(Istituto di Zoologia ed Anatomia Comparata della R. Universits di Padova. [Diretto dal Prof. UMBERTOD'ANCONA].) R I C E R C H E SUL S I G N I F I C A T O ISTOCHIMICO E F U N Z I O N A L E D E L L E G R A N U L A Z I O N I I N T E R F I B R I L L A R I (J E Q) D E L L E F I B R E MUSCOLARI S T R I A T E D I A R T R O P O D I E D I V E R T E B R A T I . Di GIACINTO CIACCIO. Con 16 figure nel testo.
(Eingegangen am 12. April 1941.) Introduzione.
Nel corso d'indagini sulle fibre striate scheletriche, riferite in altre pubblicazioni (CIAccIo 1938), sono giunto alla conclusione che i granuli interfibrillari debbono essere considerati i depositari di sostanze energetiche, in contrapposto alle miofibrille costituite da materiale proteico contrattile. Questa conelusione mi ~ stata suggerita dai risultati di due diverse serie di ricerche. I n un primo tempo ho sottoposto le fibre alla demolizione con agenti chimici: sotto l'azione della pepsina e di acidi le miofibrille si dissolvono completamente, mentre i granuli si conservano nella loro po~izione e forma. Nell'altro gruppo di indagini, espletate con metodi istochimici, ho precisato che sostanze di natura lipidica sono presenti esclusivamente nei granuli, mentre le miofibrille sono costituite di solo materiale proteico. A continuazione di queste ricerche, nell'intento di ottenere altre reazioni istochimiche a livello dei granuli interfibrillari, ho eseguito le osservazioni che riferisco nel presente lavoro. In questo mio nuovo studio ho fatto largo uso di metodi basati su reazioni argentiche. Come ~ noto, tali metodi di impregnazione sono stati largamente usati nelle indagini sulle fibre museolari, sia in ricerehe di istochimica sia in quelle di pura morfologia (identificazione dell'apparato reticolare interno di GOLGI, ricerca delle terminazioni nervose dei museoli). Nell'intraprendere queste mie nuove ricerche mi sono prefisso lo scopo di valutare sia il significato istochimico ehe quello morfologicofunzionale delle immagini dovute all'impregnazione argentica. Come ha messo in rilievo L~soN (1936), le reazioni argentiche si distinguono in due grandi gruppi. Alcune (reazione argentaffine, metodo di GmOUD e LEBLOND per la vitamina C) sono specifiehe, nel senso che, avvenendo la riduzione senza intervento di agenti riduttori estranei, permettono di identificare nei tessuti determinate sostanze riduttrici.
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Giacinto Ciaccio: Ricerche sul significato istochimico
Le altre, al contrario, ad esempio quelle usate per lo studio del tessuto nervoso e del eonnettivo, non sono specifiche poieh~ avvengono in presenza di agenti riduttori estranei. Pertanto reazioni di questo tipo dimostrano una spiccata elettivitg topografica e questo fatto, a mio parere, pub essere utilizzato per lo studio di t)articolari processi metabolici delle cellu]e. Le condizioni strutturali della libra muscolare striata permettono con l'impiego di tall metodi un'accurata indagine istochimica dei diversi costituenti morfologiei; in particolare permettono lo studio delle relazioni biochimiche e funzionali intercorrenti fra i granuli e le miofibril]e. Nel contempo, in riferimento a problemi morfologici, queste mic osservazioni sui metodi argeatici mi hanno spinto a trattare della questione dell'apparato reticolare interno del GOLGI in accordo con le interpretazioni degli AA., che, pifi di recente~ si sono occupati di questo costituente cellulare. Secondo HIRSCK nel sistema di GOLGI bisogna distinguere varie fasi morfologiche e biochimiche; all'apparato di GOLGI non va quindi attribuito esclusivamente un significato morfologico, ma principalmente uu significato biochimico. 0pinioni analoghe erano state gis prospettate da vari AA. (CARMELO CIACCIO, BOWEN, PENSA, LEVI). Questo concetto ~ stato sostenuto particolarmente da CARMELO CIACCIO (1926--1936) che ritiene che gli aspetti dell'apparato di GOLGI siano determinati da (( smescolamento dell'ergoplasma omogeneo, seguito da rigonfiamento e confluenza della fase lipidica dispersa )). Nel]a supposizione che questa interpretazione potesse trovare una verifica nella fibra muscohre, ho inteso osservare se i quadri strutturali dimostrati in questa, mediante l'azione diretta di soluzioni argentiche, fossero sovrapponibili a quelli da me precedentemente ottenuti mediante la metodica di CARMELOCIACCIO per la dimostrazione della ]ipofanerosi.
