Zeitschrift fiir Zellforschung 69, 344--362 (1966)

Aus dem A~latomischen Institut der Universit~t Freiburg i. Br. und aus den Forschungslaboratorien der F. Hoffmann-La Roche & Co. A. G., Basel ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUM FEINBAU DER RETICULOCYTEN I. M i t t e i l u n g F A R B S T O F F A B H A N G I G E V A R I A T I O N E N IN D E R S T R U K T U R D E R SUBSTANTIA GRANULO-FILAMENTOSA *

J. STAUBESA:ND,D. WITTEKIND und G. REI~TSC]t Mit 16 Textabbildungen

(Eingegangen am 1. Juni 1965) Summary. The fine structure of the substantia granulo-filamentosa of reticulocytes was studied after the use of various dyes. The cytoplasm of unstained reticulocytes contains mitochondria, vacuoles with varying contents, ferritin particles, and numerous polyribosomes. The effects of certain dyes on the nature, distribution, and ultrastrueture of the substantia granulofilamentosa are characteristic, and within limits specific for the compound used. Neutral red, 9-aminoacridine, and toluylen blue cause the coarsest precipitates accompanied by a depletion of polyribosomes. The precipitates following the use of brilliant eresyl blue, acridine orange, toluidine blue, and crystal violet are more delicate. Pseudoisocyanin has only slight effects on cytoplasmic detail. Without doubt the essential elements forming the substantia granulofilamentosa are polyribosomes. The stimuli causing their aggregation are unknown; certain theoretical aspects of the problem are discussed. Zusummen|assung. 1. Die vorliegende Untersuchung ging dem Feinbau der Substantia granulo-filamentosa des Reticulocyten nach. Vor allem wurden die lichtmikroskopisch ermittelten Variationen in der Ausbildung der Substanz nach Anwendung versehiedener Farbstoffe elektronenmikroskopisch nachgepriift. 2. Das Cytoplasma des ungefdirbten Reticulocyten ist durch Mitochondrien, Vakuolen unterschiedlichen Inhaltes, Ferritin-Partikel (tells frei, tells in Vakuolen, tells in der Mitochondrienmatrix) und zahlreiche Polyribosomen gekennzeichnet. Ungef~rbte und mit Farbstoffen behandelte Reticulocyten sind offenbar imstande, Organellen und Organellenreste auszustol~en. 3. Fiir bestimmte Farbstoffe sind Ausbildung, Verteilung und Ultrastruktur der Substantia granulo-filamentosa - - innerhalb gewisser Grenzen - - auch im elektronenmikroskopischen Bild spezifisch. 4. Die gr6bsten Pr/s finden sich nach Anwendung von 9-Aminoacridiu, Neutralrot und Toluylenblau. Die genannten Farbstoffe ffihren unter gleichzeitiger Verarmung der Zellen an einzeln liegenden Polyribosomen zu Niederschl/igen, die sich durch charakteristische Eigentfimlichkeiten auszeichnen und meist so kennzeichnend sind, dab sich der jeweils benutzte Farbstoff aus den Merkmalen seines Reaktionsproduktes, dessen Gesamtheit die lichtmikro. skopische Substantia granulo-filamentosa bildet, diagnostizieren 1/il~t. 5. Zarte, z. T. ebenfalls fiir den jeweiligen Farbstoff typische Niederschl~ge treten nach Behandlung der Zellen mit Brilliantkresylblau, Acridinorange, Toluidinblau und Kristallviolett

auf. 6. Nach Pseudolsocyanin werden in dem bislang ausgewerteten Material die relativ geringfiigigsten Veriinderungen, verglichen mit ungef~rbten Reticulocyten, festgestellt. * Herrn Professor Dr. W. BAROMA~ in aufrichtiger Verbundenheit zum 60. Geburtstag gewidmet.

Substanti~ granulo-filamentosa der Reticulocyten

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7. Das e]ektronenmikroskopische Bild l~l}t keine Zweifel daran, daI] die entscheidenden Bausteine der Substantia gr~nulo-filamentosa in der elektronenmikroskopischen GrSl]enordnung die Polyribosomen sin& Welche Kr~ifte sie zur Zusammenballung bringen, ist bislang unklar, ein Transportmechanismus ist jedenfalls hierffir eine unerl~liche Voraussetzung. Mitochondrien und Vakuolen k6nnten im lichtmikroskopischen Pr~p~rat als Anteile der Substantia granulo-filamentosa in Erscheinung treten, im elektronenmikroskopisehen Bild lassen sie sieh jedoch eindeutig von den Pri~cipitationen der eigentlichen Substanz abgrenzen. 8. Die theoretischen Voraussetzungen ffir die Reaktion Farbstoff/Polyribosomen zur Substantia granulo-filamentosa werden einschlieBlich der m6glichen Griinde ihrer farbstoffspezifisehen Verteilungs- und Strukturbesonderheiten diskutiert.

