Zeitsehrift fi~r Krebsforsehung, Bd. 62, S. 481--494 (1958)
Aus dam I{istologiseh-EmbryologischenInstitut der Medizinisehen Universit~t in Budapest (IX. Tfzolt6-u. 58) (Vorstand: Prof. Dr. reed. I. T6~6)
Ein neues Verfahren zur Krebsdiagnose Die Agar-Bindungsreaktion Von
G, CS:~BAu n d I. TOR6 ~ i t 9 Textabbildungen (Eingegangen am 7. Februar 1958)
K u r z z u s a m m e n g e f a S t b e r u h t die R e a k t i o n ~n folgendem: Blutserum y o n K r e b s k r a n k e n gibt m i t Agar-Agar eine Triibung, die auch m i t b]ol~em Auge g u t b e o b a e h t e t werden k a n n . I. D i e M e t h o d i k * Herstellun9 der Agar158ung. Aus handelsiiblichem Agar und physio]ogiseher KochsalzlSsung wird bei 100~ C eine 2%ige Agarl6sung hergestellt. Die so erhaltene L6sung wird dureh eine Nutsche filtriert. Die Nutsehe wird zweekm/~Big aus zehn Schichten Papierwatte und einer etwa 3 em dicken Schicht yon gewShnhcher 86 Watte hergestellt. Dieses Filter wird vor Gebrauch mit erw~rmter Koehsalz15sung durehr trhnkt. Die auf diese Weise hergestellte Agar26 16sung mug ein spezifisches Gewieht yon 9 0,96--0,98 haben, optimal ist eine LichtabZ5 sorption gegeniiber destilliertem Wasser yon q5 9,8--11,0. Eine Vers chiebung sowohl der Liehtif6 absorption als auch der Konzentration (spe3~ 7 P % cone 3 zifisches Gewicht) in positiver oder negativer A b b . 1. Z a h l der f a l s c h e n n e g a t i v e n Riehtung beeintr/ichtigt die Sieherheit der u n d p o s i t i v e n l ~ e a k t i o n e n in A b Reaktion bedeutend. Abb. 1 zeigt die Zunahme h ~ n g i g k e i t y o n der E : o n z e n t r a t i o n der falseher~ positiven und negativen l~eakder A g a r l O s u n g . Ordinate: K o n z e n tionen in Abhgngigkeit yon tier Konzentra- t r a t i o n tier A g a r l O s u n g . Abszisse; b e r tier g e s t r i c h e l t e n Linie: Z a h l tion. Die Agar15sung wird am besten in einem O der f a l s e h e n Dositiven, d a r u n t e r die Ktihlschrank zwischen + 2 und + 40 C auf- falschen neg~tiven Reaktionen in Prozenten aller F~eaktionen. bewahrt. Optimum 2 % Vorbereitung der Reaktion. Zur Durehfiihrung der Reaktion kSnnen gew6hnliehe PetriSehalen beniitzt werden, zweckm~tl~iger sind aber unsere speziellen Schalen. Vorteil dieser Schalen ist die glatte Oberflache und ihre Durchsichtigkeit. Die Schalen werden so hergestellt, alas in einem Rahmen aus Kunststofi eine geschliffene Glasplatte yon etwa 9 em Durehmesser gelegt wird. Dieser l~ahmen wird naehher
* Fiir die initiative Mitarbeit bei der Ausarbeitung der Methodik danken wir Herrn Diplom-Zoologen F. I. Kiss herzlichst. Z. Krebsforsch. Bd. 62
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m i t Agar. gusgegossen, so lunge, bis die Dicke der Agarsehieht etwa 1,5--2 m m erreicht. (In die yon uns empfohlenen Sehalen werden 10 ml Agar gebraeht.) Naeh dem Erstarren des Agars werden LScher yon etwa 6--7 m m Durehmesser m i t einem Locheisen in den Agar busgestanzt (Abb. 2). Nattirlieh k a n n all dies ~ueh in gew6hnliehen Petri-Schalen hergestellt werden. Optimalerweise kSrmen bei den yon uns benutzten Schalen 20 L6eher in den Agar geschnitten werden, was die gleiehzeitige Durchfiihrung yon l0 Reaktionen u n d ihren Kontrollen erm6glicht. Durch/i~hrung der Reaktion. D~s in Wassermann-R6hren abgenommene Blut wird zuerst bei einer Umdrehungszahl yon 2500--3000/min etw~ 5 rain lung zentrifugiert. Zur Reaktion darf n u r frisehes Abb. 2. Aga,rplatte mit ausgestanzten Serum benfitzt werden, das vor n i c h t L6ehern t~nger ~ls 24 S t d ~bgenommen wurde. I-Igmolyse des Blutes und Lipgmie s~6ren ebenfalls die Reaktion. Solehe Sera miissen qc u n b e d i n g t ausgesehieden werden. Naeh dem Zentrifugieren werden 0,2 ml Serum in ein Reagenzglas gebraeht und mit der gleiehen 20 Menge einer physiologisehen Koehsalzl6sung verdtinnt. Naehher kommen die Reagenzr 60 gli~ser fiir 3 0 m i n in ein Wasserbad yon 8c s) :) e0 v e: 56--570 C. Temperatur des Wasserbades u n d Dauer der I n k u b a t i o n mtissen genau einAbb. 