Notizie bibliografiche. I n altri lavori sulla libra muscolare ~triata (G. CIACCIO 1938), ho gig esposto dettagliatamente i dati bibliografici riferentisi ai granuli interfibrillari. A proposito di questi mi limiter5 ora a ricordare alcuni dati essenziali, riserbando la presente esposizione bibliografica all'esame di problemi eitologici (apparato mitocondriale, apparato reticolare interno di GoLGI) strettamente connessi con l'interpretazione istologica dei granuli interfibrillari. Questi si distinguono, come ~ noto, nei granuli J e Q. Assai facilmente dimostrabili nelle fibre muscolari degli Artropodi, essi sono pure riconoseibfli nei Vertebrati; percib debbono, come ho gig detto altrove, essere considerati costituenti specifici e costanti della libra striata.
e funzionale delle granulazioni interfibrillari.
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I g~anuli J si colorano elettivamente con il bleu di metilene (D'ANCONA 1930; BANK.1930; PISCHINGER 1931; BARmOZZI 1937; LORETI 1940, ecc.) e cosl pure si comportano i granuli Q (G. CIACCIO 1938); tale elettivit~ di colorazione sta a dimostrare che processi di ossido-riduziene si svolgono in essi. Nei confronti di sostanze specifiche, nei granuli souo stati dimostrati carboidrati (ARNOLD 1909; ROJAS e RESTA 1938), lipidi (G. CIACCIO 1936/38) e ceneri fosfatiche (BARmOZZI 1936/37). Molti AA. hanno sostenuto che i granuli interfibrillari o sarcosomi debbano essere identificati con i condriosomi. REGARD e FAVRE (1909) in fibre scheletriche e cardiache di Vertebrati rilevano filamenti e granuli posti presso il nucleo o fra le fibrille; tanto i filamenti quanto i granuli sarebbero formazioni mitocondriali e corrisponderebbero ai granuli interstiziali di K()LLIKER,ai sarcosomi di RETZIUS,ai plasmosomi di ARNOLD e ai granuli 8arcoplasmatici di HOLMGREN. DUESB]~RC (1910) osserva helle fibre muscolari striate di pollo granulazioni e corti bastoncini colorati in viola scuro con il metodo di BENDA; li ritiene corrispondenti ai condriosomi. Della stessa opinione di REGAUD e FAVRE e di DUESBERG sono PRENANT (1911), LUNA (1913) e TORRACA (1914). Tanto LVNA (1913) per le fibre scheletriche e cardiaehe di Anfibi, Rettili e Mammiferi, quanto TORRACA (1914) per le fibre in rigenerazione di tritone considerano i condriosomi materiale di riserva per la formazione di nuove fibrille. ROMEIS (1913) nelle fibre muscolari in rigeneI azione del tritone osserva formazioni granulari di natura mitocondriale; ritiene che tall granuli (plastosomi) non corrispondano ai granuli di HOLMGREN. BULLARD (1912) rileva nelle fibre scheletriche dei Vertebrati i granuli J, mentre in quelle dei muscoli pettorali di piceione e di pipistrello i granuli Q. Studia i caratteri di solubilit'~ dei granuli nei solventi dei grassi e le reazioni tintoriali con i coloranti speeifici di questi e l i descrive nei preparati allestiti con i metodi di BENDA e di REGAUD. Quanto alla lore natura chimica, ritiene che siano costituiti da sostanze albuminolipoidee; insieme ai granuli si trovano anche numerose goccioline di grasso. Nelle fibre cardiache dei Mammiferi BULLARD (1916) descrive i granuli Q; questi vengono ritenuti di natura mitocondriale e costituiti da fosfolipidi. JORDAN (1919, 1920, 1933) ha dedicate accurate ricerche ai granuli interfibrillari delle fibre degli Artropodi; ritiene che siano costituiti di carboidrati, lipidi e sostanze proteiche. Pur presentando i granuli reazioni chimiche e colorazioni simili a quelle dei mitocondri, JORDAN non crede d'identificarli con questi. Per A. M]~Y~.R(1920--1926) i granuli J corrispondono ai condriosomi; MORMON (1928) li ritiene affini ad alcuni apparati cellulari (mitocondri, apparato di GOL~I). P]~NSA (1939) ammette come assai probabile che i condriosomi corrispondano ai granuli sarcoplasmatici di HOLMGREN.