I. Fragestellung Die ersten, mit moderner Methodik erzielten Befunde zur Ultrastruktur der Reticulocyten wurden an haemolysierten (BErnHARD, BRAUNSTEINERet al. 1949; BESSlS 1950 ; BRAUNSTEINERund BERNHARD 1950 ; HVG et al. 1952 ; PETERS und WIGAN]) 1950; BRUNNER und V~LEJo-FREIRE 1956; JUNG 1956; WOLPERS 1956) oder nicht ]iirberisch vorbehandelten Zellen durchgeffihrt (BERNHARD,BRAU~STEINER et al. 1949; BRAUNSTEINER,FELLI~OE~ et al. 1956; L]~SSLER1964a, b). Sie konnten deshalb keine Aussage erm6glichen fiber den Feinbau der lichtmikroskopiseh oft beschriebenen (E~RLIC~ 1885 ; ISRAEL und PAFe]~NHEIM 1896 ; PAerEN~EIM 1907, 1911; CESAms-DEM~L 1907; KEY 1921; DAW])SON 1930; HEILMEYER 1931; S~Ir 1953; LOWENSTEE~ 1959; WITTE~I~D und RENTSCH 1965; u.a.), unter der Einwirkung basiseher Farbstoffe sichtbar werdenden Substantia granulo-filamenbosa. Der Gedanke lag darum nahe, Reticulocyten elektronenmikroskopisch zu unbersuchen, die zuvor mit verschiedenen basischen Farbstoffen behandelt worden waren. Nach Beginn der eigenen Experimente kamen uns neuere Arbeiten yon BESSIS (1964) sowie BESSlS und BREToN-GoRIUS (1964) zur Kenntnis. Die genannten Autoren konnten erstmals netzf6rmige Strukturen und in Ausreifungsformen der Reticulocyten eine Kontrastabnahme im Bereich der durch Brilliantkresylblau induzierten t~ibosomenansammlungen nachweisen. Liehtmikroskopische Untersuchungen fiber die Beziehungen zwischen Substantia granulo-filamen~osa und Krinom (WITTEKINDund I~E~TSCH 1965) hatten gezeigt, dab die Ausf~llung der Substanz dutch verschiedene Farbstoffe charakteristische Abweiehunffen vom ,,Standardbild" dieser Struktur [nach Anwendung des meist benutzten Brilliantkresylblau (ItEILMEYERund WEST~XUSE~ 1932)] aufweist. Sie liel~en sich zuverl~ssig reproduzieren und werden mit einigen notwendigen Einschr~nkungen als typisch ffir den jeweils verwendeten Farbstoff angesehen. Somit erschien es lohnend, der Frage nachzugehen, ob diese lichtmikroskopischen Strukturuntersehiede auch eine Entsprechung im elektronenmikroskopisehen Bild fanden. II. Material und Methodik Die Untersuchungen wurden an Meerschweinchen-Blut (wei~-scheckige Russen aus geschlossener Zueht, Gewicht etw~ 350 g) durchgeffihrt. Erg~nzend wurden vergleichende Experimente an M~useblut vorgenommen. Zur Erh6hung der Reticulocytenzahl erhielten die Tiere fiir die Dauer yon 7--10 Tagen jeden 2. Tag lnjektionen yon Phenylhydr~zin-HC1 i. p., 30 mg/kg in Mc Ilvaine-Puffer gel6st (pH 7,2). Auf diese Weise konnten Reticulocytenwerte fiber 50% erreicht werden. Jeweils etw~ 3~4 ml Blur wurden nach Injektion yon 1 ml einer 0,1%igen L6sung yon Heparin (1 rag) durch Herzpunktion gewonnen und mit den unten aufgeffihrten Farbstoffl6sungen zu gleichen Teilen (v/v) gemischt. Die Farbstoff-Blutmischungen wurden f fir 20 rain in der feuchten Kammer aufbewahrt und anschliel~end tropfenweise fixier~.

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J. STAUBESAND,D. WITTEKll~Dund G. RENTSCH:

Von jeder gef~rbten Blutprobe wurden parallel mit der Fixation Pr~parate fiir vitalmikroskopische Kontrolluntersuchungen gewonnen. Folgende basische Farbstoffe (gel6st in 0,9%iger NaC1 oder in Hanks-L6sung, beide pI-I 7,2) kamen zur Anwendung: 1. BrilliantkresylblauH~ 1 : 100, 1:200 und 1 : 1000, 2.9-Aminoacridintt' 1 : 100 und 1 : 1000, 3. AcridinorangeG~ 1 : 100 und 1 : 1000, 4. Neutralrot G~ 1 : 100, 5. ToluidinblauH' 1 : 100, 6. Toluylenblau]t~ 1 : 100, 7. KristallviolettItl 1 : 100, 8. PseudoisocyaninH' 1 : 100, Zur Kontrolle diente ungef~rbtes Blut in Hanks-L6sung. Das elektronenmikroskopisch ausgewertete Material wurde fiir 2 h mit OsO, (1%) in Palade-Puffer fixiert und fiber Aceton in Vestopal W eingebettet; Schnitte nfit dem LKBUltrotom (Typ 4801 A) und mit dem Porter-Blum Ultra-Mikrotom (Modell I) ; Aufnahmen mit dem EM-9 (Zeiss) ; Prim~rvergrSBerungen zumeist 7000fach.

