Leitthema Hautarzt DOI 10.1007/s00105-015-3723-9 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2015
K. Hoffmann1 · M. Hertl2 · C. Sitaru1,3 1 Klinik für Dermatologie und Venerologie, Universitätsklinikum Freiburg, Freiburg, Deutschland 2 Klinik für Dermatologie und Allergologie, Universitätsklinikum Marburg, Marburg, Deutschland 3 MVZ Labor Clotten, Freiburg, Deutschland
Molekulare Diagnostik der blasenbildenden Autoimmundermatosen Die Kriterien zur Klassifikation einer Erkrankung als Autoimmunkrankheit wurden erstmals in den 1950er-Jahren von Ernst Witebsky in Anlehnung an die Koch-Postulate entwickelt. In überarbeiteter Form besagen sie, dass bei einer Autoimmunerkrankung Folgendes erfüllt sein sollte: 55passende klinische und Laborbefunde (z. B. der Nachweis gewebsgebundener Autoantikörper im betroffenen Organ), 55Reproduktion des Krankheitsbildes in Tiermodellen nach Immunisierung mit dem Autoantigen, 55als direkter Beweis gilt die Krankheitsinduktion durch den passiven Transfer von Autoantikörpern und/ oder autoreaktiven T-Zellen [1]. Diese Kriterien sind auf die Klassifikation aller Autoimmundermatosen anwendbar. Das Vorhandensein von Autoantikörpern ist allerdings nicht mit einer Autoimmunerkrankung gleichzusetzen. Autoimmunphänomene im Sinne natürlich vorkommender Autoantikörper oder T-Zellen sind zum einen in vielen Fällen physiologisch, zum anderen sind Erkrankungen, die hauptsächlich durch eine T-Zell-vermittelte Autoimmunreaktion verursacht werden, nicht zwangsläufig mit spezifischen Autoantikörpern assoziiert. Der Nachweis von Autoantikörpern besitzt daher je nach Krankheitsbild eine unterschiedliche diagnostische Wertigkeit. Bei Erkrankungen wie der Psoriasis, der Alopecia areata oder der Vitiligo wird die Diagnose hauptsächlich anhand klinischer Merkmale gestellt, während die Diagnosestellung bei blasen-
bildenden Autoimmundermatosen, Kollagenosen oder Vaskulitiden weitere diagnostische Schritte erfordert. Ein unerlässliches Kriterium stellt dabei der Nachweis von Autoantikörpern und Komplementprodukten im erkrankten Gewebe oder im Patientenserum mittels direkter bzw. indirekter Immunfluoreszenz dar. Die molekulare Spezifität der in der indirekten Immunfluoreszenz nachgewiesenen Autoantikörper kann mittels Immunassays wie dem ELISA („enzyme-linked immunosorbent assay“) oder Immunoblot charakterisiert werden [2, 3]. Die Bestimmung von Autoantikörpern im Serum sollte als Screeningmaßnahme in der Frühdiagnostik eingesetzt werden. Dies ermöglicht insbesondere in klinisch nicht eindeutigen Fällen eine präzise Diagnose und damit eine frühzeitige Einleitung der immunsuppressiven Therapie. Der Nachweis erkrankungsspezifischer Autoantikörper hat ferner auch eine wichtige prognostische Bedeutung, da die Entwicklung der klinischen Manifestation um Monate bis Jahre vorausgehen kann, wie Studien an Patienten mit systemischen Autoimmunerkrankungen zeigen konnten [4]. Während Autoantikörper mit einem breiten Spektrum an molekularen Spezifitäten mittlerweile als wertvolle diagnostische Marker etabliert sind, ist ihre pathogenetische Bedeutung sehr unterschiedlich und teils noch unklar. Nur bei bestimmten Autoimmundermatosen, insbesondere den blasenbildenden, konnte das pathogene Potenzial eindeutig gezeigt werden. Für einzelne Autoantikörper, z. B. gegen Strukturproteine der
Haut und die Gewebstransglutaminase konnte zudem eine Korrelation mit der Krankheitsaktivität gezeigt werden, sodass sich die Bestimmung des Serumspiegels als Verlaufsparameter eignet.
