ETUDE
AU MICROSCOPE
MELANOMES
ELECTRONIQUE
DES
M A L I N S D E LA C H O R O I D E par
J. FRANCOIS, M. RABAEY & A. LAGASSE Gand
Ces derniers temps l'examen au microscope 61ectronique s'est ajout6 aux methodes classiques d'examen des m61anomes malins de l'uv6e. La premiere de ces 6tudes a 6t6 publi6e par FRANqOIS, RABAEY & LAGASSE(1958, 1959), ainsi que par RABAEY& LAGASSE(1959). I1 s'agissait d'un ,,leucosarcome" non pigment& Par la suite, FRANqOIS, RABAEY & LAOASSE (1960) ont 6galement d6crit une tumeur pigmente& Les deux cas appartenaient au type fusiforme B. Darts un travail d'ensemble HOGAN & FEENEY(1962) ont ~tudi6 onze m61anomes malins de l'uv6e. Trois ~taient du type fusiforme B, sept du type mixte et un type @ith6loide. En 1963, BIERRING,EGEBERG& JI~NSENont 6galement donn6 une description d6taill6e d'un m61anome du type fusiforme B. Depuis 1958, nous avons pu examiner une vingtaine de cas de m61anomes malins de l'uv6e au microscope 61ectronique (FRANqOIS, RABAEY & LAGASSE, 1964). Malheureusement il n'y avait parmi eux aucun cas du type 6pith61oide pur. Si nous tenons compte de tous les cas, qui ont 6t6 ddcrits jusqu'~t pr6sent, il nous parait 6vident que la classification proposde par CALLENDER(1931), ainsi que par CALLENDZR,WINDER& ASH (1942), ne se retrouve pas dans l'ultrastructure des mdlanomes malins de l'uvde. Nous sommes les premiers/t reconnaltre qu'il y a de grandes variations dans l'aspect ultramicroscopique de ces tumeurs, mais nous avons aussi nettement l'impression qu'il ne s'agit pas de diff&ences fondamentales. Ce sont avant tout des diff6rences de degr6, comme la pr6sence plus ou moins abondante de l'une ou l'autre composante cellulaire, l'importance plus ou moins 6vidente de la d6g6n6rescence et de la n6crose cellulaire ou la formation plus ou moins atypique de la m61anine dans les cellules tumorales. Quelles sont les caract6ristiques les plus importantes de l'ultrastructure des m61anomes malins de l'uv~e? Comme l'examen histologique nous l'avait d~j/t appris, la forme et la dimen-
LES MELANOMES MALINS DE LA CHOROIDE
453
Fig. 1 Aspect g6n~ral au microscope 61ectronique d'un m61anome malin non pigment~ de la choroide. A noter surtout l'aspect r6ticulaire du nucl6ole et les formations concentriques de l'ergastoplasme. Darts le cytoplasme il y a de nombreuses mitochondries parfois tr6s allong6es et des masses osmiophiles irr6guli6res. Fixation 5. l'acide osmique. Agr. or. 20.000 x.
454
J. FRANCOIS, M. RABAEY & A. LAGASSE
Fig. 2 Aspect gdn6ral au microscope 61ectronique d'un mdlanome malin pigment6 de la choroide. L'appareil de Golgi est bien d6velopp6. Les grains pigmentaires contiennent des fines particules de m61anine. On voit aussi des espaces plus importants, ofJ des particules m61aniques sont dissdmin6es dans un mat6riel moins opaque. Fixation ~t l'acide osmique. Agr. or. 20.000 x.
