatischen S t r u k t u r e n d e r Ch. t h u m m i t h u m m i - C h r o m o s o m e n . Die strukturd i f f e r e n t e n T e f l e d e r Ch.th. piger-Ch~lomosomen z e i g e n b e i I I u n d I I I k e i n e n T h y m i d i n - E i n b a u

Differentielle DNS-Replikation bei Chironomus thummi

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Diese Verhgltnisse lassen vermuten, dab die versehiedenen Markierungsbilder Stadien eines und desselben l~eplikationssehrittes darstellen, dessen Anfangsoder Endpunkt dutch die aussehlieBliehe Markierung der heteroehromatisehen Strukturen angegeben ist. JenseJts von Klasse VI besteht vermutlieh Bin AnsehluB an die das gesamte Chromosom umfassende DNS-Synthese-Phase. Aus den progressiven Eigensehaften der strukturspezifisehen Thymidin-Aufnahme ist zu sehlieBen, dab die DNS-Synthese fiir die Strukturen der Klasse I die l~tngste Zeit und ffir die Klassen I I - - V I stufenweise k/irzere Zeit beansprueht. Die Phase, in der alle Teile des Chromosoms an der DNS- Synthese beteiligt sind, mul3 unter diesen Umsts am rasehesten abgesehlossen sein. 2. Kombinierte C14-Thymidin- und H 3- ThymidinInjektionen Urn die funktionelle Zusammengeh6rigkeit der A b b . 5. Ctn~omosom I I I des Ch. th. t h u m m i x Ch. th. p i g e r - B a s t ~ r d s (Feulgen-Ffirbung). Die Zahlen I - - V I b e z e i c h n e n die Z u g e h 6 r i g k e i t d e r Q u e r s c h e i b e n zu sechs vers e h i e d e n e n K l a s s e n lokMen T h y midin-Einbaus. Klasse I k~nn ohne B e t e i l i g u n g w e i t e r e r K l a s s e n T h y m i d i n e i n b a u e n , die K l a s s e n I I q I nnr gemeins~m m i t den Klassen niedriger N u m m e r n . * Bei H e t e r o e h r o m ~ t i n - M u t a n t e g e h S r t diese Q u e r s e h e i b e zu K l a s s e I (s. A b b . 3 d)

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H.-G. KEYL und C. PELLING:

verschiedenen beobachteten Markierungsstadien beweisen zu k6nnen und nm zu kl/iren, weleher der beiden Grenzfglle des Thymidin-Einbaus am Beginn des DNS-Syntheseschritts steht, wurden Doppelmarlderungsver-

Abb. 6a c. iKombinierte Behandlung mit C I~- und I-I~-Thymidin. Chromosom III in verschiedenen Markierungsstadien. a Gesamtmarkierung durch C 14 und ~I ~. Inkubationszeit: C I~ 3 Std, H" 30 rain. a Gesamt-Markierung durch C 14, lokale Markierung durch IIL Der strukturdifferente Abschnitt yon Ch. th. piger hat fast ausschlieBlich C I~ aufgenommen. Inkubationszeit: C .4 12 Std, H 3 30 rain. c lokale Markierung dutch C I~, eine geringere Zahl yon Querscheiben durch H ~ markiert. Inkubatiollszeit: C ~ 6 Std, H" 30 min