III. Befunde

1. Zur Ultrastruktur des unge/drbten Reticulocyten Der ungef/irbte R e t i c u l o c y t enth/ilt Mitochondrien sines unterschiedlichen Erh a l t u n g s g r a d e s , Vakuolen, die tells ,,leer" erscheinen, tells einen h e t e r o m o r p h e n I n h a l t haben, vereinzelt m e m b r a n b e g r e n z t e Schl/iuche (wahrscheinlich l~este des e n d o p l a s m a t i s c h e n l~eticulum bzw. Golgi-Apparates), Ferritin-Partikel sowie zahlreiche Polyribosomen (Abb. 1--3). Manche zeigen Erscheinungen, die wir m i t der Ausschleusung y o n Vakuolen, M i t o c h o n d r i e n r e s t e n u n d a n d e r e n Z e l l b e s t a n d t e i l e n in Z u s a m m e n h a n g bringen (Abb. 4 a). Ausschleusungsvorg/~nge w u r d e n auch an den m i t F a r b s t o f f e n b e h a n d e l t e n R e t i c u l o c y t e n b e o b a c h t e t (Abb. 4 b). I n einigen Zellen l i n d e n sich in den M i t o c h o n d r i e n elektronendichte, k5r~fige Niederschl/~ge (Abb. 1), /ihnlich denen, die v o n BESSIS (1964) in M i t o c h o n d r i e n y o n E r y t h r o b l a s t e n abgeb i l d e t w o r d e n sind. U n t e r den V a k u o l e n sind jene verh/~ltnismi~13ig zahlreich, die vollst/~ndig ,,leer" wirken (entweder well ihr I n h a l t d u t c h die V o r b e h a n d l u n g herausgel6st ist oder eine w~Brige P h a s e darstellt) u n d jene, die ein feink5rniges, e l e k t r o n e n d i c h t e s M a t e r i a l (Ferritin) umschlie6en (Abb. 3). A u c h ,,multivesicular bodies" sind r e l a t i v h~ufig (Abb. 3). Die Z e l l m e m b r a n e n der R e t i c u l o c y t e n u n t e r seheiden sich in u n s e r e m M a t e r i a l nieht von d e n e n der E r y t h r o c y t e n (vgl. dagegen JUNG u n d ASEN, 1944).

2. Brilliantkresylblau (1:100, 1:200, 1:1000) N e b e n Zellen, die in allen Einzelheiten den u n g e f s R e t i c u l o c y t e n entsprechen, e n t h ~ l t die Mehrzahl d e r m i t B r i l l i a n t k r e s y l b l a u gefi~rbten R e t i c u l o c y t e n fleekig-netzig oder k e t t e n - u n d ringf6rmig a n g e o r d n e t e e l e k t r o n e n d i c h t e S t r u k t u r e n (Abb. 5). Je reichlicher sie vorhanden sind, umso geringer ist die Zahl einzeln liegender Polyribosomen. W ~ h r e n d keine deutlichen cytologischen U n t e r s e h i e d e 1 ]tl ~ Handelsware ; m ~ chemisch reine Substanz ; O~ ~ chromatographisch nach einem in Anlehnung an ZANKER(1952) modifizierten Verfahren (RENTSCg) gereinigter Farbstoff. Die Herstellung der FarbstofflSsungen ist an anderer Stelle (WITTEKINDund RENTSCH 1965) ausfiihrlich beschrieben.

Substantia granulo-filamentosa der l~eticulocyten

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Abb, 1. Ungefgrbter Reticulocyt (Meerschweinchen). Beachte die u n r e g e l m ~ i g e Kontur der Zelle (PseudopodienD und die feink5rnigen, elektronendichten Niederschl~,ge innerhalb der Mitochondrienmatrix (rechts im Bild). I m Cytoplasma gleichm~0ig verteilte Polyribosomen ( = dunkle KSrner, die oft zu Dreier-, Vierer- oder Fiinfergruppen zusammengelagert sind). Gesamtvergr. 32 000fach

zwischen den Farbstoffkonzentrationen 1:100 und 1:200 bestehen, ist die Substantia granulo-filamentosa in den der Brilliantkresylblau-Verdfinnung 1:1000 ausgesetzten Zellen meist zarter und spi~rlicher ausgebildet.

3. 9-Aminoacridin (1:100, 1:1000) Das 9-Aminoacridin bildet in den beiden angewandten Konzentrationen so iiberaus typische Pr~cipitationen, dab die elektronenmikroskopische Diagnose des Farbstoffes und seiner Verdi~nnung auch im ,,Blindversuch" ohne Schwierigkeiten gelang. In der h6heren Konzentration zeigen die meisten l~eticulocyten Merkmale schwerer Sch/idigungen. I h r Cytoplasms ist oft nur noch unter der Zellmembran und in der Umgebung yon Organellen, Vakuolen und der hier grob strangf6rmigen

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D. WITTEKINDund G. RENTSCH: oder klumpig-netzigen Substantia granulo-filamentosa erhalten (Abb. 6). St~rkere Vergr6Berungen zeigen, da6 die Substanz aus dichtesten, meist recht scharf gegen die Umgebung begrenzten Pr~eipitaten besteht (Abb. 7). Naeh Anwendung der Konzentration l:1000 sind die Zellen dagegen in der Regel gut erhalten. Die Substanz tritt in Form deutlich markierter, dichter Strange mit zahlreiehen punktuellen Aufhellungen in Erseheinung (Abb. 8). In Zellen, in denen sie weniger stark entwickelt ist oder fehlt, sind zartere, ziemlich gleichmi~6ig fiber das Cytoplasma verteilte, kommafSrmige Strukturen vorhanden (Abb. 9). Wit haben den Eindruck, dab bei den Zellen dieser Versuchsreihe Ausschleusungsvorg~nge von Mitochondrienresten, ,,multivesicular bodies" u. dgl. etwas hi~ufiger vorkommen als bei den fibrigen Versuehsgruppen (Abb. 4b). Aueh membranbegrenzte wurm- bis knollenfSrmige i~ul~erst elektronendiehte Einschlfisse, d i e - selt e n e r - aueh naeh Anwendung anderer Farbstoffe, vereinzelt sogar in unge/drbten Reticulocyten auftreten kSnnen, bilden sehr auffs Formationen (Abb. 10), die sieh v o n d e r Substantia granulo-filamentosa schon durch ihren MembranabsehluB eindeutig unterscheiden lassen.