LES MELANOMES MALINS DE LA CHOROIDE
455
sion des cellules tumorales sont trbs variables. Ces 61~ments, ainsi que le rapport entre le noyau et le cytoplasme, sont cependant plus difficiles ~t d6terminer sur des photos ultramieroscopiques. Le cytoplasme est g6n6ralement d61imit6 par une paroi cellulaire, qui pr~sente une 6paisseur de 80 ~t 109 A apr6s fixation ~t l'acide osmique (fig. 1). Aux endroits, o/1 les cellules sont juxtapos6es, la paroi cellulaire est habituellement bien visible et rectiligne. Particuli6rement dans le type fusiforme les cytoplasmes des diff6rentes cellules peuvent &re entrem~16s d'une fagon tr6s complexe (fig. 2). Quand les cellules sont isoldes, elles sont plut6t sphdriques et pr6sentent des prolongements plus ou moins nombreux. La longueur et l'6paisseur de ces ramifications (microvilli) sont tr6s variables. De ci de 1~ on observe ~galement des v6sicules pinocytotiques. Les noyaux sont g6n6ralement ronds ou ovales et relativement grands, par rapport/t la quantit6 de cytoplasme. Ils sont entour6s d'une double membrane, tr~s ondul6e, dans laquelle on trouve des pores; ceux-ci sont bien distincts sur plusieurs photos (fig. 3). Dans certaines cellules la paroi nuel6aire prdsente des indentations importantes. Apr6s fixation ~ l'acide osmique, le contenu nucldaire (~t l'exclusion du nucl6ole), poss6de en g6n6ral un aspect tr6s homog6ne. Les granules fonc6s sont rares et on ne voit que par 9i par 1~ un areas de chromatine le long de la paroi nucl6aire interne. Les nucldoles sont g6n6ralement volumineux et irr6guliers; ils pr6sentent une structure r6ticulaire caractdristique (rope like pattern). La largeur des zones sombres du nucldole est variable, de telle sorte que la proportion entre ces zones, contenant du R N A et la substance claire occupant les mailles, varie assez bien d ' u n cas ~t l'autre. Surtout lorsque la n6crose est assez prononc6e la substance nucldolaire peut se transformer en une masse plus homog6ne, qui se trouve alors souvent pr6s ou contre la paroi nucl6aire. Dans un cas, nous avons trouvg de nombreuses particules opaques darts cette substance nucl6olaire. La plus grande variabilit6 existe pour les organelles cytoplasmiques. Dans le cytoplasme des cellules tumorales, on trouve g6n6ralement de nombreuses mitochondries. Celles-ci sont parfois augment6es de volume et irr6guli6rement gonft6es au point que toute structure interne a disparu (fig. 4). Leur nombre et surtout leur longueur varient tr6s fortement (fig. 1). L'appareil de Golgi se reconnait presque partout (fig. 2 et 3). Comme darts beaucoup de tumeurs malignes, il est parfois rudimentaire et compos6 seulement de quelques lamelles et vdsicules. Dans d'autres cas il est, au contraire, hypertrophi6. De temps ~t autre on peut distinguer un centriole.
456
J. FRAN~OIS~ M. RABAEY & A. LAGASSE
Fig. 3 Partie de cellule t u m o r a l e d ' u n m61anome n o n pigment6. La structure du nucl6ole et les pores de la paroi cellulaire sont bien visibles. Le R N A se trouve dans le cytoplasme sous f o r m e de r i b o s o m e s libres qui de ~i de l~t ont tendance h se grouper pr6s de la paroi nucl6aire externe. L'appareil de Golgi est m o i n s bien d6velopp6. Fixation h l'acide osmique. Agr. or. 40.000 x.