Differentielle DNS-Replikation bei Chironomus thummi

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suehe angestellt, bei denen nacheinander C14- und H3-Thymidin derselben Larve eingespritzt wurde. Das autoradiographisehe Erseheinungsbild yon C14-markierten Strukturen ist infolge der grfgeren Energie der C~4-Elektronen unseh/~rfer als das von tt3-markierten; die Silberk6rner befinden sieh deshalb in einer Wolke um den strahlenden Chromosomenort verteilt. Ein zus/itzlieher Einbau yon tIa-markiertem Thymidin ist an der streng lokalisierten Silberkornsehieht unmittelbar fiber dem Inkorporationsort zu erkennen. Injektionen, die im Abstand yon 3 Std durehgeftihrt wurden, hatten gewfhnlieh Doppelraarkierungen desselben DNS-Synthese-Stadiums zur Folge. Abb. 6 a zeigt ein Beispiel ffir kompletten Einbau beider Isotopen in Chromosom III. Die fast ltickenlose Silbersehieht unmittelbar fiber dem Chromosom wurde dureh Tritium, die Wolke yon Silberkfrnern um das Chromosom herum dureh C1. hervorgerufen. Bei Larven, die im Abstand yon 6 oder 12 Std behandelt wurden, konnten strukturspezifische Untersehiede in der Verteilung beider Markierungsformen festgestellt werden, die auf Ver/tnderungen des DNS-Synthese-Zustands wghrend der Versuehszeit hinweisen. An Chromosom I I I auI Abb. 6b wurde eine groBe Zahl einzelner Querseheiben dureh die TritiumlVIarkierung betroffen. Die Wolke yon Silberk6rnern deutet dagegen auf einen CX4-Einbau in das gesamte Chromosom hin. Der strukturdifferente Teil des thummi piger-Chromosoms, der naeh den reinen Ha-Thymidinversuehen nur im Stadium der Gesamtmarkierung an der DNS-Synthese beteiligt ist, enth/tlt auger einer deutliehen Cl~-Aufnahme keine erkennbare Tritium-Aktivit~t. Daraus ist zu ersehen, dab die Phase der lokalen Markierung innerhalb der 12stfindigen Versuehszeit auf die Phase der Gesamtmarkierung gefolgt sein mug. Ein Fall mit geringerer Zahl Tritiummarkierter Querseheiben in Chromosom I I I ist auf Abb. 6e wiedergegeben. Dabei zeigt sieh eine /thnlieh strukturspezifisehe Abstufung der aufgenommenen Ha-Thymidin-Mengen, wie sie auf Abb. 3b zu erkennen ist. Die C14-Einbauten umfassen das gesamte Chromosom; sie befinden sich isoliert an dem strukturdifferenten Absehnitt des th~tmmi piyerChromosoms und darfiber hinaus in Absehnitten mit diinnen Querscheiben (z.B. a 4, e 4). In Abb. 7 ist eine lokale C~4-Markierung des Heteroehromatins und einiger weiterer Chromosomenorte bei Chromosom I dargestellt. Eine geringfttgige Beteiligung yon Tritium in den Absehnitten a 2, d 2, e 2--3 ist dabei nieht ausgesehlossen. Die Analyse des Versuehsmaterials der Doppelinjektionen best/~tigt ausnahmslos die auf Grund der reinen I{a-Thymidin-Versuehe gemaehte Annahme, naeh der kompletter Thymidin-Einbau und die Serie lokaler Einbauten in bestimmte Querseheiben als Phasen eines Gesamt-Replikationssohritts auftreten. Die C~4-Gesamt- oder Einzelmarkierungen waren stets mit THtium-Markierungen gleieher oder geringerer Anzahl

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H.-G. KEYLund C. PELLING:

yon Querseheiben kombiniert. Daraus ist zu sehliegen, dab im Verlauf der DNS-Synthese die Zahl der beteiligten Strukturen allmghlieh kleiner wird. Das Endstadium des DNS-Synthese-Sehritts ist dann dutch den isolierten Thymidin-Einbau in die heteroehromatischen Strukturen gekennzeiehnet.

A b b . 7. K o m b i n i e r t e B e h a n d l u n g m i t C ~- u n d I-I~-Thynlidin. C h r o m o s o m I m i t l o k a l e n C~4-Markierungen a n w e n i g e n S t e l l e n . K 3 i s t n u t i n d e n A b s c h n i t t e n a 2, d 2, e 2, e 3 n a c h w e i s b a r . I n k u b a t i o n s z e i t : C x~ 3 S t d , H ~ 30 r a i n