Methoden der immundermatologischen Diagnostik Direkte Immunfluoreszenz Die direkte Immunfluoreszenz ist ein Verfahren, bei dem Immunreaktanten (typischerweise Immunglobuline oder Komplementbestandteile) im Patientengewebe fluoreszenzoptisch sichtbar gemacht werden können. Die Gewebeprobe wird dafür mit spezifischen Antikörpern inkubiert, an die ein Fuoreszenzfarbstoff gekoppelt ist. Mithilfe dieses Verfahrens kann das Verteilungsmuster der spezifischen Ablagerungen beurteilt werden. Zeitpunkt und Ort der Biopsie sind von entscheidender Bedeutung. Bei blasenbildenden Erkrankungen sollte nicht die primäre oder eine aus dieser entstandene Läsion, sondern die unmittelbare nichtbullöse Umgebung biopsiert werden, da an Hautbereichen, wo bereits eine Spaltbildung stattgefunden hat, Immunreaktanten häufig schon degradiert sind. DDEine vorhergehende Therapie mit topischen oder systemischen Steroiden sowie anderen Immunsuppressiva kann die immunpathologischen Befunde signifikant beeinflussen. Die Biopsie sollte daher möglichst vermieden bzw. erst nach einer TherapieDer Hautarzt
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Leitthema pause durchgeführt werden. Weitere Quellen falsch negativer Ergebnisse können mit einer inadäquaten Präanalytik zusammenhängen. Das Biopsat kann bei einer Transportdauer von bis zu 48 h in Kochsalzlösung ins Labor eingesandt werden. Alternativ kann die Probe bei − 70 °C gefroren oder in einem speziellen Puffer (z. B. Michel’s Lösung) transportiert werden [5].
Indirekte Immunfluoreszenz Bei diesem Verfahren werden zirkuli erende Autoantikörper im Patient enserum nachgewiesen. Hierfür wird das verdünnte Patientenserum mit Substraten inkubiert, die die vermuteten Autoantigene enthalten. Da die indirekte Immunfluoreszenz oft als Suchtest eingesetzt wird, sind die Substrate meist Organschnitte oder kultivierte Zellen, die eine breite Reihe relevanter Autoantigene exprimieren (z. B. Haut, Ösophagus, Hep-2-Zellen oder Granuloyzten). Im Anschluss wird das Substrat mit einem Fluorochrom-markierten Zweitantikörper, spezifisch für humanes IgG und IgA, inkubiert, der die Autoantikörperdes Patienten an der jeweiligen Bindungsstelle sichtbar macht [2, 5]. Für den Nachweis von Autoantikörpern gegen Strukturproteine der Haut fungieren hauptsächlich die Spalthaut bzw. der Ösophagus als Substrate in der indirekten Immunfluoreszenz. Bei der Spalthaut handelt es sich um normale humane Haut, in der nach Inkubation in 1MKochsalzlösung eine künstliche Spaltbildung innerhalb der Lamina lucida der Basalmembran hervorgerufen wird. Somit können Autoantikörper gegen die epidermale Basalmembran weiter differenziert werden, je nach Bindung an die epidermale oder dermale Seite des artifiziellen Spaltes, die wiederum die Lokalisation der entsprechenden Autoantigene widerspiegelt. Autoantikörper bei Patienten mit Pemphigus oder Dermatitis herpetiformis lassen sich optimal auf Ösophagus nachweisen. Die Erkennung des Bindungsmusters in der indirekten Immunfluoreszenz erfordert viel Erfahrung. Die Methode erfasst jedoch ein breites Spektrum an Autoantikörperspezifitäten und lässt Rückschlüsse
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auf die jeweiligen Autoantigene zu, die in Folgeuntersuchungen gezielt bestimmt werden können [2, 6].
Molekulare Immunoassays Immunoassays wie ELISA, Immunoblot, Radioimmunassay oder Immunpräzipitation ermöglichen insbesondere unter Verwendung von rekombinanten oder aufgereinigten Antigenen eine exakte Charakterisierung der molekularen Spezifität der Autoantikörper.
„Enzyme-linked immunosorbent assay“ Von diesen Testverfahren ist der ELISA die am häufigsten verwendete Methode. Bei diesem Verfahren werden Mikrotiterplatten mit rekombinanten Antigenfragmenten beschichtet, die in Bakterien oder eukaryotischen Zellen hergestellt wurden. Bei Inkubation dieser Platten mit Patientenserum können die darin enthaltenen Autoantikörper an die angebotenen Peptide binden und durch einen Zweitantikörper sichtbar gemacht werden. Der für humane Immunglobuline spezifische Zweitantikörper ist an ein Enzym gekoppelt, das eine Farbreaktion vermittelt, sobald ein chromogenes Substrat hinzugefügt wird. Über die spektrophotometrische Messung der Farbintensität können Rückschlüsse auf die Titerhöhe der Autoantikörper im Serum gezogen werden. Dies ist essenziell für das Therapiemonitoring, da Titerhöhe und Krankheitsaktivität häufig korrelieren und Krankheitsrezidive prämonitorisch erfasst werden können [2, 3, 6].
Immunoblot Mittels Immunoblot (auch Westernblot) können Autoantikörper gegen rekombinante oder native Antigene nachgewiesen werden. Diese Methode lässt qualitative oder semiquantitative Aussagen zu. Initial werden Antigene aus Zelloder Gewebeextrakten elektrophoretisch nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt und auf eine Membran übertragen. So kann auch die Größe der Antigene charakterisiert werden, gegen die sich die Autoantikörper im Patientenserum
richten. Die auf der Membran separierten Proteinbanden werden mit dem Patientenserum inkubiert. Darin enthaltene Autoantikörper können auf der Membran spezifisch binden und werden anschließend mit einem enzymmarkierten Zweitantikörper über eine Farbreaktion oder Chemilumineszenz sichtbar gemacht [2, 3].