3. Zahl der falsehen negativen gehMten werden. Abb. 3 zeigt, dab naeh und positiven Reaktionen in Abh~ngigkeit yon tier Temperatur des einer I n k u b a t i o n bei n u r 500 C die Zahl der Wasserbades. Abszisse: Die falsehen falsehen positiven Reaktionen auf 90% anpositiven Reaktionen fiber der gestristeigt, w~thrend eine I n k u b a t i o n bei 620 C ehelten Linie, darunter die falsehen negatlven Reaktionen in Prozenten die Zahl der negativen Reaktionen auf 86 % aller Reaktionen. Optimum bei 56,7~C erhSht. Temperaturen yon fiber 62 ~ C denaturieren die Eiweil3e u n d bringen sie zur Coagulation, was sich auch in der Xnderung des Farbtones des Serums zeigt. Wie die Abb. 3 zeigt, ist die optimMe Temperatur des Wasserbades 56,7 ~C. Eine ebenso wiehtige Rolle spielt aueh die Zeitdauer der Inkubation. Abb. 4 zeigt, dug naeh einer I n k u b a t i o n yon n u r 10rain oder einer ganzen J Stunde, die Zahl der falsehen positiven Reaktionen :5 30 ~L5~/n 6g auf 38% ansteigt. Abb. 4. Z a M der fa]schen W~hrend die Sera im Wasserbade inkubiert positiven Reaktionen in Abh~ngigkeit yon der Dauer der werden, wird die zur I~eaktion notwendige 2%ige Inkubation. Ordinate: InkubaAgarl0sung in einem Troekensehrank bei 100 ~ C tion in /~Iinu~en/kbszisse: Die oder in einem Erlenmeyer-Kolben in heil3em Wasser falsehen positiven Reaktionen in einen fliissigen Aggregatzustand gebraeht. Wiehtig in Prozmtten aller Reaktionen. Optimale Inkubation : 30 rain ist, dab M r n u r soviel Agar verfliissigen, als zur Reaktion notwendig ist, d~ das wiederholte Verfliissigen und Erstarren die Elastizit/~t und die Erstarrungsf/~higkeit des Agars vermindert. Auch muff beaehtet werden, dab die AgarlSsung niemals kochen
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darf, weil das zu einer Erh6hung der Konzentration fiihrt. Aueh der fliissige Agar wird ill einem Reagenzglas ins Wasserbad gebraeht. Naeh der Inkubation wird in die Reagenzgl~ser mit 0,2 ml Serum und 2ff physiologiseher KoehsalzlSsung noeh 0,2 m] AgarlSsung zugemessen. In dieser LSsung bekommen wir also eine Agarkonzentration yon 0,66%. Naeh kurzem Sehfitteln wird jetzt das Serum-Agar-KoehsalzlSsung- Gemisch mit Pas~eur-Pipetten in die schon vorher ausgestanzten LSeher der Agarplatten gebracht. Die LScher sollen so weir gefiillt werden, dal~ sieh die Mitte des Fliissigkeitstropfens gerade etwas iiber die UmAbb, 5. Der Durehleuehtungsapparat gebung erhSht. Zur Sieherheit werden aus jeder Blutprobe 2 Reaktionen durehgefiihrt. Nachdem die Aussparung e n d e r Agarplatte mit dem UntersuehungsmateriM gefiillt wurden, bringen wir die Sehalen wiederum ffir etwa eine hs~lbe Stunde in einen Kiihlschrank von 2 - - 4 ~ C. Abb. 6. Sehematiseher Sehnitt dureh den Das Ablesen der Reaktion. Dm'ehleuehtungsapparat Naehdem das Material eine halbe Stunde in dem Kiihlsehrank war, kann die Reaktion abgelesen werden. Gtinstig fiir diesen Zweek ist der auf Abb. 5 gezeigte Durchleuehtungsaloparat. Ira unteren Toil des Apparates sind 5 Gliihbirnen yon je 10 W a t t montiert, welche die Sehale - - die 8 cm fiber den Birnen in dem Apparat gefestigt w i r d - yon der Seite durchleuchten (Abbildung 6). Auf Grund des Tyndall-Effektes wird jede~Triibung des Agars gut sichtbar und auswertbar. Die Reaktion wird Ms positiv gewerte%, wenn im SerumAgar-Koehsalz-Tropfen eine Abb. 7. Das Ablesen der Reaktion. Der dreieckige ausgesproehene Trfibung festAussehnitt dient nur zur 0rientierung. Darunter gestellt werden kann. Ist die die Reaktionen. Von links naah reohts: I. I~eihe Triibung nieh~ ausgesprochen, l~eaktionen 1 und 3 sind fraglioh, Reaktion 2 ist aber der Agar dennoeh nicht sehwach positiv. 2. Eeihe: Reaktion 2 ist schwach positiv. 3. Reihe: I. Reaktion ist stark positiv. ganz klar, so is~ das Resultat 4. Reihe: Reaktion ~ ist positiv. Alle iibrigen Reakder Reaktion nieht eindeutig tionen Bind negativ. Nut vollkomnlene Triibung des und die Reaktion fraglieh. Im Agars zeigt die positive Reaktion an 33*
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Falle der negativen Reaktion bMbt der Agar vollkommen durehscheinend (Abb. 7). Die geaktion ist auch dann als positiv zu bewerten, wenn yon 2 parallelen I/eaktionen nur eine ein positives Ergebnis ergibt.