Diskussion

Die vorliegende Untersuchung fiber den Verlauf der DNS-Synthese in den Speicheldrfisen-Chromosomen zeigt, dab zur Vollendung eines I)NS-Synthese-Schritts ftir jede Querscheibe ein Zeitabschnitt yon spezifischer L~nge benOtigt wird. Dutch den besonderen Typus yon Strukturheterozygotie in den Speicheldrfisen-Chromosomen des Chironomus-Bastards werden die stmkturspezifisehen Eigenschaften des l~eplikationsvorgangs besonders deutlich. Die Strukturunterschiede der Speicheldrfisen-Chromosomen yon Ch. thummi thummi und Ch. thummi piger beruhen vorwiegend auf unterschiedlichem DNS-Gehalt homologer Chromosomenorte. Aus den Versuchen ergab sich, dag die DNS-reicheren Querseheiben der Unterart thummi thummi, die besonders in der Umgebung der Kinetoehorregion konzentriert sind, l~nger ffir einen lZeplikationsschritt ben6tigen als die homologen DNS&rmeren Absehnitte bei der Unterart thummi ~iger. Das differente Verhalten bei der DNS-Synthese homologer Abschnitte ist am st/s in Chromosom III ausgepr/~gt, in dem auch die Strukturunterschiede zwischen thummi thummi und thummi piger am gr6gten sind. Ein verzSgeI~er Beginn des Thymidin-Einbaus ist naeh LIMA-DEFAI~IA (1959) eine spezifisehe Eigensehaft des Heterochromatins gegentiber dem Euehromatin bei der DNS-Synthese. Die heteroehromatisehen und euchromatischen Anteile der Speieheldrasen-Chromosomen des

DifferengielleDNS-l~eplikation bei Chironomus thummi

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Ch. thummi-Bastards seheinen entweder gleiehzeitig mit der DNSSynthese zu beginnen oder mit einer Zeitdifferenz, die wegen ihrer Kfirze in den Autoradiographien nieht registrier~ werden konnte. Im Untersehied zu den bisher bekannten Fgllen yon strukturspezifisoh asynohroner DNS-Synthese in Chromosomen teilungsfghiger Zellen (LI~A-DE-FARIA 1959, TAYLOe 1960) land bei den Versuehen mit Uh. thummi die Sonderstellung der heteroehromatisehen Querseheiben gegen/iber den iibrigen Chromosomenstrukturen nut in der lgngeren Zeitspanne ihren Ausdruek, die zum Abschlug eines DNS-Syntheseschritts benStigt wurde. Diese Erscheinung k6nnte mit den speziellen Verhgltnissen in polytgnen Chromosomen und den wenig typischen Eigenschaften des Heteroehromatins yon Ch. thummi zusammenhgngen (s. BAuE~ 1936). Mit dem Nachweis, dab die verschiedenen Stadien yon ThymidinEinbau in einzelne Querseheiben aIs Phasen eines ehromosomalen geplikationsschritts auftreten, stehen die vorliegenden Ergebnisse im Gegensatz zu den Interpretationen, die FICQ und PAVAS (1957) und PAVAne (1958) ffir ghnliche lokale Markierungen an SpeicheldrfisenChromosomen yon Rhynchosciara angelae naeh Ha-Thymidin-Behandlung gefunden haben. Danaeh sollen die lokalen DNS-Synthesen auf die Aktivitgt yon puffs zurfickgehen. Diese Vorstellung stfitzt sich auf einen Fall von exeessiver DNS-Vermehrung in einem Speicheldriisen-Chromosomen-puff yon Rhynchosciara, der dureh RUDKIN und COaLETTE (1957) spektrophotometriseh gesiehert werden konnte. An den SpeieheldrfisenChromosomen yon Ch. thummi sind keine Anzeiehen yon Zusammenh~ngen zwisehen lokalen Thymidin-Einbauten und der puff-Aktivit/tt zu erkennen. Es besteht vielmehr der Eindruek, als w/irden die puffs, deren Orte im Chromosom dureh geringe DNS-Konzentration ausgezeiehnet sind, nur in derjenigen Phase DNS synthetisieren, an der aueh alle fibrigen Chromosomenstrukturen beteiligt sind. Ebenso liegen keine Beobaehtungen daf/ir vor, dab einzelne Querseheiben aul3erhalb eines Gesamt-Replikationssehritts eine DNS-Synthese durehf/ihren kSnnen. Mit Ausnahme der heteroehromatisehen Querseheiben wurde isolierter lokaler Thymidin-Einbau an bestimmten Querseheiben niemals Iestgestellt. Dag die Kinetoehorregionen autonome Replikationen durehfiihren kSnnen, ist zwar auf Grund der vorliegenden Ergebnisse unwahrseheinlieh, bei ttinweis auf die isolierten tIeteroehromatin-Markierungen aber aueh nieht streng zu widerlegen. Vorstellungen fiber die Dauer des Replikationssehritts k6nnen aus den Versuchsergebnissen nur mit Zurfiekhaltung entwiekelt werdeu. Die Doppelinjektionsversuehe von 31/2 Std Gesamtdauer enthielten durehweg keine Anzeiehen ffir eine Ver/tnderung der Replikationsphasen w/~hrend der Versuehszeit. Dies war erst bei den Versuehen mit 61/2 Std