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Giacinto Ciaccio- l~icerche sul significato istochimico
Pifi di recente altri AA. (DEJKUN, WEED, FEYEb, ])'ANCONA e FosI, ROJAS e RESTA) si sono occupati del condrioma nella libra muscolare striata. DEJKU~ (1930) ha studiato le modificazioni del condrioma nelle fibre in sarcolisi di girini di Rana in metamorfosi. WEED (1936) esamina il condrioma delle fibre muscolari di pollo durante lo sviluppo embrionale. ~FEYEL (1937) descrive condrioconti fra le fibrille e ai poli dei nuclei. D'ANcoNA e FosI (1938) in ricerche sull'istogenesi della libra muscolare striata di Artropodi e di Vertebrati non accettano la tesi di MEVES e DUESBERG dell'origine diretta morfologica delle miofibrille dai mitoeondri, ma ammettono la partecipazione dei materiali condriosomici alla formazione delle miofibrille. Quanto ai rapporti fra mitocondri e granuli J sono assai interessanti alcuni preparati di fibre in sviluppo di nilffe di Lina populi: in queste fibre D'A~coNA e FosI hanno osservato mitocondri distribuiti senza ordine aecanto a granuli sicuramente interpretabili come granuli J. Sono ancora da ricordare le rieerche di HOSSELET (1931) e di (]ALIA~O (1934) eseguite con metodi d'impregnazione argentica. GALIA~O (1934) ha preso in considerazione helle fibre scheletriehe di rana i rapporti che interferiscono fra le formazioni condriosomiche e le granulazioni grasse; HOSSELET (1931) si oeeupa delle modificazioni del condrioma dei muscoli scheletrici ed alari di Insetti (Culieidi e Friganidi) durante la ninfosi. Questo A. applica sia la tecnica dei co]ori vitali che quella dell'impregnazione argentica. Con quest'ultima metodica ottiene immagini strutturali assai caratteristiche, che interpreta come formazioni mitocondriali; perb l'esame delle figure permettono di rilevare con tutta evidenza che le immagini descritte da HOSSELET hanno una spiccata somig]ianza con quelle ehe generalmente vengono interpretate come apparato reticolare interno di GoLGI. Questo apparato g stato pure esso oggetto di numerose ricerche: CAJAL (1890) con la reazione hera di GoLGI descrive helle fibre muscolari degli Insetti un sistema di reticoli completamente indipendente dal reticolo impregnabile con il cloruro d'oro. I reticoli argentofili sono situati nel sarcoplasma e sono in intima connessione con le ramificazioni terminali delle trachee, dalle quali prenderebbero origine. FUSARI (1895) helle fibre muscolari della lingua di Mammiferi, in quelle dei muscoli volontari di Anfib~, Uccelli, Mammiferi. e nelle fibre scheletriche di Insetti rileva diversi sistemi di reticoli impregnabili con l'argento: uno ~ situato nel piano della stria di Amici, gli altri sono al limite del disco monorifrangente (J) con quello birifrangente (Q). VE~ATTI (1902) con la reazione hera di GOLGI dimostra nelle fibre di Vertebrati e di Artropodi diversi reticoli; i pig eostanti sono situati fra lo strato birifrangente (Q) e quello monorifrangente (J). Quanto all'opinione di CAJ.~, secondo il quale negli Insetti i reticoli colorabili con la reazione hera di GOLGI corrispondono ai capillari tracheali, VERATTInon l'accetta,
e funzionale delle granulazioni interfibrillari.
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n~ per i muscoli delle zampe degli Insetti, n~ per quelli delle ali. Nei muscoli alari dell' Hydrophilus piceus rileva infatti ehe, oltre alle diramazioni tracheali, restano bene impregnate sottili fibrille decorrenti nel sarcoplasma. A proposito dei sarcosomi di RETZIUS,ritiene che questi e i reticoli impregnabili con la reazione nera siano due modi di presentarsi di una stessa formazione: i sarcosomi sarebbero parti alterate o non colorate dell'apparato reticolare delle fibre muscolari; VERATTI, pure segnalando l'analogia di questa formazione con gli apparati reticolari di GOLGI degli altri tessuti, non crede di poterne affermare l'identits MARTI~OT'rI (1904) nei Mammiferi e SANCHEZ (1907) nei Crostacei confermano le descrizioni dei reticoli di CAJAL, FUSARI e VERATTI. HOLMGREN (1907--1913) negli Artropodi e nei Vertebrati con la reazione nera di GOLCI ottiene immagini simili a quelle di CAJAL e di VERATTI, le riferisce per6 ad un particolare apparato canalicolare (trofospongio). Ai granuli interfibrillari (Q, J) attribuisce il significato di organelli cellulari; ne segnala i cambiamenti durante i vari stadi funzion a l i e ammette la possibflitk del passaggio di sostanze fra essi e le miofibrille. HIRSCHLER (1910) sottopone all'impregnazione argentica le fibre museolari di Artropodi (Insetti e Crostacei), di Cordati (Anfiosso) e di Vertebrati (Pesci, Anfibl