II. Untersuchungsergebnisse mit der Agar-Bindungsrea/ction * Bei der Bewertung jedes krebsdiagnostischen Verfahrens ist es notwendig aul~er einer groBen Anzahl yon Geschwu]stkranken aueh gesunde Personen sowie an verschiedensten anderen Erkrankungen Leidende nach diesem Verfahren zu untersuchen. Wir untersuehten his zum Absehlul~ vorliegender Publikation 611 Patienten, die an verschiedenen Gesehwfilsten litten, 28 Patienten mit Pr/~eaneerosen, 528 an anderen Krankheiten Leidende a n d 983 Gesunde. Insgesamt priiften wit also 2150 Sera. Eine detailierte Zusammenstellung aller bis zum 1.3.58 durehgefiihrten Untersuehungen (etwa 3500 Fi~lle), kann bei den Verfassern angefordert werden. Histologisch bestiitiate Geschwi~lste. Bei 375 Fiillen yon histologiseh best/~tigten Carcinomen war die Reaktion in 85,9% positiv. Auf die 14,1% negativen l%lle kommen wir noeh zurfick. Die Rea.ktion fiel positiv aus bei 12 yon 20 (60%) histologiseh best//tigten Sarkomf~;llen. 68,4% yon Lymphogranulomatosen (23 Patienten) und 90% yon N~elanobtastorner~ (20 Pa.tien~en) weiterhin 3 yon 8 l%llen yon Leuk&mie reagierten positiv. Sowohl theoretisehe, als aueh klinisehe ~Jberlegungen dfirften eine gesonderte Behandlung der oberfliiehlichen Carcinome und der Patienten im Endstadium rechtfertigen. Von den 62 (14,1%) lalsehen negativen Reaktionen der Gesamtzahl der histologiseh gesicherten Careinome betreffen 18 oberfl~ehliehe Carcinome. Bei diesen machen die falsehen negativen 28,6% aus. Von den histologiseh gesieherten CareinomNllen betrafen 55 Patienten die bereits im Endstadium waren (Kaehexie, Anergie). Die ~ehrzahl dieser F~lle waren Mamma-, Uterus-, und Reetumcareinome. Bemerkenswert ist, daft nur 24% dieser Fglle eine positive t~eaktion gaben, also wird die l~eaktion im Endstadium der Krankheit in der Mehrzahl der F~lle (76%) negativ. Naeh W ~ T ~ N 1~ kann yore Standpunkte des immunbiologischen Naehweises der Verlauf einer Gesehwulsterkrankung in mehrere Phasen eingeteilt werden. Seiner Ansieht nach erseheinen zuerst die Antigene und erst lange nach ihrem Auftreten kSnnen die AntikSrloer naehgewiesen werdem I n der Folge vermehren sieh die Antik6rper nnd erst ira Verlaufe der weiteren Proliferation nehmen die Antigene soweit * Auch an dieser Stelle mSchten wit Herrn Dr. reed. B. JANIKOVSZKIftir die gewissenhafte Hilfe bei den klinischen Untersuchungen unseren besten D~mk ausdriicken.
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zu, dab sie die vorhandenen AntikSrper binden. Naeh diesem Zeitpunkt k5nnen weder Antigen, noah AntikSrper naehgewiesen werden. Versuehen wir unsere Ergebnisse als Ausdruek eines immunbiologischen Vorganges zu deuten, so best~tigen sie die Ansehauung WA~R~+~s. Abb. 8 zeigt die graphisehe Darstellung der Theorie W A T ~ R ~ s (dargeste]lt durch ausgezogene Linien) nnd zeigt gleiehzeitig die auf Grund W ~ R ~ s Ansehauungen ausgewerteten eigenen Ergebnisse (gestriehelte Linie). Wie die ausgezogenen Linien der Abbildung zeigen, ist in der ersten Periode das Ubergewicht des Antigens eharakteristiseh. Sparer treten die Immunstoffe /f~--~'\ immer mehr in Erseheinung und in % ]1 cr \ an~ere Yrendieser Periode kann das Antigen fiber- ...%~1 .~ / haupt nicht nachgewiesen werden. In einer sp~teren Phase kommen beide ins Gleiehgewieht. Bei den bisherigen, zur Diagnose beniitzten AnPanes- IPhase der Pmllfera/ian I rind*tad/urn Mad~urn immunbiologischen l~eaktionen war die Antigenkurve die breitere und Abb, 8, Nachweisb~rkeit des Anlbigens un4 Antik6rpers in den verschiedenen die Kurve des Immunstoffes schm/~ler Phasen tier Erkrankung. Ansgezogene und niedriger. Wie die gestriehelte Linien: Qu~ntit~tsverh~ltnisse nach AVATER,~IAN. Gestrichelte Linie: Qn~ntit~it des Linie zeigt, erreicht bei unserer Immunstoffes in den eigenen Versuchen Reaktion der Spiegel der Immunstoffe frtiher