LES MELANOMESMALINSDE LA CHOROIDE
457
Les membranes et les v6sicules du reticulum endoplasmique sont trbs d6velopp6es dans le cytoplasme de certaines cellules, qui pr6sente ici un aspect 6videmment plus clair que l~t ofJ il y a une grande quantit6 de ribosomes (grains de Palade). D'une part, les ribosomes sont diss6min6s &travers le cytoplasme ou amass~,s en petits groupes (fig. 3). Ces areas sont parfois plus nombreux au voisinage de la membrane nucl6aire. D'autre part, on trouve les ribosomes dispos6s le long des membranes de l'ergastoplasme, qui forment de 9i de 15. de grandes vacuoles. Dans certaines cellules l'ergastoplasme pr6sente une structure assez curieuse en spirale, dessin6e par des lamelles concentriques. Celles-ci sont form6es par deux membranes, qui portent du c8t6 externe des ribosomes et entre lesquelles on voit une zone claire d'environ 300 A (fig. 1). Au centre de ces formations on voit une masse sombre et granuleuse. Dans d'autres eellules les membranes ergastoplasmiques sont tellement d6velopp6es qu'elles occupent presque tout le cytoplasme (fig. 5). I1 est curieux de constater que ces cellules ne contiennent jamais de granules pigmentaires. Darts un cas de m61anome malin du type 6pith61oide XOCAN & rEE~EY (I962) ont observ6 c6te 5. c6te des cellules sombres avec des ribosomes diss6min6s et des cellules claires sans ribosomes, mais avec des membranes et des v6sicules tr6s d6velopp6s; il n'y avait pas de formes interm6diaires. Nous n'avons jamais retrouv6 la juxtaposition dans la m~me tumeur de cellules aussi compl6tement diff6rentes. Dans un de nos cas cependant (fig. 6) le cytoplasme pr6sentait des zones claires ~tendues, qui sont dues, d'apr~s JEYSEN(1964), 5. la pr6sence dans la cellule de grandes quantit6s de glycogbne. La d~gdn~rescenee cellulaire et la ndcrose sont fr6quentes dans les m61anomes malins de l'uv6e (fig. 4). Elles s'observent d'abord au niveau du cytoplasme, off elles sont aussi les plus prononc6es. Elles se caract6risent avant tout par l'apparition de vacuoles, qui peuvent se multiplier au point que tout le cytoplasme n'est plus constitu6 que de cavit6s plus ou moins volumineuses remplies d'un liquide clair. L'origine de ces vacuoles, qui ne ressemblent pas du tout aux lysosomes, peut ~tre variable. Patrols ce sont des cavit6s irr6guli6res sans membrane limitante. Parfois au contraire, lorsqu'elles se forment aux d6pens des v6sicules et des sacs du r6ticulum endoplasmique, elles sont nettement d61imit6es par une fine membrane. Les vacuoles peuvent contenir un mat6riel opaque osmiophile, dont les contours sont tr6s irr6guliers; il s'agit probablement de lipides. Dans d'autres cas encore la vacuolisation du cytoplasme est due au gonflement 6norme
458
J. FRAN(~OIS, M. RABAEY & A. LAGASSE
Fig. 4 Partie de cellule tumorale. Signes 6vidents de n6crose: vacuoles dans le cytoplasme, gonflement des mitochondries, alt6rations de la structure nucl6olaire. Fixation ~tl'acide osmique. Agr. or. 20.000 x.
des mitochondries, dont les structures internes ont comp16tement disparu. D a n s le noyau les manifestations n6crotiques sont g6n6ralement moins 6videntes, du moins apr6s fixation 5. l'acide osmique. Le nucl6ole a tendance ~t se diriger vers la paroi nucl6aire et sa structure r6ticulaire peut disparaltre compl~tement.
La formation de mdlanine est une caract@istique essentielle des m61anomes malins de l'uv6e. C o m m e ceux-ci se d6veloppent assez vite, on peut observer les granules pigmentaires pendant toute leur formation, ce qui, dans les cellules normales, n'est possible que s'il s'agit de tissus embryonnaires. N o u s ne voulons pas nous 6tendre sur l'origine et le m o d e de production des grains pigmentaires normaux. On trouvera la litt6rature ~t ce sujet dans les travaux de BIERRING, E(3EBERG ,~ JENSEN (1963), ainsi que de FRANCOIS, RABAEY & LA~ASSE (1963). On admet g6n6ralement que les granules pigmentaires se forment ~t partir d ' u n
LES MELANOMES MALINS DE LA CHOROIDE
459
Fig. 5 Partie de cellule tumorale, dont le cytoplasme est en grande partie occup6 par des membranes ergastoplasmiques, le long desquelles sont dispos6s les ribosomes. A noter la structure tr6s dense des mitochondries. Fixation/t l'acide osmique. Agr. or. 40.000 x.
460
J. FRANgOIS, M. RABAEY & A. LAGASSE
Fig. 6 D a n s le cytoplasme on voit des zones claires 6tendues, qui pourraient 6tre constitueds p a r d u glycog6ne. Les grains pigmentaires s o n t souvent atypiques et leur h o m b r e variable. Fixation 5. l'acide osmique. Agr. or. 20.000 x.