Immunpräzipitation Die Immunpräzipitation wird genutzt, um spezifische Autoantikörper durch das Ausfällen entsprechender Autoantigene nachzuweisen. Das Proteingemisch besteht dabei aus lysierten Keratinozyten einer Zellkultur oder deren Medium. Dies wird mit dem Patientenserum vermischt, sodass die Autoantikörper an ihre Zielstrukturen binden können. Dabei entstehen Immunkomplexe, die das Autoantigen enthalten. In einem zweiten Schritt werden mit Protein A/G überzogene Kügelchen hinzugegeben, die spezifisch an den FcAnteil des IgG binden. Die Antigen-Antikörper-Komplexe werden an die Kügelchen gebunden und können so aus der Lösung ausgefällt werden. Die Präzipitate werden in einer Gelelektrophorese (SDSPAGE) aufgetrennt und können mittels Immunoblot ggf. weiter charakterisiert werden.
Blasenbildende Autoimmunerkrankungen Die Hauptentitäten dieses Erkrankungskomplexes umfassen die Pemphigusgruppe, die Pemphigoiderkrankungen, die Epidermolysis bullosa acquisita und die Dermatitis herpetiformis Duhring [2]. Diese organspezifischen Autoimmunerkrankungen zeichnen sich durch Bildung von Autoantikörpern gegen Strukturproteine aus, die entweder die Keratinozyten der Epidermis untereinander vernetzen oder deren Kontakt zur epidermalen Basalmembran vermitteln (. Abb. 1). In den letzten Jahrzehnten gelang eine weitgehend vollständige Identifikation der Hauptautoantigene sowie deren relevanter Epitope. Dies ermöglichte die Entwicklung empfindlicher und spezi-
Zusammenfassung · Abstract fischer diagnostischer Nachweisverfahren. Nach wie vor erschweren Überlappungen zwischen den Krankheitsbildern sowie einzelne, noch nicht identifizierte Antigene die Diagnosestellung. In solchen Fällen bleiben die diagnostischen Abläufe trotz moderner Testverfahren eine spannende Herausforderung. DDAls Autoantigene fungieren in erster Linie Komponenten von Desmosomen und Hemidesmosomen. Die . Abb. 2 enthält einen Algorithmus zur Diagnosestellung blasenbildender Erkrankungen. Bedingt durch den hohen Leidensdruck, wird häufig schon bei der Erstvorstellung eine immunsuppressive Therapie begonnen. Es empfiehlt sich daher, die initiale Diagnostik möglichst vollständig durchzuführen. Dabei sollten in allen Fällen mit Verdacht auf eine blasenbildende Autoimmundermatose eine Hautbiopsie für die Histologie und für die direkte Immunfluoreszenz sowie eine Serumprobe für eine indirekte Immunfluoreszenz bzw. weitere serologische Untersuchungen gewonnen werden [7].
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Der Nachweis von gewebsgebundenen bzw. zirkulierenden Auto-AK ist Voraussetzung für die Diagnose einer bullösen Autoimmundermatose Pemphigusgruppe Der Pemphigus vulgaris zeichnet sich durch eine intraepitheliale, akantholyti sche Spaltbildung mit Autoantikörpern gegenüber Proteinen, welche die ZellZell-Adhäsion vermitteln, aus. Als Autoantigene wurden bisher Desmoglein 1 und 3, weitere desmosomale Komponenten wie Desmocollin 1 und 3 sowie weniger gut charakterisierte Antigene (α9Acetylcholin-Rezeptor und Pemphaxin) beschrieben. Der Nachweis von Autoantikörpern gegen Desmoglein 1 und 3 ist in der Routinediagnostik fest verankert [2, 8]. In der Regel korrelieren die Spiegel
Hautarzt DOI 10.1007/s00105-015-3723-9 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2015 K. Hoffmann · M. Hertl · C. Sitaru
Molekulare Diagnostik der blasenbildenden Autoimmundermatosen Zusammenfassung Blasenbildende Autoimmundermatosen sind organspezifische Erkrankungen, in denen es zu einer autoantikörpervermittelten Spaltbildung an Haut und/oder Schleimhäuten kommt. Der Nachweis gewebsgebundener und im Serum zirkulierender Autoantikörper ist notwendig für die Diagnose. Die Unterformen dieser Erkrankungsgruppe sind klinisch häufig schwer zu differenzieren. Eine präzise Diagnose ist jedoch wichtig, da sie Prognose und Therapieregime maßgeblich beeinflusst. Als etablierte diagnostische Verfahren haben sich in der Praxis die direkte und indirekte Immunfluoreszenz bewährt. Sie erlauben erste Aussagen über das Bindungs-