die zum Nachweis notwendige H6he und dieser Spiegel h~lt sich auch vim l~nger. Dies entsprieht auch gewissen klinisehen Erfahrungen. Auf Grund dieser Ausfiihrungen liege sieh nicht nnr der negative Ausfall der Reaktion im Endstadinm der Geschwulsterkrankung, sendern anch die geringere Genauigkeit der Reaktion bei Sarkomen gegenfiber Carcinomen deuten: Sarkome sind n/imlich maligner, bilden frfiher Metastasen; deswegen gelangt der Patient viel schneller in ein immunologisch negatives Endstadium. Zusammenfassend 1KBt sich sagen, dab der Sicherheitsgrad der Reaktion 82,3% betrKgt bei Einbeziehung yon Sarkomen, Lymphogranulomatosen, Melanoblastomen und Lenk~mie. Die Reaktion ist nieht geeignet zum Naehweis der Leukgmie. Zum Nachweis der Sarkome ist die Reaktion weniger geeignet als zum Nachweis der Careinome, aber auch Sarkome kSnnen in einem gewissen frfihen Stadium - - ira FMle yon Reihennntersuchungen - - mit nachgewiesen werden. Mit der Reaktion kSnnen abet praktisch alle aktiv proliferierende Careinome der inneren Organe naehgewiesen werden. Beziehen wir oberfl/ichliche Carcinome nnd die negativen Ausfs im Endstadium der Geschwulsterkrankungen in den Prozentsatz der negativen Ergebnisse
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nicht ein, so zeigt sich, dab der Sicherheitsgrad ffir histologisch bests Ca,rcinorae 95,2% betriigt. Mangels genfigender Angaben waren wir nicht in der Lage festzustellen, ob unter den 4,8% falschen negativen Fs nieht einige oder raehrere bereits ebenfMls irn Endstadium sich befanden. Daneben scheint es uns, dab es der Reaktion nicht zum Naehteil, sondern gerade zum Vorteil dient, dab sie negativ wird in einera so fortgeschrittenen Stadium der Krankheit, in dera yon einem ehirurgischen Eingriff nichts raehr zu erwarten ist. Sehr viele klinische Fs und Beobaehtungen wi~hrend l~ngerer Zeit zeigen, dab die Reaktion sich aueh diesbezfiglich als ein sicherer Indicator erwies. Wenn also bei einem histologisch bestgtigten, aktiven Careinom eines inneren Organs die Reaktion negativ verl5u/t, so zeigt dies das Endstadium der Krankheit an. Die Reaktion nach Operation und R6ntgenbestrahlung. In insgesamt 69 Fs untersuchten wir Patienten post operationera. Die Zeitspanne zwischen Operation und Vornahrae der Reaktion betrug in einigen F/fllen nur wenige Stunden oder Tage, in anderen F/fllen sogar raehrere Jahre. Zusararaenfassend fanden wir, dab in 76,5% der F/ille die Reaktion auch nach der Operation positiv ausf/~llt. Unraittelbar nach der Operation und eventuell einige Tage nach der Operation wird die Reaktion in vielen F/~llen negativ, urn sp/~ter noch ffir ls Zeit positiv zu bleiben. Wir kSnnen nicht genau bestiraraen, wie lange die Reaktion positiv bleibt, da dies unter anderera auch yon der Gr6Be der Geschwulst, vora Grade des Eindringens in die benachbarten Gewebe, usw. abhs Tatsache ist, dab wir 5 ~onate nach totaler Larynxexstirpation noch positive Reaktionen erhielten, 8 Monate nach der Operation aber verlief die Reaktion in raehreren Fs bereits negativ. Im Falle yon Mamma-Araputation erhieltcn wir aueh noeh nach 5 Jahren positive Reaktionen. Einige Beobaehtungen zeigen, dab die Reaktion unraittelbar nach I~Sntgenbestrahlung negativ wird, um kurz darauf ira verstiirkten Mal3e positiv zu werden. Leider liegen aber zur Zeit viel zu wenig Beobachtungen vor, um fiber diese Frage etwas genaueres aussagen zu kSnnen.
Nur lcliniseh diagnostizierte Gesehwi~lste. Wir untersuchten 96 Fi~lle yon nur klinisch diagnostizierten Geschwfilsten. Die Reaktion war in 86,4% dieser F/ille positiv. In dieser Kategorie betrug also der Frozentsatz der falschen negativen l~iille weniger als in der Gruppe der auch histologisch gesieherten Geschwfilste. Dies kann dadureh erkls werden, dal~ in dieser Gruppe der Untersuchungen weniger Patienten bereits im Endstadium waren.