LES MELANOMES MALINS DE LA CHOROIDE
461
Fig. 7 Disposition de la mdlanine dans une cellule tumorale, qui est consid4r6e par HOaAN & FEENEY(1962) comme pouvant ~tre un macrophage. Fixation ~t l'acide osmique. Agr. or. 25.000 x.
pr4curseur, notamment 5- partir d'une v4sicule plus ou moins sph6rique, d61imitre par une membrane lisse et contenant une quantit6 variable de substance opaque. Ces organelles sont appel4es des pr4m~lanosomes, qui, d'apr6s diff6rents auteurs, trouvent leur origine dans la zone de Golgi. Dans ces pr6m41anosomes on voit d'abord se former de fins filaments parall~les et ensuite des particules osmiophiles alignds de m41anine. Dans les mdlanomes malins de l'uv4e, la formation des granules pigmentaires est souvent atypique. Ee nombre, la forme et la composition des ~14ments, qui dans les cellules tumorales contiennent de la mdlanine, sont variables. Le grain pigmentaire n'est, d'une fa~on g6n4rale, pas compl~tement rempli de m61anine. Dans la plupart des cas on peut de ~i de 1~,reconnaitre trbs distinctement la disposition lin6aire de la m41anine (fig. 4, 6, 7 et 8). Darts certains cas la formation des grains pigmentaires ne ressemble pas tout 5- fait 5. celle qu'on observe dans
462
J. FRANCOIS, M. RABAEY & A. LAGASSE
Fig. 8 Disposition tr6s atypique de la mdlanine dans des cellules tumorales bien contigues. Fixation ~ l'acide osmique. Agr. or. 35.000 x.
les tissus embryonnaires, comme l'dpithdlium pigmentaire de la rdtine par exemple. C'est ainsi que les prdcipitds mdlaniques ne suivent pas toujours une direction continue unique. Dans quelques tumeurs on trouve des grains pigmentaires non homogbnes de grandeur normale, constituds par des petites particules mdlaniques rondes ou irrdguli6res, dissdmindes ~ travers un matdriel moins dense (fig. 2 et 9). Ces grains pigmentaires sont entourds d'une fine membrane. On peut, en outre, observer des cavitds beaucoup plus grandes, rondes ou ovales, entourdes d'une fine membrane et contenant une quantitd variable de petites masses mdlaniques, dissdmindes 5. travers une substance moins opaque et moins dense. Dans d'autres cas encorel on volt dans le cytoplasme des grandes zones plus ou moins bien ddlimitdes, autour desquelles il existe parfois une fine membrane unie (fig. 7). Dans ces zones on trouve de nombreuses masses mdlaniques, au milieu d'une substance plus ou moins claire, dont la structure diff6re nettement de celle du cytoplasme. Ici aussi, on retrouve l'arrangement lindaire de la mdlanine. Cette disposition s'observe surtout dans les tumeurs ou dans
LES MELANOMES MALINS DE LA CHOROIDE
463
Fig. 9 Grains pigmentaires et mitochondries dans le cytoplasme d'une cellule tumorale. Les grains pigmentaires se caract6risent par une quantit6 variable de particules m61aniques qui se trouvent au milieu d'une substance plus claire. Fixation ~t l'acide osmique. Agr. or. 40.000 x.