4. Acridinorange (1:100, 1:1000) Struktur und Verteilung der Substantia granulo-filamentosa erinnern an die Befunde, die nach Anwendung von Brilliantkresylblau erhoben werden konnten (vgl. Abb. 5). Die quantitativen Unterschiede in der Ausbildung der Substanz spiegeln die untersehiedlichen Konzentrationen des angebotenen Farbstoffes meist deutlich wider (Abb. 11, 12). Abb. 2. Ungefdrbter Rcticulocyt (Mcerschweinchen). In dcr unteren Bildhalfte, rechts neben den Mitochondrien eine Ferritinvakuole. ~bcr die ganze Zclle Yerteilt zahlreiche Polyribosomen. Gesamtvergr. 32 000fach

Substantia granulo-filamentos~ der Reticulocyten

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Abb. 3. Ungefdirbter tteticulocyt (Meerschweinchen). Rechts oben eine Ferritin enthaltende Vakuole, links unten ein ,,muaivesicular body", an dessert Innenbl~schen ebenfalls Ferritin-Teilchen angelager~ sind. Gesamtvergr. 44 000fach

5. Neutralrot (1:100) Neben dem 9-Aminoacridin bildet das Neutralrot die dichtesten Niederschl~ige in den Reticulocyten. Von ersterem - - in der Konzentration 1:1000 - - unterscheidet es sich durch die 1/ingeren und klumpigeren Str/~nge, vom 9-Aminoacridin l:100 durch die gute Erhaltung der Zellen (Abb. 13). Das Material der Substantia granulo-filamentosa ist nach Neutralrot-Einwirkung auffallend seharf begrenzt und wirkt wie z/~h und hochviskSs (soweit sich derartige Eigenschaften aus Bildern sehlieBen lassen!). 6. Toluidinblau (1:100) Struktur, Anordnung und Menge der Substantia granulo-filamentosa haben so gro$e ~hnlichkeit mit den Befunden naeh F/irbung der Reticulocyten mit Brilliantkresylblau und Acridinorange, dab auf die diesbezfigliehen Beschreibungen und Abbildungen (Abb. 5, 11, 12) verwiesen werden kann. 7. Toluylenblau (1:100) Die Niederschl/~ge der Substantia granulo-filamentosa /~hneln den naeh 9Aminoacridin in der Verdtinnung 1:1000 (vgl. Abb. 8) auftretenden Pr/~cipitationen. Sie unterseheiden sich von letzteren durch folgende Merkmale: sie sind etwas sp/irlicher vorhanden, bilden plumpere Strtinge und Netze und sind nicht so seharf vom Grundeytoplasma abgesetzt, wodurch sie verwasehener aussehen (Abb. 14). 8. Kristallviolett (1:100) Das bisher elektronenmikroskopisch ausgewertete Material zeichnet sich dureh eine auffallende Unterschiedlichkeit der Strukturen aus, deren Gesamtheit die

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Abb. 4a. Ungefiirbter l~cticulocyt (Meerschweincheu). Eine elcktronenmikroskopisch ,,leere" Vakuole w61bt die Zelhuembran blasenf6rmig vor, Links unten imben Mitochondrienrcsten eine ,,FerritinVakuole". Gesamtvergr. 145 000fach

lichtmikroskopische Substantia granulo-filamentosa bildet. Neben Reticulocyten, in denen Polyribosomen zu diffusen Flecken zusammengerfickt sind, linden sich Zellen, in denen homogenelektronendichte, kurze, keulen- oder bandf6rmige Gebilde fiber die ganze Zelle verstreut sind. Sie gleichen den kommaf6rmigen Strukturen, wie sie auch nach F~rbung mit 9-Aminoacridin (1:1000) beobachtet werden konnten (vgl. Abb. 9). Andererseits linden sich auch Formatiohen, die den t)rgcipitaten gleichen, die nach Behandlung mit Acridinorange (vgl. Abb. 11, 12) und Toluidinblau auftreten. Wir haben den Eindruck, daG in den mit Kristallviolett gefiirbtea Zellen Heinzsche Innenk6rper etwas h~ufiger auftreten, als in den Erythrocyten und Reticulocyten der mit anderen Farbstoffen behandelten Blutproben.

9. Pseudoisocyanin (1:100) Zur Ausbildung einer charakteristischen Substantia granulo-fflamentosa hat dieser Farbstoff im elektronenmikroskopischen Bfld - - soweir wit das aufgrund der bisher vorliegenden Aufnahmen beurteilen k6nnen - nicht geffihrt. Die meisten Reticulocytcn sind reich an Abb. 4b. Reticulocyt (Meerschweinchen) mit 9-Aminoacridin 1:100 gcfftrbt. Ausscbteusung eines ,,multivesicular body", unter dem ei~ isolierten, von eincm hellen kleiner, clektroncndichter, zur Substantia granulo-filamentosa Hof umgebenen Polyribogeh0render PrKcipitatklumpen liegt. Gesamtvcrgr. 37 000fach somen (Abb. 15). Nur in einigen Zellen ]ie~en sieh verwasehen wirkende Verdichtungen innerhalb des Grundeytoplasmas nachweisen (Abb. 16).