e Mammiferi). Rfleva che le reti del trofospongio corrispondono alle membrane Z nelle fibre dei museoli delle ali degli Insetti, in quelle scheletriche di Astacus e in quelle cardiache dei Vertebrati, mentre nei muscoli scheletrici dei Vertebrati e degli Insetti corrispondono rispettivamente ai sarcosomi e ai granuli J. Lu~A (1911) nelle fibre cardiache dei Vertebrati con la reazione nera di GOLGI osserva nella massa protoplasmatica perinucleare granulazioni, bastoncini e reticoli colorati elettivamente. BOWE~ (1926), nelle fibre striate della ghiandola di COWPER del gatto, impregnate secondo la technica di KOLATSCHEVmodificata da NASSONOV, dimostra un sistema di fini reticoli longitudinali e trasversali formati dal sarcoplasma interfibrillare; essi corrisponderebbero ai reticoli di CAJ~-FusARI e rappresenterebbero l'apparato reticolare interno di GOLCL MONTALENTI (1926) in uno studio sulle terminazioni delle trachee e dei nervi nelle fibre muscolari degli Artropodi ottiene, con la reazione nera di GOLGI, preparati simili a quelli di VERATTI e degli altri AA. ; ammette perci6 che, oltre alle terminazioni delle trachee, sia possibile dimostrare il reticolo colorabile con la reazione di GOLGI. BEAMS (1929) per le fibre dell'intestino di Blaps, MACDOUGALD(1935) per le fibre del cuore di pollo, WEED (1936) per quelle dei muscoli embrionali di pollo ritengono che i quadri strutturali simili a quelli descritti da CAJAL, FUSARI e VERATTI non rappresentino l'apparato di GOLGI Questo sarebbe rappresentato invece dalle granulazioni argentofile peri. nucleari. Oltre a queste, BEAMS e M.ACDOUGALDhanno rilevato granul.
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Giaeinto Ciaceio: Rieerehe sul signifieato istochimieo
argentofili interfibrillari; BEAMS li considera simili ai granuli Q di HOLMGRE~ e JORDAN, e MACDOUGALD aeeetta questa stessa interpretazione. Perb l'esame delle figure delle memorie di BEAMS e di MACDOUGALD permette di ritenere ehe i granuli argentofili interfibrillari corrispondano ai granuli J. EASTLICK (1937) nelle fibre scheletriehe e eardiache di Vertebrati descrive tanto le granulazioni argentofile perinueleari quanto i retieoli di CAJAL-FUSARI. Questi restano inalterati dopo il trattamento con i solventi dei grassi, mentre con 1o stesso trattamento vengono ad alterarsi o a scomparire le granulazioni perinueleari. Ci6 induce EASTLICK a ritenere ehe solo le granulazioni perinueleari rappresentino l'apparato di GOLGI, il quale, per essere costituito da sostanze lipoproteiehe, alterato dai solventi dei grassi. ADELHELM (1938) nelle fibre museolari di ratto sottoposte all'esaurimento da fatiea osserva modificazioni dell'apparato di GOLGI; in aeeordo a quanto ha affermato MACDOUGALD, ritiene ebe quest'apparato sia loealizzato helle zone sarcoplasmatiche iustanueleari. ROJAS e RESTA (1938) con la tecnica di KOLATSCHEV-NASSOSTOV rilevano che l'apparato di GoLr nelle fibre di Bu/o arenarum ~ rappresentato da corpuscoli disposti ai poll del nucleo. Durante la ~_timolazione delle fibre si determina la frammentazione dei corpuscoli stessi; questi, in seguito, si ricostituiseono riprendendo la forma e la posizione che hanno nelle fibre in riposo. LORETI1 (1940) colora con colori vitali (bleu di metilene, violetto dahlia) i granuli interfibrillari(Q edJ). Li dimostra anche con l'impregnazione argentica; usa a tale scopo il metodo all'argento ammoniacale secondo la tecnica di ])EL RIO-HORTEGA, facendo precedere l'impregnazione metallica dalla fissazione in formolo od in alcool tannico. I granuli J delle fibre sottoposte a questi procedimenti sono spiccatamente argentofili. I granuli J sono pure fortemente siderofili come risulta da preparati fissati con le miscele di REGAUD e di MAXlMow-LFvI. Particolare rflievo meritano le rieerche di HERINGA (1930) e di BOEKE (1934--1935), che hello studio delle terminazioni nervose dei muscoli prendono in esame i rapporti intercorrenti fra le fibrille delle reti periterminali di BOEKE e il sarcoplasma: le fibrille stesse e il sarcoplasma costituirebbero l'anello di congiunzione fra la fibra nervosa e quella muscolare. Tanto le fibrille nervose quanto i granuli sarcoplasmatiei sono argentofili; ci6 sta a dimostrare l'esistenza di proeessi ossidoriduttori. Da ultimo ricorderb le ricerche di BOURNE (1935); questi rivolge la sua attenzione alia dimostrazione della Vitamina C. Nelle fibre cardiaehe di volpe rileva granulazioni argentofile distribuite senza ordine, mentre 1 LORETIhelle fibre striate degli Artropodi descrive, oltre ai granuli Q ed J, i granuli Z: questi parteciperebbero alla costituzione della linea Z.