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Wir untersuchten 28 Fs mit Zusts die Ms Pri~caneerosen aufgefMR werden kSnnen, wie: Ulcus pylori, Gastritis chronic~ mit Aehylia gastrica, Leukoplakie, Erosio portionis, Metropathia haemorrhagica, Mamma sanguinolens, P~chydermia lar~mgis. Von den 28 F~llen gaben 24 eine positive l~eaktion, woraus zu sehlief3en ist, dab die Reaktion bereits eine bSsartige Entartung der Zellen nachzuweisen imstande ist. Falsche positive Fi~lle. Wir untersuehten weiterhin 528 Patienten mit versehiedensten Erkrankungen anderer Genese. Von diesen nicht an Krebs erkrankten Personen gaben 68, d.h. 12,8%, eine positive Reaktion. Diese Zahl ist reeht gering, wenn wir beachten, dal3 bei den meisten auf Immunreaktionen sich aufbauenden diagnostischen Verfahren die fMsehe Positivits 30--50% betragen kann. Die in dieser Gruppe untersuehten 528 Patienten litten an 139 versehiedenen Krankheiten. Die Untersuehungen wurden ohne jede besondere Auswahl bei K r a n k e n vorgenommen, die im Verlaufe yon etwa 8 Monaten in den mit uns zusammenarbeitenden Kliniken und Krankenh/~usern behandelt wurden. Die F~lle entsprechen etwa dem Durehsehnitt des k]inisehen Krankengutes. So ist es verst/~ndlieh, dal3 manche Krankheiten nut mit je einem Tall in unserer Statistik vertreten sind, ws gerade die h~ufigsten, meist chronischen Erkrankungen in grSfterer Zahl untersucht wurden. Eine Zusammenstellung soleher F~lle zeigt Tabelle 1. Tabelle I Positiv Diabetes mellitus . . . Hepatitis . . . . . . . Lues . . . . . . . . . Polyarthritis rheumatica Tbc. pulmonum . . . . Chololithiasis . . . . . Hypertrophia prostatae
1 2 5 7 3
Gesamtzahl 24 7 8 18 62 22 5
Nega,tiv 23 7 8 16 57 15 2
Aus der Tabelle ist ersiohtlieh, dM3 die wichtigeren chronischen Erkrankungen nur in sehr wenigen F~llen falsche positive Reaktionen gaben. Einige andere Krankheiten, z. ]3. Prostata-Hypertrophie, gaben in einem vim grSl3eren Prozentsatz positive Reaktion. ]3ei dieser Erkrankung z. ]3. kann aber die MSglichkeit einer Geschwu]st nieht mit Sieherheit ausgesehlossen werden. In einem FMle konnte sogar bei einer bereits nach Zusammenstellung der Statistik durchgefiihrten Operation der Tumor tatsgchlich gefunden werden. Eine andere Erkr~nkung, bei der die Zahl der falschen positiven Fal]e betrgchtlich
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ist, ist die Cholelithiasis. Auf diese Frage soll aber hi anderem Zusammenhang noeh eingegangen werden. Zur Kontrolle erhielten wit Blur yon Gesunden, vom Staatliehen Ungarisehen Blutspenderdienst und yore Gesundheitsdienst der Ungarisehen Armee. Vom Blutspenderdienst erhielten wit insgesamt 700 Proben yon denen 49 (7 %) eine positive l~eaktion gaben. Von 3 posiriven Spendern erhielten wir wiederholt Proben zu weiteren Kontrollen, bei denen aueh diese 3 sieh als negativ erwiesen, so daft das endgiiltige Ergebnis 6,6% positive Fglle war. Wir m6chten aber betonen, daft alle diese Blutproben yon Personen yon versehiedenstem Alter stammten. Aueh ist es anzunehmen, daft die fiir unsere t~eaktion sehr wiehtigen Kautelen nieht immer eingehalten wurden, da einige Proben sehon mit bloftem Ange gut siehtbar lip/imiseh waren. Von der Ungarisehen Armee erhielten wir 283 Proben. Von diesen gaben 10 also 3,55 % eine positive Reaktion. Die Blutentnahme erfolgte in diesen F/~llen am Morgen auf niiehternem Magen, am vorangehenden Abend erhielten jedoeh die Soldaten die gewohnte, ziemlieh fettreiehe Verpflegung. Die Abnahme des Blutes und Kautelen der Reaktion. Wghrend der Versuehe zeigte es sieh, daft bei Lip/~mie die i~eaktion immer ein falsehes Ergebnis zeigt. Weiters stellte es sich heraus, daft es sich hierbei nieht nur um eine optisehe Wirkung handelt, sondern daft das Fett in irgendeiner Form sieh mit dem Agar binder, wodurch OpMeszenz und sogar eine massive positive Reaktion zustande kommt. Lipiimisches Blut dar] also bei der Reaktion nicht verwendet werden/ Nicht immer kann aber genau festgestellt werden, ob tatsgchlich eine Lip/~mie vorhanden ist. Kurz naehdem sehr fettreiehe Speisen gegessen wurden, oder 1/~ngere Zeit sp//ter kSnnen im Blutserum geringe Mengen yon F e t t vorhanden sein, die mit bloftem Auge nicht wahrgenommen werden kSnnen, trotzdem aber falsche positive Reaktionen verursachen. Deshalb sind die Kautelen der geaktion die folgenden: 1. Am Tage vor der Reaktion muft der Patient eine fettfreie DiRt einhalten. 2. Am Abend vor der Blutentnahme darf der Patient nur gekochte Kartoffeln (ohne Fett) und Apfel essen. 3. Die B]utentnahme erfolgt am Morgen auf nfiehternem Magen in Wassermann-RShren. 4. Der Patient darf am Tage vor der Untersuehung keine Schlafund Beruhigungsmittel einnehmen, ebenso muB er sieh aueh yon allen alkoholischen Getr/inken enthMten. In erster Linie verursacht das Sevenal - - wahrseheinlieh durch LSsung der Lipoide - - eine falsche positive Reaktion.