Substantia granu]o-filamentos~ der Reticulocyten

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1u Diskussion Ffir Untersuchungen, die die Beziehungen zwischen kationischen Farbstoffen und anionischen Gruppen von Zellbestandteilen zum Gegenstand haben, sind die l~eticulocyten zweifellos besonders geeignet. Als l~eaktionspartner fiir basische Farbstoffe kommen in diesen kernfreien Zellen mit lichtmikroskopisch strukturlosem Cytoplasma praktisch nur die submikroskopisch gut abgrenzbaren Ribosomen (HALLINAN, EDEN et al. 1962; MARKS, RIFKIND et al. 1963; WILLIAMSON, MATTHIAS et al. 1963; BESSlS und BREToN-GoRIUS 1964) in Frage. Biochemische

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D. WITTEKINDund G. I~ENTSCH:

Abb. 7. Retictflocyt (Meerschweinchen) mit 9-Aminoacridin 1 : 100 gef~rbt (Detail). Beaehte die dichten, schar[ gegen die Reste des Cytoplasmas abgegrcnzten Pr~cipitat-Netze und -Str~tnge. Gesamtvergr. 44 000fach

Abb. 9. ]~eticulocyt (Meerschweinchen) mit 9 - A m i noacridin 1:1000 geffirbt. Die Zelle enth~lt nut rechts oben ein relativ kleines Prlicipitat. Sie ist fibers~t mit zahlreichen, kommafSrmig kurzen, homogenen Str~ngen eines Materials, das deutlieh elektronendichter als das Grundcytoplasma ist. Gesamtvergr. 19 000fach Abb. 8. Reticulocyten (Meerschweinchen) mit 9-Aminoa~ridin 1:1000 gef~rbt. Innerhalb der diehten Pr~,cipitat-Str~nge und -Netze zahlreiche punktuelle Aufhellungen. Mitochondrien tells gut erhalten, tells mit fragmentierten Cristae. I m Cytoptasma keine Polyribosomen. Gesamtvergr. 19 000fach

Untersuchungen von MunRo und K o R ~ R (1963) bestS~tigcn, dag in Reticuloeyten auger den an Ribosomen gebundenen RNS Nueleins~uren im Cytoplasma kaum naehweisbar sind. Es ist wohl kein Zweifel, dab eben am relativ einfaeh strukturierten Retieuloeyten, in dem die Ribosomen nieht an Membranen gebunden sind (LowE~ST~I~ 1959), die Zusammenfassung dieser aus RNS und Protein

Substantia granulo-filamentos~ der Reticulocyten

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bestehenden Teflchen zur h6heren Einheit der Polyribosomen en$deckt wurde (WARNER, I~ICK et al. 1962 ; SLAYTER, WARNER et al. 1963). Die Polyribosomen dfirfen als die morphologisehen Bausteine submikroskopischer Dimension der unter Farbstoff-Einwirkung entstehenden Subs~antia granulo-filamentosa angesehen werden. An den hier vorgelegten eleIctronenmilcroslcopischen Untersuchungen ist vor allem bemerkenswert, dab sie jene eingangs erw/~hnten lichtmilcroskopischen Beo b a c h t u n g e n ( W I T T E K I N D und I%ENrSCH 1965) fiber farbstoffabh~ngige Struktureigenheiten der Substantia granulo-filamentosa bestiitigen und in ebfigen wesentlichen Punkten erganzen. Das elektronenmikroskopische Bild bietet zwar in der l~egel ein Mehr an Strukturen - - verglichen mit dem lichtmikroskopischen Pr/~parat - - kann jedoch auch Formationen, die sich lichtmikroskopisch feststellen lassen, u.U. fiberhaupt nicht zur Darstellung bringen. Neben den farbstoffabh~ngigen Besonderheiten in der Ausbildung, Verteilung und Struktur der Substantia granulo-filamentosa (vgl. hierzu vor allem die Abb. 7, 8, 11, 13, 14) beweist das elektronenmikroskopische Bild im Gegensatz zu der yon BRAUNSTEINER, F E L L I N OER et al. (1956) vertretenen Auffassung, dab die Mitochondrien der eigentlichen Substanz nicht zugehS- Abb. 10. Reticulocyt (Meerschweinchen) mit 9-Aminoacrir e n (wenn aueh ihre mittelbare Bedin 1:1000 gef~rbt. Eine kleine, unregelm~13ig begrenzte Vakuole, die ein Konvolut ~uSerst dichter, klumpig-wurmteiligung an ihrer Entstehung nicht f6rmiger Strange enthalt. Gesamtvergr. 75 000[ach ausgeschlossen werden kann). Naeh elektronenmikroskopisehen Untersuchungen yon BERNHARD, BRAUNSTEINERet al. (1949), BRAUNSTEINER und BERNHARD (1950) sowie WOLPERS (1956) bildet die Substantia granulo-filamentosa nicht Filamente sondern Granula, die sieh aufreihen kSnnen und dadurch w~hrend der F/~rbung ein Netz bilden. Sehon PETERS und WIGAND (1950) haben hervorgehoben, dab es ,,nicht eine typisehe Darstellungsform" der geticulocyten im Elektronenmikroskop gibt, sondern dab die Substantia granulo-filamentosa ,,sich je nach den Bedingungen des Blutes sowie der Pr/iparation elektronenmikroskopisch versehieden darstellen kann". Diese Aussage griindet sich allerdings nicht - - wie in unseren Versuchen - - auf die Auswertung verschieden ge/dirbter Reticuloeyten. Wir sind mit BEssls und BRETONGORIUS (1964) der Auffassung, dab nur die elektronenmikroskopische SchnittUntersuchung ge/~irbter Reticulocyten zur KenntIfis der Substantia granulo-filamentosa beitragen kann. Interessanterweise heben PETERS und WIGANI) (1950) ansdriicklich hervor, dab differente Fixierungsmittel (Formaldehyd, 0sO 4, Methanol) keinen EinfluB auf das elektronenmikroskopische Bild des Reticulocyten hatten. Die in unseren Bildern vielfach so deutlich erkennbaren Polyribosomen (Abb. 1--3, 9, 15) entsprechen v611ig den y o n SLAYTER, WARNER et al. (1963) abgebildeten und Z. Zellforsch., Bd. 69 23