les parties de tumeur, qui se composent de cellules plus ou moins isoldes. D a n s le travail de HOGAN & ~EEYEY (1962) on trouve une image analogue. Ces auteurs consid6rent ces cellules c o m m e &ant des macrophages. Ils doivent cependant reconnaitre qu'abstraction faite du pigment, elles sont difficiles ~t distinguer des autres cellules tumorales, de telle sorte qu'il est impossible de savoir s'il s'agit de cellules m61anomateuses ou de cellules r&iculo-endoth61iales. D a n s un de nos cas nous avons observ6, dans un grand h o m b r e de cellules, des formations analogues, mais plus petites, off la m61anine 6tait incluse dans une substance trbs fonc6e (fig, 8). Ces cellules 6talent m61ang6es aux autres cellules tumorales. Des macrophages vrais peuvent sans aucun doute s'observer dans les m61anomes malins. Ils ont 6t6 d6crits en d6tail par BIERRING, EGEBERG • JENSEN (1963). N o u s les avons 6galement rencontr& en petit nombre. Ils contiennent
464
J. FRANOOIS, M. RABAEY & A. LAGASSE
Fig. 10 M61anome malin du type fusiforme B aprbs fixation ~. l'ald6hyde (HOLT & nICKS, 1961) et coloration g. l'ac6tate d'uranyl. L a c h r o m a t i n e se dispose s u r t o u t 5. la p6riph~rie du n o y a u , de sorte que par ~i par l~t des c a n a u x clairs deviennent visibles. I1 y a peu de c h r o m a t i n e dans le nucl6ole. D a n s les mailles du r6seau nucl6olaire il y a u n e substance claire, diff~rente de celle q u ' o n trouve dans d'autres parties du noyau. Agr. or. 20.000 x.
LES MELANOMES MALINSDE LA CHOROIDE
465
des inclusions typiques, des corps pleiomorphes, qui renferment des particules m61aniques, de la my61ine, des cristaux, des vacuoles et d'autres mat6riaux denses. La morphologie de ces cellules est tr~s diff6rente de celle des cellules tumorales, principalement en ce qui concerne la forme et la structure du noyau. Nous avons, dans tous nos cas, recherch6 des particules ressemblant ~t des virus (,,virus-like particles"), mais nous n'en avons pas trouv6, pas plus que hOGAN & FEENEY(1962). Dans un de ses cas JENSEN(1964) a n6anmoins observ6, au niveau des noyaux cellulaires, des formations, qui font penser ~t un virus. Mais m~me s'il en est ainsi, il faut tenir compte de la possibilit6 d'une infection passag6re. Quoiqu'il en soit on peut conclure qu'il n'y a jusqu'h pr6sent aucune indication morphologique suffisante pour admettre la pr6sence d'un virus dans les m61anomes malins de l'uv6e. L'espoir de trouver un parall61isme entre les caract&istiques histologiques et les caract&istiques ultrastructurelles (apr6s fixation ~tl'acide osmique), en ce qui concerne la classification des m61anomes malins, ne s'est pas r6alis6. I1 est vrai que la comparaison de l'ultrastructure des mdlanomes malins aux diff&ents types de CALLENDERn'a pas 6t6 le but unique de nos recherches. C'eut 6t6 pourrant un moyen facile pour rnettre la morphologie cellulaire, observ6e au microscope 61ectronique, en rapport avec le pronostic et l'6volution clinique de la tumeur. Pour pouvoir juger du degr6 de malignit6 d'une tumeur d'apr6s 1'ultrastructure de ses cellules, il faudrait savoir quelle caract6ristique morphologique en est la signature. Les derni6res recherches dans le domaine macromo16culaire sur les fonctions cellulaires ont montr6 le r61e important des nucl6oprot6ines dans la multiplication et la croissance cellulaire, ainsi que darts la synthbse prot6inique. Darts cet ordre d'iddes nous devrions attirer notre attention route particuli~re sur la pr&ence darts le cytoplasme de ribosomes libres ou dispos6s le long des membranes ergastoplasmiques, la distribution de la chromatine dans le noyau et le degr6 d'organisation du nucl6ole. Malheureusement la fixation habituelle par l'acide osmique 61imine une grande partie du D N A nucl6aire, de sorte qu'il ne reste que tr6s peu de chromatine. Certaines fixations h l'ald6hyde, qui ont 6t6 mises au point ces dernibres ann&s (HOLT & HICKS, 1961 ; SABATINI~ BENSCH & BARRNETT,1963) donnent une id6e beaucoup meilleure de la structure nucldaire (fig. 10) et permettent, en outre, une comparaison plus facile avec l'image histologique ordinaire. I1 se pourrait qu'avec cette fixation, la comparaison avec la classification de CALLZNDERsoit 6galement possible. Ces quelques consid6rations montrent que l'examen au microscope 61ectronique des m61anomes malins de l'uv6e doit encore 61ucider de nombreux probl6mes.