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H.-G. KEYL und C. I~

Gesamtdauer der Fall. Cl~-Markierungen der Querscheiben yon Klasse I - - V I u n d Tritium-Markierungen an Scheiben der Klasse I - - I I zeigten dabei nur den Durchlauf eines Teilabschnitts der partiellen t%eplikation. Da im Gesamtmaterial der Kurzzeitversuche Stadien mit totalem E i n b a u wenigstens doppelt so h~ufig aufgetreten sind als Stadien mit partiellen E i n b a u t e n yon Thymidin, k~nn mit einer Mindestdauer y o n 3 • 61/2 Std, also etwa 20 Std fiir den gesamten Replikationsschritt gerechnet werden. Diese Zeit ist sehr lang im Vergleich zu den Replikationszeiten y o n 6 - - 7 Std, die fiir Initotische Chromosomen bestimmt worden sind (TAYLOU 1960, KOBURG und SC~ULZ~ 1961). Es ist jedoch denkbar, daI~ die Dauer eines DNS-Syntheseschritts yore Polyt~niegrad der Chromosomen ~bhi~ngig ist u n d in den ersten Phasen des Chromosomenwachstums ein wesentlich schnellerer Ablauf mSglich ist als in den letzten Phasen.

Zusammen~assung N a c h Injektionen der L a r v e n des Bastards Chironomu8 thummi thummi X Chironomus thummi piger mit Ha-Thymidin, sowie C14-Thymi din u n d Ha-Thymidin in zeitlichem Abstand, wird der Verlauf der D N S Synthese in den Speicheldrfisen-Chromosomen autoradiograph~sch analysiert. Der DNS-Replikationsschritt beginnt gleichzeitig in allen Querscheiben mit einer gleichm~gigen Thymidin-Aufnahme. I n der E n d p h a s e ist die D N S - S y n t h e s e nur noch in den heterochromatischen Strukturen nachweisbar. Alle iibrigen Querscheiben haben in einer festliegenden Folge die D N S - S y n t h e s e fr~her beendet. Literatur BAUE~, H. : Beitr~ge zur vergleichenden ~orphologie der Speicheldrfisenchromosomen. Zool. Jb., Abt. allg. Zool. u. Physiol. 56, 239--276 (1936). BOYD, G. A. : Autoradiography in biology ~nd medicine. Academic Press Inc : New York 1955. FICQ, A., and C. PAVAn: Autoradiography of polytene chromosomes of IRhynchosciara angelae at different stages of larval development. Nature (Lond.) 180, 983--984 (1957). GALL, J. G.: 5{acronuclear duplication in the ciliated protozoan Euplotes. J. Biophys. biochem. Cytol. 5, 295--308 (1959). K~YL, H.-G.: Untersuchungen am Karyotypus yon Chironomus thummi. I. Karts der Speicheldriisen-Chromosomen yon Chironomus th. thummi und die cytologische Differenzierung der Subspecies Ch. th. thummi und Ch. th. piger. Chromosome (Berl.) 8, 739--756 (1957). --, u. K. STunC~z~:~:Taxonomie und Cytologie yon zwei Subspecies der Art Chironomus thummi. Z. IN~aturforsch. llb, 727--735 (1956). XO~a~RG, E., u. B. SC~ULTZE: Autoradiographische Untersuchungen mit H aThymidin fiber die Dauer der DNS-Synthese, der Ruhepause und der Mitose bei proliferierenden Systemen wie den Epithelien des Darms, des Oesophagus und der Cornea der Maus. Verh. dtsch. Ges. Path. 45, 301--307 (1961).

Differentielle DNS-t~eplikation bei Chironomus thummi

359

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