muster sowie die Klasse der Immunglobuline und somit die Klassifikation der blasenbildenden Erkrankung. Für eine genauere Einteilung der Erkrankung werden in der Regel Untersuchungen zur molekularen Spezifität der Autoantikörper benötigt. Bei bullösen Autoimmundermatosen eignet sich die quantitative Bestimmung von Autoantikörpern häufig als Verlaufsparameter. Schlüsselwörter Autoantikörper · Desmosomen · Hemidesomosomen · Pemphigus · Pemphigoid
Molecular diagnosis of autoimmune dermatoses Abstract Bullous autoimmune diseases are organ-specific disorders characterized by an autoantibody-mediated blistering of skin and mucous membranes. The detection of tissuebound and serum autoantibodies is prerequisite for the diagnosis of autoimmune blistering diseases. The individual entities of this group may be difficult to differentiate on clinical grounds alone. An accurate diagnosis is however important for prognosis and therapy. A preliminary diagnostic step includes direct and indirect immunofluorescence microscopy, which provide information about the binding pattern and isotype of autoanti-
der Autoantikörper gegen Desmoglein 3 und 1 mit der klinischen Erkrankungsaktivität. Bei der Akantholyse bleiben die durch Hemidesmosomen an der Basalmembran verankerten Keratinozyten befestigt. Dieses Phänomen wird in der histopathologischen Untersuchung als „Reihe von Grabsteinen“ bezeichnet [6].
Pemphigus foliaceus
Der Pemphigus foliaceus stellt eine oberflächliche, in der Regel milder verlaufende Variante der Pemphiguserkrankungen dar. Histologisch findet die akantholytische Spaltbildung typischerweise im subkornealen Bereich der Epidermis statt, während beim Pemphigus vulgaris die suprabasalen Zellschichten
bodies and allow the diagnosis of the autoimmune blistering disease. Subsequent characterization of the molecular specificity of autoantibodies is necessary for the exact classification of autoimmune bullous dermatoses. The quantitative measurement of autoantibodies against structural proteins of the skin may be often used to assess disease severity at follow-up. Keywords Autoantibodies · Desmosomes · Hemidesmosomes · Pemphigus · Pemphigoid
betroffen sind. Es finden sich typischerweise ausschließlich Autoantikörper gegen Desmoglein 1 und kein Schleimhautbefall [2, 8]. Die direkte Immunfluoreszenz beim Pemphigus zeigt IgG- und C3Ablagerungen mit netzartigem Verteilungsmuster zwischen den Keratinozyten der Epidermis. In der indirekten Immunfluoreszenz auf Affenösophagus wird ebenfalls eine Bindung von Autoantikörpern mit einem interzellulären Fluoreszenzmuster am Epithel nachgewiesen. Die molekulare Spezifität der Autoantikörper kann im ELISA mit rekombinantem Desmoglein 1 und Desmoglein 3 charakterisiert werden. Die Serumspiegel der DesmogleinDer Hautarzt
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Abb. 1 8 Spezifität und Bindungsmuster der Autoantikörper bei blasenbildenden Autoimmundermatosen. a Schematische Darstellung der Epidermis sowie deren Adhäsionsstrukturen. Desmosomen vermitteln den Zusammenhalt von Keratinozyten untereinander und sind Zielstruktur bei Erkrankungen der Pemphigusgruppe; Hemidesmosomen verankern die Keratinozyten an der Basalmembran und spielen als Autoantigene bei Pemphigoiderkrankungen eine wichtige Rolle. b Desmosomen bestehen aus transmembranösen Cadherinen (Desmogleine, Desmocolline) und werden intrazellulär an Keratinfilamente über Plakine der desmosomalen Plaque verankert. c Hemidesmosomen bestehen aus transmembranösen Proteinen (Kollagen XVII und α6β4-Integrin), die an den intrazellulären Plaqueproteinen BP230 und Plektin