466
J. FRANCOIS, M. RABAEY & A. LAGASSE
Rt~SUMI~
Les auteurs ont examin6 une vingtaine de m61anomes malins de la choroide au microscope 61ectronique. L'ultrastructure du noyau, du cytoplasme et de ses organelles est assez uniforme, lorsqu'il n'y a pas de d6g6n6rescence des cellules tumorales. Les diffdrents types, dgcrits histologiquement par CALLENDER, WILDER & ASH, ne se retrouvent pas au microscope 61ectronique. Les auteurs ont particulibrement 6tudi6 la formation des granules pigmentaires, dont la disposition est souvent atypique. Dans aucun cas ils n'ont trouv6 des ,,virus-like particles". SUMMARY
The authors have examined about twenty malignant melanomas of the choroid with the electron microscope. The ultrastructure of the nucleus, the cytoplasm and its components is fairly uniforme, when there is no degeneration of the tumor cells. The different types, described histologically by CALLENDER,WILDER & ASH, are not found at the electron microscope. The authors have especially studied the formation of the pigment granules, the disposition of which is often atypical. In no case they have found virus-like particles. ZUSAMMENFASSUNG
Die Verfasser untersuchten im Elektronenmikroskop ungef~ihr zwanzig b6sartige Melanome der Gef~13haut. Die Ultrastruktur des Kerns, des Zytoplasmas und ihrer Komponenten ist in den meisten Ffillen ziemlich einheitlich, wenn keine Entartung der Tumorzellen eingetreten ist. Eine Einteilung in verschiedene Typen, wie sie histologisch von CALLENDER,WILDER • ASHvorgeschlagen wurde, ist im Elektronenmikroskop nicht gerechtfertigt. Die Verfasser untersuchten insbesondere die Bildung der Pigmentk6rnchen, deren Lage 6fters atypisch ist. In keinem Fall fanden sie Virus4ihnliche Partikel.
BIBLIOGRAPHIE BIERRING, F., J. EGEBERG & O. A. JENSEN. E l e c t r o n M i c r o s c o p y o f a M a l i g n a n t M e l a n o m a
of the Choroid. Acta ophthal. (Kbh.) 41,224-235 (1963). CALLENDER, G. R. Malignant Melanotic Tumors of the Eye: A Study of Histologic Types in 111 Cases. Trans. Amer. Acad. Ophthal. 36, 131-142 (1931). - H. C. WILDER & J. E. ASH. Five Hundred Melanomas of the Choroid and Ciliary Body followed Five Years or Longer. Amer. d. Ophthal. 25, 962-967 (1942).
LES MELANOMES MALINS DE LA CHOROIDE
467
FRANqOIS, J., M. RABAEY & A. LAGASSE. Examen
au microscope 61ectronique d'un s a r c o m e de l'uv6e. Bull. Soc. beige Ophtal. 119, 504-513 (1958) et Ophthalmologica 137, 65-73 (1959). - - - - Electron Microscopic Observations on Choroid, Pigment Epithelium and Pecten of the Developing Chick in Relation to Melanin Synthesis. Ophthalmologica 146, 415-431 (1963). - Etude au microscope 61ectronique d'une vingtaine de cas de m61anome malin de la choroide. Bull. Soc. belge OphtaL 136, 235-243 (1964). JENSEN, O. g. Communication personnelle (1964). HOGAN, M . J. & L. FEENEY. Ultrastructure of Malignant Melanomas of the Choroid. Invest. Ophthal. 1,544-555 (1962). HOLT, S. J. & R. M. HICKS. Studies on Formalin Fixation for Electron Microscopy and Cytochemical Staining Purposes. J. biophys, bioehem. Cytol. 11, 41-45 (1961). RABAEY, M. & A. LAGASSE. L'ultrastructure d'un sarcome de l'uv6e. Bull. Micr. appl. 9, 21~5 (1959). SABATINI, D. D., K. BENSCH & R. J. BARRNETT. Cytochemistry and Electron Microscopy. The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation. J. Cell. Biol. 17, 19-58 (1963). (Clinique Ophtalmologique de l'Universit6 de Gand, Directeur: Prof. s. FRAN~2OIS).