e funzionale delle granulazioni interfibrillari.
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in quelle sche|etriche le granulazioni argentofile sono distribuite con regolarit~ fra le fibrille ; l'esame delle figure di BOURNE fa supporre che i granuli argentofili osservati nelle fibre scheletriche corrispondano ai granuli interfibrillari J. Materiale e Metodo. Per le presenti ricerche fu utilizzato materiale di Artropodi e di Vertebrati. Fra gli Artropodi ho preso in esame i muscoli delle chele di Carcinus maenas, i muscoli dei segmenti addominali di larve di Tenebrio molitor e quelli delle zampe di GryUotalpa vulgaris e di Cybister Roeselii; ho esaminato inoltre i muscoli alari di Cybister Roeselii. Fra i Vertebrati ho prescelto materiale di Anfibi Urodeli (giovani esemplari di Amblystoma mexicanum, di Ucce]li (Columba livia) e di Mammiferi [Cavia cobaya, Myotis mystacinus LEIST (?)]. Ho preso in esame i muscoli degli arti (muscoli bianchi) e i muscoli pettorali, intercostali, diaframmatici (muscoli rossi). Ho utilizzato le seguenti soluzioni argentiche: 1. Liquido di Fontana preparato secondo le indicazioni di LIso~ per la reazione argentaffine; 2. soluzione di nitrato d'argento al 10% ; 3. liquido di GmOtTD e LEBLO~D (nitrato d'argento acido) per la ricerca della vitamina C. In tutti e tre i casi ho fatto seguire al bagno argentico quello in cloruro d'oro al 1/500; da questa soluzione i pezzetti di muscolo venivano passati nella soluzione di iposolfito al 5 %. Dopo i passaggi nella serie degli alcooli e i l rischiaramento in una soluzione di acido fenico, creosoto di faggio e xilolo, ho dissociato le fibre con aghi ed ho allestito preparati permanenti montati in balsamo del Canads Alcune preparazioni sono state eseguite alia luce, altre all'oscuritg. Le fibre muscolari sono state immerse nelle soluzioni argentiche subito dopo il prelevamento dag]i esemplari. I muscoli delle zampe di Gryllotalpa vulgaris e di Cybister Roeselii sono state conservate nelle soluzioni argentiche per un tempo variabile fra 24 e 48 h; per un tempo uguale sono stati tratta.ti i muscoli dei segmenti addominali di Tenebrio molitor; i muscoli alari di Cybister Roeselii invece sono stati sottoposti all'impregnazione argentica per pifi giorni. I muscoli delle chele di Carcinus maenas sono rimasti alcuni giorni (3--5) nel bagno argentico, mentre i muscoli dei Vertebrati vi sono rimasti sempre per parecchi giorni. Allo scopo di raffrontare le immagini ottenute mediante il trattamento diretto con le tre soluzioni argentiche sopraricordate con quelle dei metodi pifi comunemente usati nella tecnica istologica, ho eseguito alcuni preparati di larve di Tenebrio molitor con fl metodo al carbonato d'argento di DEL RIo-HoRTEGA.
Esposizione dei risultati. Tanto nei muscoli di Vertebrati quanto in quelli di Artropodi ho ottenuto preparati dimostranti l'impregnazione elettiva dei granuli Z . f. Z e l l f o r s c h u n ~ . A b t . A .