binden. Letztere stellen die Verbindung zu intrazellulären Keratinfilamenten dar. Extrazellulär binden Kollagen XVII und α6β4-Integrin an extrazelluläre Matrixproteine wie Laminin (Ln) 332, die Liganden für Kollagen VII, den Hauptbestandteil dermaler Ankerfibrillen darstellen. Im Falle einer subepidermalen Spaltbildung innerhalb der Lamina lucida verbleiben blau markierte Strukturproteine am Blasendach, rot markierte am Blasenboden. Die (epidermale) Transglutaminase (TG) kann sowohl intraals auch extrazellulär vorkommen. d Die indirekte Immunfluoreszenz auf Affenösophagus zeigt Bindung von Endomysiumspezifischen IgA-Autoantikörpern aus dem Serum eines Patienten mit Dermatitis herpetiformis. e Die direkte Immunfluoreszenz aus periläsionaler Haut eines Patienten mit Dermatitis herpetiformis zeigt granuläre IgA-Ablagerungen an der Basalmembran. f Indirekte Immunfluoreszenz auf Affenösophagus; netzartige Bindung von IgG-Autoantikörpern aus dem Serum eines Patienten mit Pemphigus vulgaris. g Indirekte Immunfluoreszenz auf Urothel einer Rattenblase mit Bindung von IgG-Autoantikörpern aus dem Serum eines Patienten mit paraneoplastischem Pemphigus. h Die direkte Immunfluoreszenz einer periläsionalen Biopsie eines Patienten mit Pemphigus vulgaris zeigt ein interzelluläres Bindungsmuster von IgGAutoantikörpern. i Indirekte Immunfluoreszenz auf 1M NaCl-Spalthaut; lineare Bindung von IgG-Autoantikörpern aus dem Serum eines Patienten mit bullösem Pemphigoid am Blasendach. j Indirekte Immunfluoreszenz auf 1M NaCl-Spalthaut mit Bindung von IgG-Autoantikörpern aus dem Serum eines Patienten mit Epidermolysis bullosa acquisita am Blasenboden. k Die direkte Immunfluoreszenz aus einer periläsionalen Biopsie eines Patienten mit bullösem Pemphigoid zeigt lineare Bindung von IgG-Autoantikörpern entlang der Basalmembran
spezifischen Autoantikörper sind als verlässlicher Verlaufsparameter der Krankheitsaktivität einsetzbar.
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IgA-Pemphigus
Der IgA-Pemphigus ist eine seltene Variante, in der sich Immunglobuline der Klasse A gegen Strukturproteine der Epidermis richten. Man unterscheidet 2 Formen:
55den Subcorneal-pustular-dermatosisTyp (SPD-Typ) und 55einen Intraepidermal-neutrophilicIgA-dermatosis-Typ (IEN-Typ).
Anamnese + Klinik (Erytheme, Erosionen, Krusten, Blasen, Schleimhautläsionen)
Hereditär:
DD´s bei Blasenbildung
Immunologisch: • • • •
Histologie + DIF intraepidermaler Spalt (Histo) interzellulär Ig + C3 (DIF)
• Epidermolysis bullosa Gruppe (-junktionalis, -bullosa, -dystrophica) • Porphyrien
Bullöser Lupus erythematodes Erosiver Lichen ruber EEM SJS/ TEN
Infektiös: • • • • •
Impetigo contagiosa Bullöses Erysipel Varizellen Herpes simplex Hand-Fuß-Mund Krankheit
Sonstige: • • • • •
Porphyria cutanea tarda Bullosisdiabeticorum Bullöse Insektenstichreaktion Traumatische/toxische Blasen Artefakte
subepidermaler Spalt (Histo) linear/granulär Ig + C3 (DIF)
IIF (Affenösophagus) Interzellulär IgG/C3
Interzellulär IgA/C3
Interzellulär + linear IgG/C3
linear IgG/C3 an Basalmembran
linear IgA/C3 an Basalmembran
granulär IgA/C3 an Basalmembran
ggf. ELISA Dsg 1+3
Dsg1
PF
IIF auf Dsc-transfizierten COS-7 Zellen
Dsg3 + (1)
PV
IgA-Pemphigus
IIF (SSS) IgA/G
IIF (Rattenblase)
linear und/oder Interzellulär IgG/C3
IgG
Immunoblot Plakine Immunpräzipitation
Immunoblot KeratinozytenExtrakt
Plakine
Lny-1
PNP
p200
PEMPHIGUS
Blasenboden
ELISA Kollagen VII
Ln332 Kollagen VII
MMP
EBA
Blasendach IgA IgG
IgA
EBA
IIF (Affenöso.) IgA
Blasenboden + Dach IgA IgG/IgA Immunoblot KeratinozytenExtrakt
ELISA BP180 (BP230)
Immunoblot KeratinozytenMedium
BP180 BP230
BP180
Ln332
LAD-1
BP
PG
MMP
LAD
PEMPHIGOID
Endomysium
ELISA Epidermale-/ Gewebetransglut. IgA
DH
M. D U H R I N G