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J . STAUBESAND,

D. WITTEKIIgD und G. R~TSCH:

Abb. 11. ~eticulocyten (Meerschweinehen) mit A c r i d i n o r a n g e 1 : 100 gef~,rbt. Ahnliehe Pr/~ciI)itate wie nach Anwendung yon Brilliantkresylblau (vgl, Abb. 5). Die uaten ira Bild angeschnittene Zelle enthalt eine ,,FerritinVakuole". Polyribosomen sind n i c h t vorhanden. Gesamtvergr. 33 000fach

e n t s p r e c h e n d g e d e u t e t e n S t r u k t u r e n , w~hrend BEssIs (1964) diese F o r m a t i o n e n (vgl. seine Fig. 3 !) als ,,ferritin molecules" deutet. Fiir unsere Befunde ist vor allem die Art der Beziehungen zu beriicksichtigen, die die Farbkationen yon z. T. sehr verschiedener chemischer Struktur mit den anionischen Gruppen der

Substantia granulo-filamentosa der Reticulocyten

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Abb. 12. t~eticulocy~(~eerschweinchen) mit Acridinorange 1:1000 gefarb~. Polyribosomen noch isoliert zu zarten netzigen Formationen zusammengelagert. GesamSvergr. 41000fach Polyribosomen eingehen. Die Vorg/~nge, die der Farbstoffbindung a n Zell- oder/und Gewebsbestandteilen zugrunde liegen, sind auf dem Boden physikalisch-chemischer u n d chemischer Theorien in der L i t e r a t u r vielfach gedeutet worden (Z~Io~R 1938; SI~r 1952; t t ~ n ~ S 1959; CO~N 1961 ; u. a.). Auf Einzelheiten der heute einander stark angen/~herten Auffassungen soll hier nicht eingegangen werden. 23*

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J. STAUBESA~D,D. WITTEKINDund G. I~ENTSCtt:

Abb. 13. Iteticulocyten (Meerschweinchen), mit Neutralrot 1:100 gef~rbt. Dichte, klobige Pr~cipitat-Strhnge und -Ballen. Zahlreiche ,,leere" Vakuolen, in der rechts gelegenen Zelle ein ,,multivesicular body". Gcsamtvergr. 20 000fach

Abb. 14. Reticulocyt (~feerschweinchen) mit Toluylenblau 1:100 gef~rbt. Plumpe, etwas verwaschen wirkeude Pr~cipitat-Str~ngc (vgl. mit Abb. 8). Gesamtvergr. 40 000fach

Versuche zur Interpretation unserer Befunde mfissen v o n d e r Besonderheit der erzielten I~esultate ausgehen: Zwar gilt ffir alle histologischen FKrbungen, ,,da$ sich der genaue Mechanismus einer Fiirbung mit dem Farbstoff, den Fasern (bzw. den Zellstrukturen, die Reff.) und reaktionsf~higen Gruppen ~ndert" ( V I C K E R S T A t ~ F 1950). I m iibrigen iibt aber doch die Fixation insofern einen nivellierenden EinfluB aus, als sie das Substrat in eine stabile, fiir jede Fi~rbung gleiche Ausgangslage bringt. I n Abh~ngigkeit von ihrer elektrischen Ladung und ihrem chemischen Bau

Substantia granulo-filamentosa der Reticulocyten

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Abb. 15. Anschnitte yon zwei Reticulocyten (Meerschweinchen) mit Pseudolsocyanin 1:100 gef~rbt. Zahlreiche Polyribosomen, Mitochondrien, kleinere und gr50ere Vakuolen, unten im Bild eine sehr dicht mit Ferritin-Partikeln gefiillte Vakuole, darfiber eine Vakuole, die neben Membranringen ebenfalls Ferritin-Partikel enth~lr Gesamtvergr. 30 000fach

heben sodann die Farbstoffe die Strukturen hervor, wirken auf sie aber grunds~tz]ich nicht mehr im Sinne einer Umformung. Sehr verschieden yon diesen, durch Fi~rbung in der Regel dargestellten Strukturen sind nun jene, die in der vorliegenden Arbeit beschrieben werden: Sie entstehen nicht nur unmittelbar erst durch Farbstoffeinwirkung, sondern sie lassen auch ihrer intrazellul~iren Struktur und Anordnung nach noch mehr oder weniger deutliche Beziehungen zum ]eweils verwendeten Farbsto/~ erkennen. Eine evil. nach-