31. B d .
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Giacinto Ciaccio: Ricerche sul significato istochimico
F i g . 1. C a r c i n u s m a e n a s . F i b r e d c i m u s . r delle c h e l e . A p p a i o n o i n m o d o e v i dentc i granuli ifiterfibrillari J elettiva mente impregnati; helle miofibrille non si d i s t i n g u o n o t r a t t i i m p r e g n a t i dall'argento. Le fasce trasversali scure souo date dai granuli non a fuoco. Argentaffine. 1000 •
interfibrillari, mentre gli altri costituenti della fibra non hanno subito l'impregnazione metallica. La reazione non b sempre costante : in uno stesso preparato si osservano infatti fibre elettivamente impregnate ed altre che non hanno reagito con l'argento. I n altri casi inveee si hanno impregnazioni massive che mascherano t u t t a la fibra. I n particolare, ci5 accade con maggior facilit~ nei muscoli di C a r c i n u s m a e n a s , nei quali, trattandosi di materiale marino, l'argento viene precipitato dai sali in soluzione nei liquidi che imbevono i tessuti. /1 materiale che mi ha offerto i quadri pifl tipici b stato quello dei Crostaeei e degli Insetti. U n a reazione assai netta ~ dimost r a t a dai preparati dei museoli delle chele di C a r c i n u s m a e n a s . Le duplici regolari serie di granuli intelfibrillari elettivamente impregnate risaltano nel
F i g . 2. L a r v a d i Tenebrio molitor. F i b r e d e i m u s c o l i a d d o m i n a l i . Si n o t a n o 9 h i a r a m e n t c i granuH J che, in qualche tratto, appaiono in duplici serie regolari. Argentaffine. 440• F i g . 3. L a r v a d i Tenebrio molitor. F i b r a d e i m u s c o l i a d d o m i n a l i i n m a g g i o r e s t e n s i o n e d i quelle della figura precedente. Le doppie serie dei granuli appaiono maggiormcnte allargate. Argentaffine. 720 • F i g . 4. L a r v a d i T e n e b r i o molitor. F i b r e dei m u s c o l i a d d o m i n a l i . Si o s s e r v a n o q u a d r i s i m i l i a quelli delle F i g g . 2 e 3; l ' i m p r e g n a z i o n e c o n il n i t r a t o d ' a r g e n t o 6 s t a t a e ] e t t i v a a livello d e i g r a n u l i J . N i t r a t o d ' a r g e n t o 10 %. 720 •
e funzionale delle granulazioni interfibrillari.
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campo del microscopio (Fig. 1); nella miofibrilla non si distinguono tratti che abbiano reagito con l'argento. Pifl estese sono le rieerehe sugli Insetti. Nelle larve di Tenebrio molitor non mi sono limitato allo studio della reazione argentaffine, ma ho anehe eseguito quella di GIROUD e LEBLOND per la vitamina C e la reazione con il nitrato d'argento al 109'o. Sempre nelle stesse larve, per eonfronto con le reazioni istochimiehe, ho allestito preparati con il metodo al earbonato d'argento (li DEL Rw-HORTE(;.~.
F i g . 5. L a r v a d i Yl'enebrio n~olitor. F i b r e d c i n m s c o l i a , h | , m d n a l i . L a riot!tea con il l i q u i d o d i (~II~Ol;I) 12LEHI.QN]) ImP la v i t a l l l i n a (~ 6 s t a t a l m s i t i v a ; si qls~(q'V~lllq) iIlfa t ti e l c t l i v a l n e n l o i l l l l ) l ' e g l l a t i i g l ' a l l l l ] i J . M e t o d o d i (}ll{OUl) t' LI:BLONI), 510 •, F i g . 6. GryllotcHpa ~'~dgari.~. M u s e o l i d e l l e z a m p e . 1 g r a n u l i ,I s o n o e l e t l i v a m e n t e i m p r e g n a t i ed e v i d e n t i . A r g e n t a f f i n c . 7~() x .