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5. Die Blntentnahme soll erst dann erfolgen, wean das zum Ss der Stiehstelle benutzte Benzin, Xther usw. bereits verdampft ist. Bei genauer Einhaltung dieser Kautelen erhielten wir iiberhanpt keine falschen positiven Ergebnisse. ~Venn das Serum eines Patienten wiederholt ,,Agar-Bindung" zeigte, so wa,r - - naeh unserer Erfahrung - in jedem Falle irgendwo im Organismus ein maligner Prozel3 im Gauge, selbst dann, wenn der Kliniker keinen solehen Verdaeht hegte. Die wahrscheinlieh falsehen positiven Ergebnisse, die wit bei einigen klinisehen Reaktionen erhielten, waren hSchstwahrseheinlieh dureh eine latente Lips verursaeht. Die grSBte Zah] yon falsehen positiven geaktionen traten n/imlich immer bei Blutproben auf, die am Morgen naeh den Besuehstagen abgenommen waren. Aueh der laohe Prozentsatz yon falschen positiven FNlen bei Chotelithiasis kSnnte dureh eine Verz~gerung der Fettresorption verursaeht sein.
III. Die Theorie der Agar-Bindungsreaktion Wie schon eingangs erw/~hnt, deuten wir die ,,Agar-Bindungsreaktion" als eine immunologische. Die bisher bekannten diagnostisehen Verf~hren, die auf immunbiologischen Reaktionen anfgebaut waren, gingen yon der Ann~hme aus, dab Stoffe der Geschwulstze]len fiir den Organismus a]s fremde Stoffe wirken und eine wenn aueh noeh so geringe Immunreaktion hervorrufen. DeshMb vrurde versueht, zum Teil direkt aus der Geschwulst, zum Tell a,us Exkreten z.B. Ham, d~s Antigen herzustellen u n d e s mit dem Immunsernm in l~eaktion zu bringen. Die ~uf dieser Grundlage aufgebauten l~eaktionen bieten nur einen geringen Grad der Sicherheit. Nicht nur die hohe Zahl der falschen Reaktionen, sondern auch die teehnischen Sehwierigkeiten der Durehfiihrung sind die Ursaehe, dal~ diese Reaktionen in der Praxis nur wenig Anwendung fanden nnd finden. Wir begannen den Ausbau unserer Reaktion yon ganz anderen theoretisehen Grundlagen aus. Wir nahmen n/imlieh an, dag die Geschwulst bzw. die ersten malignen Zel]en im Organismus bei ihrer Aggression Ver~nderungen im Organismus verursaehen, die ihrerseits erst zn immunbiologisehen Reaktionen ffihren. Die b6sartig wuchernden Zellen mfissen n~mlich die Barriere der umgebenden norm~len Gewebe durchbreehen, die wohl in erster Linie eine Hyalurons~ure-HeparinBarriere ist. Nimmt doeh sowohl die Zahl der Heparin enthaltenden ~astzellen als auch die sich metachromatisch f/~rbenden Granula im Bindegewebe in der Umgebung yon Geschwtilsten zu. Heparin ist aber nach den Untersuchungen yon G. AsBo~-HA~sv,z~ (zit.n) u. a. ein Vorl/iufer der Ityaluronss als mit Schwefels/~ure verestertes ~Iueopolysaceharid geh6rt es zu den Bindesubstanzen des K6rpers n. Dabei ist Heparin aueh Ms Antagonist der Hyaluronidase bekannt.
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Naeh GREENSTEI~4 enthalten Gesehwulstzellen genauso wie auch die Bakterien zur {Tberwindung der Mueopolysaccharid-Barriere des Bindegewebes Hyase. Die bSsartige Geschwulst diirfte bei der Proliferation und Durchbreehung der Barriere diese angenommene Hyalurons/~ure-Hel0arinSchranke abbauen; dadurch entstehen Depolymerisate, welehe, wie es anzunehmen ist, ghnlieh wie das Heparin selbst an Eiweil~ gebunden im Blur erseheinen (Tabelle 2). Gegeben ist also ein Protein, dessen Polysaccharid-Hapten ein Abbauprodukt eines Stoffes yon grol~em Molekulargewicht ist; dieses Hapten kommt normalerweise im Blut nieht vor. Unseres Eraehtens ist es dieser Stoff, der die Bildung yon ImmunkSrpern auslSst. Eine solehe Annahme T~belle 2. Serummucoproteidein Milligrammscheint durchaus be~rozenten nach GREE~ST]~I~ griindet. Nach den AnEiweil~ I Polysaccharid Koeffizient gaben yon versohiedenen Autoren steigt der Normal 60 9,9 0,16 Blutspiegel des AcetylNeop]asie 128,7 23,7 0,17 g]ueosamin, der Glueuronsgure und der Penrosen bei Geschwulsterkrankungen an (v, 9, 12). Alle diese Stoffe sind Baustoffe yon Mucopolysacchariden. Nach BRDICKA (zit. 7) nehmen die Mueopolysaeeharide bei malignen Prozessen im Blur zu. Gleichzeitig nimmt das Sernmmueoid zu, welches neben den schon erwghnten Verbindungen noch Galaktose und Mannose enthglt (Tabelle 2). Dasselbe zeigen die Untersuchungen yon GLAss und H~roaI~s (zit. 4), naeh denen das Blur yon Geschwulstkranken weniger gerinnungsfghig ist, was dem grSl~eren Gehalt yon sulfatierten Mucopolysacehariden zugeschrieben wird. Zum Nachweis der gegen diese Mueopolysaeeharide gebildeten Immunstoffe mul]te ein Antigen beniitzt werden, welches in seiner Struktur den Einheiten ghnlich ist, aus welehen sieh das Heparin aufbaut, gleichzeitig abet kein kSrpereigener Stoff ist. Untersuchen wir das Heparin, so sehen wir, dal~ das a-Heparin aus d-Glueosamin und aus Glueuron- und Schwefelsgure a, 7 aufgebaut ist. Das yon 1V[~BE~T und WIX~EI~STEIXs iso]ierte fi-tteparin enthglt Galaktosamin und Gincuronsgure und etwas weniger Schwefelsgure a]s das ~-Heparin. Sein Molekulargewieht betrggt 16000. Von den pflanzlichen Mueopo]ysaeehariden kommen dementsprechend die Galaktane in Betracht, als Stoffe mit ghn]ichen Gruppen, die auch in versehiedenem Grade erstarrungsfghig sind. Wir priiften verschiedene Stoffe dieser chemischen Gruppe; bisher erwies sich ffir die Reaktion Agar-Agar a]s geeignetster Stoff. Es ist aber durchaus
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a.nzunehmen, da.$ aauf Grund dieser ~berlegungen ein ftir den Zweck noeh besser geeignetes pfla,nzliches Polysa.ceha.rid gefunden werden kSnnte. Diesbeziigliche Versuche sind im Gaange. Aga.r ist a.ufgeba.ut aaus 8 Molekiilen d-Gaala.ktose, aan die sieh ein Molekiil 1-Ga.la.ktose binder. Letzteres Molekiil ist mit Sehwefels/iure verestert. Da.neben enth//lt Aga.r in nicht gena.uer bekannter Bindung etwa. 3,6--7,2 % Urons//ure und etwa. 3 % Pentosen 2, 5, s. Seiner Struktur und seinen Komponenten na.ch ka.nn a.lso Aga.r am ehesten dem fiHeparin verglichen werden. Daas Molekula.rgewieht des Aga.rs betr//gt 3000--900011 . Daas Wesen der Aga.r-Bindungsreaaktion besteht u.E. in folgendem: Bei bSsaartigen Geschwtilsten sind im Orga.nismus ann EiweiB gebundene Mucopolysaaecha.ride vorhaanden, gegen die spezifisehe Immunstoffe aauL treten. Diese Immunstoffe werden bei der Rea.ktion durck ein kSrper~remdes, ersta.rrungsf~higes Mueopolysaaccharid, den Agaar, na.chgewiesen. Aga.r ka.nn n~mlich ebensolehe Verbindungen eingehen wie daas ttaapten, daas im Serum vorhaandene depolymerisierte Mueopolys~echa.rid (ttepa.tin). BoYo ~ h~lt Reaktionen bei so wenig versehiedenen Stoffen ffir mSglich. Naattirlieh stellt sieh die Fraage, womit wir unsere Hypothese begriinden kSnnen. Die Verwa.ndtseha.ft zwisehen Agaar und Hepaarin beweist nicht nut die Ahnlichkeit ihrer Struktur, sondern auch die Erseheinung der ~etaachromasie. Aga.r und Hieparin zeigen n~mlieh mit Toluidinblau eine g~nz gleichsinnige Metaehroma.sie-Erscheinung. Unser zweiter und wiehtigerer Beweis ist, dM~ die Agar-Bindungsrea.ktion dureh Zug~be yon Spuren (7-GrSBenordnung) yon Heparin zum Serum, gehemmt werden ka.nn. Wit nehmen a.n, daub in diesen Fs daas Hepa.rin den Immunstoff binder, na.ttirlich in Abh~ngigkeit yon der Quantit~t des zugegebenen Hepa.rins und bei der Zugaabe yon Aga.r keine freien Gruppen mehr vorha.nden sind, wodureh die Rea.ktion negaativ wird. Geraade diese Beobaachtung wirft aaber die n~ehste Fraage aunt, ob es sieh n~mlich taats~chlieh um eine Immunreaktion oder um eine aandere Heparinwirkung handelt. Weiter oben ha.ben wit bereits aausgefiihrt, da.~ Lip~mie eine ~Msche Positivit~t verursaaeht. Hep~rin hat nun aaueh eine lipolytische Wirkung. Also kSnnte aangenommen werden, da.B Heparin nieht aals Antigen mit dem Immunserum in Verbindung ~ritt, sondern eventuell nur bei der Lipolyse der im Serum vorhaandenen Gesehwulststoffe yon Fetts~ure-Naatur eine Ro]le spielt, wodurch die positive Reaaktion zusta.nde k~me. Deshaalb untersuchten wir, ob aueh Monosa.ceharide, die bekannterweise keine ]ipolytische Wirkung ha.ben, die Reaaktion hemmen kSnnen (Ta.belle 3). Wir konnten feststellen,
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G. C s ~ e A u n d I . T 5 ~ 5 :