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J. STAUBESAND,D, WITTEKINDund G. I~E~qTSCH:

Abb. 16. Reticulocyt (Meerschweinchen) mit Pseudoisocyanin 1:100 gef~rb~. Feinfleckige, etwas verwaschenc Pracipitate. Rechts neben den beiden oberen Mitochondrien eine Vakuole mit sparlichen Ferritin-Partikeln. Gesamtvergr. 36 000fach

folgende Fixation stabflisiert diese ausgefi~llten Gebflde ohne deutlich nachweisbaren Substanzverlust. Vergleichbare Effahrungen aus dem Gebiet der biologischen F~rbungen lassen sich k a u m heranziehen. Wohl vermochte LIsoN (1935) aus einer grol~en Zahl bekannter Vitalfarbstoffe eine Gruppe auszusondern, deren gemeinsames Merkmal die Fs zur granul~ren Farbstoff-Speicherung ist, er land aber nur ,,geringe individuelle Unterschiede" innerhalb dieser Gruppe, auch hatte die Fixation auf die sehr heterogenen Granula noch erheblichen, ebenfalls nivellierenden EinfluB. - Auf farbstoffabh~ngige Eigenheiten (Vergleich yon Brilliantkresylblau, Methylenblau und Neutralrot) der Reticulocyten-Innenstruktur lichtmikroskopischer Gr6[3enordnung hatte bereits N~TTIS (1938) hingewiesen. SE~O (1957) erwiihnt in seiner l~bersicht eine nicht im einzelnen qualifizierte besondere Affinit~t von Oxacinfarbstoffen zur Substantia granulo-filamentosa, wi~hrend reine RNS in vitro die sti~rkste Reaktion mit Triphenylmethanderivaten ergeben babe.

Substantia granulo-filamentosa der Reticulocyten

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Uber die Art, wie die basischen Farbstoffe in der Umformung der Polyribosomen zur Substantia granulo-filamentosa ihren ,,prAgenden" Einflu$ ausfiben, lassen sieh vorl/iufig nur Vermutungen anstellen. Wir k5nnen uns daher kurzfassen. Zun/~chst m/issen die in die Retieulocyten eingedrungenen Farbstoff-Kationen die basischen Proteine und aueh die in Ribosomen reiehlieh vorhandenen Diamine (ZILLm, KRONE et al. 1959; HA~BERS 1964) yon den Phosphatgruppen der RNS, wenigstens zum Tell, verdr/ingen. Die positive Ladung ist das gemeinsame ,,unspezifische" Merkmal der wirkliehen Farbstoffe. Ein ,,pr/~gender" Effekt mutt yon Eigenarten der Molekfilstruktur ausgehen. Die Mehrzahl neuerer Studien fiber physikalisch-ehemische und stereoehemische Beziehungen zwischen Farbstoffen und Nukleins~iuren sind vorwiegend an DNS durehgeffihrg worden (MlCl~AELIS1947; ~ORTHLAlqD,DE BRUYN et al. 1954; BEERS, HENDLEYet al. 1958; u. m). In einer Analyse der Beziehungen einiger basiseher Farbstoffe (u. a. Acridinorange, Toluidinblau und Kristallviolett) zu versehiedenen RNS-Frak$ionen fanden SE~MEL und H~PEaT (1964) die Reaktionen yon DNS und RNS vergleichbar, wenigstens, was das Zustandekommen positiver und negativer Metachromasie betrifft. Erstere ist yon der Liinge der polymeren Ketten der RNS abhiingig. Die Absorptionskurven yon Acridinorgane und Toluidinblau wurden (lurch I~NS in ~hnlieher Weise beeinfluflt, jedoch waren die quantitativen Verh/~ltnisse (tool Farbstoff/mol RNS) verschieden. WomSglich yon besonderem Interesse fiir die hier vorgelegten elektronenmikroskopischen Befunde sind die physikalisch-chemischen Untersuchungen yon LERMAN (1961). Sie best~tigen die spektrophotometrisch bereits yon MORTHL2~ND, D~ BRUYN et al. (1954) ermittelte Sonderstellung der Acridinderivate mit dem Naehweis, dal3 Proflavin und Acridinorange die ViskositKt des DNS-Molekfils steigern, die Sedimentationskonstante senken - - Pinocyanol dagegen, eine dem Pseudoisocyanin ehemiseh nahe verwandte Verbindung, den umgekehrten Effekt auf beide Parameter ausfibt. Die den Acridinderivaten eigentfimlichen Umwandlungen des DNA-Molekfils shad naeh LE~MANS Auffassung (1961) mit Wahrscheinliehkeit auf die Einfiigung des passend konfigurierten Acridinmolekiils zwisehen je zwei Basenpaare der D~'S-Helix mit konsekutiver ,,VerlKngerung ihres Riickgrats" zuriickzufiihren. Die Experimente von BEERS, HENDLEu et al. (1958) haben ebenfalls erkennen lassen, datt Acridinorange nieht nur zu den Phosphatgruppen, sondern auch zu den Basen der Nucleins~uren eine, wenn auch deutlich schw~ehere Affinit~t besitzt. Diese in vitro Untersuehungen an synthetischen Polymeren und enteiweittter RNS aus E m b r y o n a l e x t r a k t (SEMMEL und HUPPERT 1964) bzw. an Thymus-DNS (LE~MAN 1961) ausgefiihrt, sind ffir die Kenntnis der physikalisch-chemischen und sterischen Beziehungen zwischen Farbstoffen und Nukleins~uren gewitt yon grol]er Bedeutung, reichen aber zur Erkl~rung jener Individualit~t der Farbstoff-Ribonukleoproteidreaktionen, deren Endstadien-/~quivalente das elektronenmikroskopische Bild darstellt, noch nicht aus. Ffir die Deutung der intrazellul~ren Strukturbildung unter dem Einflutt basiseher Farbstoffe ist eben noeh zu beriicksichtigen, dab diese mit Ribonucleoproteinen reagieren. Vom Acridinorange ist im fibrigen bekannt, datt es bei entsprechender Einstellung des pH-Wertes des Mediums nur im Bereich der RNS, nicht der DNS, bis zum Auftreten der Rotfluoreszenz konzentriert werden kann (GSssNER 1949; SCH0~MELFEDER, EBSCHNER et al. 1957 ; WEISSMAN und GILGEN 1956 ; ZEIGER, HARDERS et al. 1951; STOCIKINGE~ 1958, 1964; WITTE]~INI) 1958; u.a.), datt also nur an