La reazione argentaffine 6 stata positiva; ehiare doeumentazioni si hanno helle Figg. 2, 3 ; i granuli interfibrillari, elettivamente impregnati, sono ehiaramente distinguibili dagli altri eostituenti della fibra, the inveee non hanno subito l'impregnazione metalliea. Quadri simili (Fig. l) ho ottenuto dalle fibre trattate con la soluzione di nitrato d'argento al 10% ed esposte alia luee solare durante l'impregnazione. La ricerea con il liquido di GIROUD e LEBLOND ~ stata positiva solo in poehi easi; per ottenere buoni preparati ho prolungato di aleune ore la permanenza delle fibre nel bagno argentico e le ho sottoposte all'azionr della luee solare durante il t r a t t a m e n t o con il liquido di GIROUD e L~rLOSD. I n tal modo mi ~ riuseito di osservare in qualehe f r a m m e n t o di fibra quadri di impregnazione elettiva a livello dei granuli J. (Fig. 5). I preparati allestiti con il metodo al carbonato d'argento di DEL RroHORTEGA dimostrano che in questo caso si impregnano altri costituenti 38*
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Giacinto Ciaccio: Ricerche sul significato istochimico
della fibra oltre i granuli interfibrillari. Infatti risultano chiaramente impregnate anche le miofibrille; l'impregnazione avviene generalmente in tutta la miofibrilla ad eccezione dei tratti prossimi alle linee Z. In questi preparati perb non si tratta di una reazione istochimica; la specificits della reazione viene a mancare per il fatto che al bagno argentico si fa precedere o seguire il trattamento con un agente riduttore che viene portato a contatto con i tessuti. I1 confronto di preparati allestiti con
F i g . 7. Cybister Roeselii. M u s c o l i delle z a m p e . C o m e nel c a s e delle f i b r e dei m u s c o l i delle z a m p e d i Gryllotalpa, a n c h e i n q u e l l e d e i I n u s c o l i delle z a m p e di Cybisteri g r a n u l i J s o n o le sole f o r m a z i o n i i m p r e g n a t e . A r g e n t a f f i n e . 1000 • F i g . 8. Cybister Roeselii. M u s c o l i delle all. S o n o e l e t t i v a m e n t e i m p r c g n a t i i g r a n u l i Q. ) ~ r g e n t a f f i n e . 720 •
questa metodica con quel]i ottenuti con gli altri metodi argentici permette di rflevare che le reazioni specifiche avvengono esclusivamente nei granuli interfibrillari. 01tre che nelle larve di Tenebrio molitor, ho applicato la reazione argentaffine ai muscoli delle zampe di Gryllotalpa vulgaris e di Cybister ttoeselii: anche in queste fibre i reperti sono stati costanti e dimostrativi (Figg. 6, 7). Nel Gryllotalpa ho ottenuto buoni preparati dopo un bagno argentico di 48 h, mentre nei muscoli di Cybister solo dopo parecchi giorni ho osservato ehiare immagini d'impregnazione elettiva. Cosi pure per i muscoli alari di Cybister ho dovuto prolungare di molti giorni la durata della impregnazione per ottenere preparati sicuramente impregnati (Fig. 8). Esaurito cosl lo studio degli Artropodi, ho tratto ampio materiale di documentazione dalle fibre di Vertebrati (Amblystoma mexicanum,
Columba livia, Cavia cobaya, Myotis mystacinus).
e funzionale delle granulazioni interfibrillari.
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Nelle fibre dei muscoli del tronco di giovani larve di Amblystoma mexicanum 1 implegnazione, durata parecchi giorni, ~ stata positiva; le
Fig. 9. G i o v a n e l a r v a di d m b l y s l o m a m e x i canum. Muscoli del dorso. A n c h e in quesii musco]i a p p a i o n o i l n p r e g n a t i elettiva~nente i grauu]i J interfibrillari. A r g e n t a f f i n e . 1000 •
Fig. I0. Columba livia. Muscoli bianchi degli ~rti. Sono assai c h i a r a m e n t e visibili i g r a null J interfibrillari e l e t t i v a m e n t e i m p r e g n a t i . A r g e n t a f f i n c . 1000 >.
Fig. 11, Columba livia. Muscoli p e t t o r a l i . Con n e t t e z z a si disfinguono i g r a n u l i interfibrillari posti a live]lo di Z ed i n t e r p r e t a b i l i c o m e e q u i v a l e n t i ai g r a n u l i J dei muscoli degli A r t r o p o d i e dellc fibre b l a n c h e dei u A r g e n t a f f i n e . 1000 • Fig. 12. M y o t i s m y s l a c i n u s . 1~Iuscoli p e t t o r a l i . Sono e l e t t i v a m e n t e i m p r e g n a t i i g r a n u l i interfibrillari c o r r i s p o n d e n t i ai g r a n u l i Q di THULIN. A r g e n t a f f i n e , 1000 • Fig. 13. M y o t i s m y s l a c i n u s . Muscoli p e t t o r a l i . I n questi sono d i m o s t r a b i l i per l ' e l e t t i v a i m p r e g n a z i o n e t u l l e e d u e i tipi di g r a n u l a z i o n i interstiziali, t a n t o quelle corrispondenti ai g r a n u l i Q di THULIN q u a n t o quelle i n t e r p r e t a b i l i come g r a n u l i J. A r g e n t a f f i n e . 1000 •
fibre mostrano i granuli interfibrillari elettivamente impregnati, in contrapposto agli altri costituenti delia fibra, che invece non hanno reagito co5 l'argento (Fig. 9).