Abb. 2 8 Diagnostischer Algorithmus bei blasenbildenden Autoimmundermatosen: Eine Hautbiopsie für Histologie und direkte Immunfluoreszenz sowie eine Serumprobe für die indirekte Immunfluoreszenz stellen die diagnostische Grunduntersuchung bei blasenbildenden Autoimmunerkrankungen dar. Dadurch lässt sich eine intrazelluläre (Pemphigusgruppe) von einer subepidermalen Spaltbildung (Pemphigoidgruppe/Dermatitis herpetiformis) unterscheiden. Innerhalb der Pemphigusgruppe können durch eine indirekte Immunfluoreszenz sowie verschiedene Spezialuntersuchungen die einzelnen Unterformen differenziert werden. Innerhalb der Pemphigoidgruppe gibt die indirekte Immunfluoreszenz Aufschluss darüber, ob die Autoantikörper am Boden oder Dach der artifiziellen Blase binden. Weitere Spezialuntersuchungen helfen, die einzelnen Unterformen abzugrenzen. Die Dermatitis herpetiformis zeigt schon in der direkten Immunfluoreszenz ein granuläres IgA-Muster und kann durch weitere serologische Untersuchungen bestätigt werden. BP bullöses Pemphigoid, DH Dermatitis herpetiformis, DD Differenzialdiagnose, DIF direkte Immunfluoreszenz, Dsc Desmocollin, Dsg Desmoglein, EBA Epidermolysis bullosa acquisita, EEM Erythema exsudativum multiforme, IIF indirekte Immunfluoreszenz, LAD lineare IgA-Dermatose, Ln Laminin, MMP Schleimhautpemphigoid, PF Pemphigus foliaceus, PG Pemphigoid gestationis, PV Pemphigus vulgaris, PNP paraneoplastischer Pemphigus, p200 Anti-p200-Pephigoid, SJS Stevens-Johnson-Syndrom, SSS „Staphylococcal scalded skin syndrome“, TEN toxische epidermale Nekrolyse
Zirkulierende IgA-Autoantikörper beim SPD-Typ richten sich gegen Desmocollin 1–3. Die Zielstruktur beim IEN-Typ ist bis heute noch nicht aufgeklärt. In der direkten Immunfluoreszenz zeigen sich interzelluläre IgAAblagerungen in der Epidermis. Die indirekte Immunfluoreszenz erfolgt auf Affenösophagus, bietet mit ca. 50 % jedoch nur eine schlechte Sensitivität. Die IgAAutoantikörper beim SPD-Typ können mittels indirekter Immunfluoreszenz auf Desmocollin-transfizierten COS-7-Zellen
bzw. im ELISA mit rekombinantem Antigen nachgewiesen werden [2].
Paraneoplastischer Pemphigus
Der paraneoplastische Pemphigus (PNP) ist eine seltene autoimmune Multisystemerkrankung, die neben der Haut auch andere Organe befällt. Die Assoziation mit malignen oder auch benignen Neoplasien (häufig lymphoproliferativen Erkrankungen) ist obligat. Die Autoantikörper des PNP erkennen mehrere Antigene und richten sich unter anderem gegen Desmoglein 1
und 3, BP230, Periplakin, Envoplakin und Desmoplakin, sowie α-2-Macroglobulinlike-1 und Plektin. Da beim PNP sowohl Proteine der Zell-Zell-Kontakte als auch der dermoepithelialen Junktionszone Zielstrukturen der Autoantikörper sind, zeigt die direkte Immunfluoreszenz IgG- und C3-Ablagerungen sowohl mit interzellulärem als auch mit linearem Verteilungsmuster entlang der Basalmembran. Ein analoges Ergebnis erhält man bei der indirekten Immunfluoreszenz. Sie zeigt analog eine netzförmige intraepitheliale und eine lineare Der Hautarzt
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Leitthema basalmembranspezifische Bindung der Immunreaktanten. Als Substrat kann wie bei allen anderen Pemphiguserkrankungen der Affenösophagus eingesetzt werden, ein noch spezifischeres Ergebnis erzielt man jedoch in einer ergänzenden Untersuchung mit dem Urothel einer Rattenblase. Auf diesem Substrat werden Plakine stark exprimiert, die Hauptantigene beim PNP darstellen. Die Methoden, die hier zur Charakterisierung der molekularen Spezifität der Autoantikörper benutzt werden, sind vielfältig. Lange Zeit war die Immunpräzipitation mit radioaktiv markierten Keratinozyten der Goldstandard bei diesem Krankheitsbild. Mittlerweile werden auch ELISA mit rekombinantem Evo- und Periplakin eingesetzt. Auch im Immunoblot mit Extrakten kultivierter Keratinozyten können Antikörper gegen die genannten Plakine nachgewiesen werden [2].