dub 17 mg Galaktose eine gleich starke Hemmung verursachten -durchschnittlich 60% der Reaktionen hemmen - - wie 330 y Heparin. Der Hemmungseffekt der d-Glucose betr/~gt nur etwa 50%, der yon Fructose nur etwa 25% der Wirkung des Heparins, sofern wit gleiche ~engen benfitzen wie im Falle der Galaktose. Da diese Stoffe keine lipolytische Wirkung haben, infolge der Ahnlichkeit ihrer Konstitution ~ber die Immunstoffe binden und ~uf diese Weise die Reaktion hemmen kSnnen, spreehen diese Versuche fiir die Immuntheorie der Reaktion. Die Hemmung der Reaktion dutch Heparin usw, kann a~ch zu einer quantitativen Bestimmung der Serum-Immunstoffe beniitzt werden. Der Vorg~ng der ImmunreakTabelle 3 tion kann fibrigens auch mikroQuantit~t Gehemmte skopisch verfolgt werden. Zuerst zur inReakti~ ~ne~ bilden sich kleinere Pr/~cipitate, beniitzten Reaktionen welche langsam zunehmen und Stoffe erst nach der Erstarrung des Heparin.. 330y 60 Agars erfolgt die vollst/~ndige Galaktose . 17 m g 60 Trfibung (Abb. 9a--c). (Wir beGlucose . . 17 m g 33 Fructose . . 17 m g 14 sch~ftigen u n s i n u n s e r e n g e g e n w/~rtigen Untersuchungen mit diesen Erscheinungen.) Die Beobachtung der Phasen der Reaktion wird dadurch ermSglicht, dal~ Agar bei Zimmertemperatur nur langsam erstarrt. Ffir den ImmunkSrpercharakter des im Serum vorhandenen Stoffes spricht auch seine Temperaturempfindlichkeit. Anch die statistischen Ergebnisse bekr/~ftigen die Immuntheorie der Reaktion. Die Tatsache n/~mlieh, dal~ im Endstadium der Krankheir die l~eaktion regelm/~ftig negativ verl~uft, wfirde bedeuten, dab die Antigene in Uberschuft vorhanden sind und nicht gebundene Immunstoffe nicht mehr vorhanden sind. Wenn der untersuchte Stoff das Antigen w~re, so kSnnte die l~eaktion die Geschwulst nur im Anfangsstadium nachweisen, da ja spKter infolge der Proliferation in den welt 1/~nger dauernden sp/~teren Phasen der Erkrankung die Immunstoffe das ~bergewicht bekommen. Von den klinischen Beweisen mSchten wir auch den negativen Verlauf der Reaktion nach RSntgenbestrahlung erw~hnen. Wahrscheinlich wird das negative Ergebnis der Reaktion dadurch verursacht, daft plStzlich eine grofte 1Vfenge des Antigens erscheint, wodurch alle vorhandenen Immunstoffe gebunden werden. Auch die Tatsaehe, daf~ noch viele Jahre nach erfolgreichen chirurgischen Eingriffen die l~eaktion positiv verl/~u~t, sl3richt ffir den Immuncharakter der Reaktion.
Itemmungd~r
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E i n neues Verfahren zur Krebsdiagnose
c Abb. 9. a Begin~
der Priicipitation. Kleine Pr~icipitate. b ~'Iittelgrol~e Pr~icipitalGe. c Grof~e Pr~tcipitate. ]~[ikrophoto. Vei'gr. 200real
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G. C s ~
and I. TSR6: Ein neues Verfahren zur Krebsdiagnose
AbschlieBend m 6 e h t e n wit b e m e r k e n , d a b die A g a r - B i n d u n g s r e a k t i o n - - abgesehen v o n ihrer V e r w e n d b a r k e i t i n der diagnostischen Praxis - - die A u f m e r k s a m k e i t auf die besondere B e d e u t u n g der ~ u e o polysaecharide lenkt, woraus sich neue G e s i c h t s p u n k t e sowohl fiir die Krebsforschung, als aueh fiir therapeutisehe Mal~nahmen ergeben k6nnten.
ZusammenJassung Die Verfasser geben ein neues Verfahren zur Diagnose maligner T u m o r e n , die A g a r - B i n d u n g s r e a k t i o n b e k a n n t . I m Organismus t r e t e n bei aggressivem W a c h s t u m y o n Gesehwulstzellen infolge A b b a u e s der gegen sie gerichteten H y a l u r o n s / / u r e - I I e p a r i n - S e h r a n k e mucopolysaccharid/~hnliehe Stoffe auf u n d gelangen i n die Zirkulation. Die gegen diese Stoffe gebildeten I m m u n s t o f f e (Antik5rper) k 5 n n e n m i t einem pflanzlichen Mueopolysaccharid, n g m l i e h m i t Agar-Agar nachgewiesen werden. Die R e a k t i o n k a n n Carcinome m i t einer Sieherheit y o n 85,9% nachweisen; w e n n wir y o n der Zahl der falschen n e g a t i v e n F/~lle, die oberil//ehlichen Careinome u n d die l~eaktionen im E n d s t a d i u m der K r a n k h e i t abziehen, betr/~gt der Sicherheitsgrad der R e a k t i o n sogar 95,9%. Die D u r c h f i i h r u n g der t~eaktion ist /~uBerst einfach, so dag sie auch fiir t ~ e i h e n u n t e r s u c h u n g e n geeignet ist.
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