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weniger h o c h p o l y m e r e n RNS-Molekfilen eine Assoziation dieser F a r b s t o f f k a t i o n e n m5glich ist. A u c h im Bereich der S u b s t a n t i a g r a n u l o - f i l a m e n t o s a k o m m t es u n t e r A c r i d i n o r a n g e bei a u s r e i c h e n d e m F a r b s t o f f a n g e b o t aussehlieBlieh zur Rotfluoreszenz (Kosnl~OW 1952 ; VA~NDEI{,ELLIS et al. 1963), die fast ebenso m i t d e m chemiseh n a h e v e r w a n d t e n P r o f l a v i n zu erreichen ist (WITTEKIND u n d RENTSCH 1965). F e r n e r ist zu berficksiehtigen, d a b nicht nur die R N S der iZibosomen, s o n d e r n auch d e r e n Proteine, oder z u m i n d e s t Anteile y o n ihnen d u r c h die F a r b s t o f f e i n w i r k u n g pr/~cipitiert werden. I m Gegensatz zur V i r u s - R N S , die d u r c h P r o t e i n abg e s c h i r m t wird, umhfillt eine R N S - S c h i c h t den EiweiBkern der R i b o s o m e n (SAuTER 1963). E s ist noch ungekliirt, auf welche A r t zur K o n g l o m e r a t i o n der P o l y s o m e n bei d e r B i l d u n g d e r S u b s t a n t i a granulo-fflamentosa n i c h t n u r ihr R N S - , sondern auch ihr P r o t e i n a n t e i l beitragen. Die besonders nach 9 - A m i n o a c r i d i n so auffallend d i c h t e Z u s a m m e n b a l l u n g d e r Substanz, die ihren, d u r c h B r i l l i a n t k r e s y l b l a u - E i n w i r k u n g beeinfluBten reticulofilament6sen A s p e k t (HEILMEYER 1931) lichtmikroskopisch w e i t g e h e n d vermissen 1/~Bt, setzt ]a einen Transport zuvor gleichmi~Big fiber die Zelle v e r t e i l t e r S u b s t a n z e n voraus. W e l c h e Leistungen das C y t o p l a s m a des l e b e n d e n bzw. u n t e r E i n w i r k u n g der k o n z e n t r i e r t e n F a r b s t o f f e a b s t e r b e n d e n R e t i c u l o e y t e n zu diesem S t o f f t r a n s p o r t beitrs ist nicht b e k a n n t . A u c h fiber eventuelle W i r k u n g e n d e r F a r b s t o f f e auf die wahrseheinlieh noeh v o r h a n d e n e n B i n d u n g e n der P o l y r i b o s o m e n an das R e t i c u l o c y t e n s t r o m a ist z.Z. keine Aussage mSglich. Als N e b e n b e f u n d h a b e n unsere U n t e r s u e h u n g e n Hinweise d a r a u f geliefert, d a b d e r R e t i c u l o c y t i m s t a n d e ist, b e s t i m m t e Organellen oder z u m i n d e s t R e s t e von ihnen ,,in t o t o " auszustoBen (Abb. 4a, b). W e i t e r e elektronenmikroskopische, histochemisehe sowie biochemische U n t e r s u c h u n g e n sind zu einer g e n a u e r e n I n t e r p r e t a t i o n der hier vorgelegten Befunde notwendig, die uns sehon deshalb bereits j e t z t m i t t e i l e n s w e r t erseheinen, weft sic zeigen, da[~ in b e s t i m m t e n F~llen die Zelle auf die A k t i o n ausgew~hlter ehemischer S u b s t a n z e n m i t iiberaus spezifischen lZeaktionen zu a n t w o r t e n v e r m a g . Literatur

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