Pemphigoidgruppe Die Pemphigoiderkrankungen sind durch subepidermale Blasen und Autoantikörper gegen die epidermale Basalmembran gekennzeichnet. Hauptvertreter dieser Gruppe sind das bullöse Pemphigoid, die lineare IgA-Dermatose und das Schleimhautpemphigoid. Seltenere Formen stellen das Anti-p200Pemphigoid und das Schwangerschafts pemphigoid dar. Die Hauptautoantigene der Pemphigoiderkrankungen sind hemidesmosomale Proteine wie Kollagen XVII/BP180, BP230, α6β4Integrin und Proteine der extrazellulären Matrix wie Laminin 332. Die Bindung der Autoantikörper an ihre Zielstrukturen initiiert eine komplement- und granulozytenabhängige Entzündungsreaktion, die zur Gewebeschädigung und Blasenbildung führt [2, 9]. Da sich die diagnostischen Abläufe der meisten Pemphigoiderkrankungen stark ähneln, werden zunächst die für Pemphigoiderkrankungen charak teristischen Befunde erläutert, und im Anschluss wird auf spezifische Gegebenheiten einzelner Krankheitsbilder eingegangen. Die direkte Immunfluoreszenz von Pemphigoidpatienten zeigt lineare Ab-
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lagerungen von IgG, IgA und C3 entlang der Basalmembran periläsionaler (Schleim-)Haut. In der indirekten Immunfluoreszenz auf Salzspalthaut binden die IgG- oder IgA-Autoantikörper entweder am Dach (Kollagen XVII/ BP180, BP230 und α6β4-Integrin) oder Boden (Laminin 332, Kollagen VII und p200) des artifiziellen Spaltes (. Abb. 1). Da die IgG-Autoantikörper bei bullösem Pemphigoid und Pemphigoid gestationis eine besonders hohe Fähigkeit aufweisen, Komplement zu aktivieren, können sie auch durch eine modifizierte Form der indirekten Immunfluoreszenz (sog. Komplementbindungstest) nachgewiesen werden. Bei dieser Untersuchung wird nach Inkubation des Patientenserums mit dem Substrat das Serum eines gesunden Spenders als zusätzliche Komplementquelle hinzugegeben. Dadurch können Komplementablagerungen noch besser zur Geltung gebracht werden. Die quantitative Messung zirkulierender Autoantikörper kann mittels ELISA mit rekombinantem BP180 oder BP230 erfolgen. Die Sensitivität des Nachweises von Autoantikörpern gegen BP180 mittels ELISA beträgt bei Patienten mit bullösem Pemphigoid ca. 80–90 %, die des BP230ELISA 60–80 %. Werden beide Verfahren kombiniert, reagieren 97 % der Seren von BP-Patienten positiv. Im Gegensatz zum BP230-Autoantikörper korreliert die Titerhöhe BP180-spezifischer Autoantikörper besser mit der Krankheitsaktivität und sollte daher primär beim Therapiemonitoring Anwendung finden.
Pemphigoid gestationis
Bei Schwangeren, die an einem Pemphigoid gestationis erkranken, können IgG-Antikörper die Plazentaschranke passieren und lösen bei ca. 10 % der Neugeborenen Hautveränderungen aus. Diese heilen postpartal durch Abbau der mütterlichen IgG innerhalb weniger Wochen spontan ab. Häufig werden Autoantikörper gegen Kollagen XVII/ BP180, weniger häufig auch gegen BP230 nachgewiesen.
Lineare IgA-Dermatose
Die lineare IgA-Dermatose ist eine Pemphigoiderkrankung, die in der direkten Immunfluoreszenz durch lineare
IgA-Ablagerungen an der epidermalen Basalmembran gekennzeichnet ist. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Autoantikörper gegen ein 97 kDa (LABD97) und ein 120 kDa (LAD-1) großes Protein richten. Beides sind proteolytische Spaltprodukte der extrazellulären Ektodomäne von Kollagen XVII/BP180. Sie wird in der Zellkultur in das Keratinozytenmedium abgegeben werden und kann aus diesem mittels Immunoblot nachgewiesen werden [2].
Schleimhautpemphigoid
Das Schleimhautpemphigoid kann die Mukosa an mehreren Lokalisationen befallen und zeigt einen schwerwiegenden, oft ausgesprochen chronischen Verlauf [10]. Es ist mit Autoantikörpern gegen mehrere Proteine der dermoepithelialen Junktionszone assoziiert. Am häufigsten werden Autoantiköper gegen Kollagen XVII/BP180 und Laminin 332, seltener jedoch auch gegen α6β4-Integrin, BP230 und Kollagen VII nachgewiesen. Interessanterweise ist das Auftreten von Autoantikörpern gegen Laminin 332 in ca. 25 % der Fälle mit einem Malignom assoziiert [2]. Die Autoantikörperreaktivität bei den Patienten mit Schleimhautpemphigoid ist häufig niedrig, sodass in bis zu 50 % der Fälle über diese Methode keine Autoantikörper nachgewiesen werden können [2, 5]. Der molekularen Diagnostik kommt beim Schleimhautpemphigoid eine besondere Bedeutung zu. IgG- und IgA-Autoantikörper gegen BP180 können mittels ELISA (rekombinanter C-Terminus von BP180) oder Immunoblot mit Keratinozytenextrakt nachgewiesen werden. IgGAutoantikörper gegen Laminin 332 werden mittels Immunpräzipitation mit kultivierten Keratinozyten oder im Immunoblot mit Keratinozytenextrakt bzw. aufgereinigtem Protein nachgewiesen [2].
Anti-p200-Pemphigoid
Beim Anti-p200-Pemphigoid können im Immunoblot mit dermalen Extrakten Autoantikörper gegen ein 200 kDa großes Protein nachgewiesen werden [2, 5]. Die Autoantikörper der meisten Patienten erkennen den C-Terminus von Laminin γ1.
Kommerzielle Immunoassays für diese seltene Erkrankung befinden sich aktuell in der Entwicklung.
Epidermolysis bullosa acquisita Die Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) ist ein seltenes, aber häufig schwer verlaufendes Krankheitsbild mit Autoantikörpern gegen Kollagen VII, die Hauptkomponente der Verankerungsfibrillen an der Basalmembran. Man unterscheidet einen inflammatorischen und einen nichtinflammatorischen Typ der EBA. Der inflammatorische Typ ist klinisch oftmals nicht von anderen Pemphigoidformen abzugrenzen. Die nichtinflammatorische Form ist durch Hautfragilität gekennzeichnet und wird daher auch als mechanobullöser Subtyp bezeichnet. Sie ähnelt klinisch der hereditären EBA, die einen genetischen Defekt in Kollagen VII aufweist. Schäden an der Haut heilen bei dieser Form unter Milien und Narbenbildung ab [2, 6]. Die direkte Immunfluoreszenz zeigt lineare IgG-, IgA- und C3-Ablagerungen entlang der dermoepidermalen Junktionszone. In der indirekten Immunfluoreszenz auf 1M (molar) Spalthaut binden sowohl IgG- als auch IgA-Autoantikörper am Boden des artifiziellen Spaltes. Im ELISA können IgG-Autoantikörper gegen mehrere, rekombinant hergestellte Epitope des Kollagen VII detektiert werden [11]. Einen kommerziellen IgA-ELISA gibt es bisher nicht. Im Immunoblot werden zur Detektion entweder rekombinante Proteine oder dermale Keratinozytenextrakte verwendet [2, 5].
Dermatitis herpetiformis Die Dermatitis herpetiformis (DH; Morbus Duhring) ist obligat – wenn auch oft subklinisch – mit einer Zöliakie vergesellschaftet [12, 13]. Immunserologisch finden sich Autoantikörper gegen Endomysium, die bindegewebige Hülle der Muskelfibrillen, welche die epidermale Transglutaminase spezifisch erkennen und mit der Gewebstransglutaminase, dem Autoantigen der Zöliakie, kreuzreagieren. Die IgA-Autoantikörper haben gegenüber IgG-Autoantikörper eine höhere Spezifität und werden in erster Linie bestimmt,
während IgG-Autoantikörper nur bei Personen mit IgA-Mangel diagnostisch zum Einsatz kommen [2]. In der direkten Immunfluoreszenz aus periläsionaler Haut zeigen sich granuläre IgA- und C3-Ablagerungen entlang der papillären Dermis mit Betonung in den Papillenspitzen. In der indirekten Immunfluoreszenz auf Affenösophagus können IgA-Autoantikörper gegen Endomysium nachgewiesen werden. Im ELISA binden diese Autoantikörper gewebsständige (Typ 2) und epidermale (Typ 3) Transglutaminase [2].
Fazit für die Praxis 55Bullöse Autoimmundermatosen sind seltene Erkrankungen, deren Diagnosestellung den Nachweis gewebsgebundener und im Serum zirkulierender Autoantikörper erfordert. 55Bei Erstvorstellung sollte eine möglichst vollständige Diagnostik erfolgen, da Untersuchungen nach Beginn einer immunsuppressiven Therapie nur eingeschränkt beurteilt werden können. 55Direkte und indirekte Immunfluoreszenz bilden die Erststufediagnostik. Durch nachgeschaltete Verfahren kann die molekulare Spezifität der Autoantikörper charakterisiert werden. 55Eine enge Zusammenarbeit zwischen Laborarzt und Kliniker ermöglicht eine aussagekräftige, ökonomisch zielgerichtete Diagnostik, von der Patient und Arzt profitieren.
Korrespondenzadresse
Einhaltung ethischer Richtlinien Interessenkonflikt. K. Hoffmann, M. Hertl und C. Sitaru geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht. Dieser Beitrag beinhaltet keine Studien an Menschen oder Tieren.
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Prof. Dr. C. Sitaru Klinik für Dermatologie und Venerologie, Universitätsklinikum Freiburg Hauptstraße 7, 79104 Freiburg
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Danksagung. C. Sitaru erhielt Förderung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SI-1281/5 -1) und der Europäischen Kommission im Rahmen des FP7 Cooperation Program (TARKINAID project no. 282095). Herrn Dr. W. Raif, Freiburg, und Dr. K. Hoffmann, Lohne, danken wir für kritische Durchsicht des Manuskripts und wertvolle Hinweise.
Der Hautarzt
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