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Giacinto Ciaccio: Ricerche sul significato istochimico
I)agli esemplari di Columba livia ho prelevato fibre dei muscoli pettora|i e dai muscoli degli arti. Nei muscoli degli ~rti (Fig. 10) ho notato quadri simili a quelli degli Artropodi e dell'Amblystoma; come in questi, i granuli interfibrillari spiceano con grande nettezza nell~ fibr~ sotto-
F i g . 14. M y a t i s m y s t a e i ~ u s . 1 ) i a f r a n m m , I n q u e s t c f i b r e , r i e c h c di g r a n u l a z i o n i i n t e r s t i M a l i , si o s s e r v a n o d i s t i n t a m e n t c i g r a m t l i J i n t c r f i b r i l l a r i . A r g c n t a f f i n e . ll)00 ) ,
F i g . 15. ('aria cobaya. 5 [ u s e o l i d c g l i a r t i . Si osscrvano distintamcnte i granuli J elettivallleIltC i n l p r e g n a t i . A r g e n t a f f i n e , 720 •
posta all'impregnazione. Nelle fibre dci muscoli pettorali ho osservato l'impregnazione elettiva di tutte ]e granulazioni interstiziali, tanto di quelle eorrispondenti ai gramdi Q eli T~t~LIN quanto delle altre interpretabili come equivalenti ai granuli J dei muscoli degli Artropodi e degli altri muscoli dei Vertebrati (Fig. 11). Immagini simili si osservano nei muscoli pettorali del pipistrello (Myotis mystacinus) nei quMi sono elettivamente impregnate tutte le granulazioni interstiziali (Figg. 12, 13). Nel pipistrello ho pure esaminato le fibre dei muscoli intercostali e del diaframma; helle fibre di questi muscoli, ricche di gr~nulaFig. 16. Carla cobaya. M u s e o l i intcrcostali. Sono chiaramentc zioni interstiziali, ho ottenuto immagini visibi]i i granuli J intcrfibrillari. assai evidenti dell'impregnazione dei granuli A r g e n t a f f i n t , . 1000 • interfibrillari (Fig. 14). Preparati pure dimostrativi sono stati ottenuti dai muscoli degli arti (Fig. 15), dal retto addominale e dai museoli intercostali (Fig. 16) di Cavia cobaya.
Discussione dci risultati spcrimentali. Come risult~ dalle descrizioni esposte nel precedente capitolo, le soluzioni di nitrato d'argento mettono in evidenza nella fibra muscolare
e funzionale delle granulazioni interfibrillari.
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striata granulazioni che si impregnano elettivamente. Esse eorrispondone ai granuli interfibrillari, che si possono osservare anche helle fibre sopravviventi. Le immagini stxutturali da me deseritte si sovrappongono topograficamente a quelle dimostrate da CAJAL e FUSARI mediante l'impiego della reazione nera di GOLGt e riferite da VERATTI all'apparato retieolare interno. Come ho gig detto, in base ai reperti di VERATTI, MARTI~'OTTI, SAXCHEZ ed altri, si ammise ehe l'apparato di GOLGInella fibra museolare fosse rappresentato dai suddetti retieoli di CAJAL-FuSARI. Questa opinione non ~ per6 eondivisa da BEAMS, MACDOUGALD, YVEED, EASTLICK, _ADELHELM,ROJAS e RESTA; seeondo questi autori i reticoli di CAJAL-FtrsAm non corrispondono all'apparato di GOLOI, che sarebbc invece rappresentato dalle granulazioni argentofile perinucleari. Tanto l'una quanto l'altra di tall interpretazioni sono basate su una concezione esclusivamente morfologiea dell'apparato di GOLGI, concezione che per parecchio tempo ha avuto largo seguito fra gli istologi. In base a tale concezione, l'identificazione di strutture citologiche con il suddetto apparato veniva fatta con criteri basati eselu;~ivanlente su assomiglianzc strutturali. Su tale base non appare per6 possibile risolvere la questione riguardante una formazione a significato essenzialmente istochimico e funzionale. In questo sense infatti ~ indirizzata la corrente degli AA. (PENSA, LEVI, NASSONOV, BOWEN, MORELLE, C. CIACCIO, HIRSCH ecc.) che si occuparono pifi di recente dell'apparato reticolare interne di GOLCI. PENSA (1939) nel sue trattato afferma: <(Come i condriosomi, l'apparate reticolare di GOLGI venne da molti ed 5 tuttora da qualcuno ritenuto generalmente come una entitg morfologica concreta, come un organulo cellulare. Io invece mi formal la convinzione che, anche l'apparato reticolare, come i condriosomi, corrispond'~ ad un particolare atteggiamento di una sostanza gelificata che fa parte della costituzione del citoplasma ~. HIRSCH (1940) fa un'accurata revisione degli aspetti molfologici dell'apparato di GoLGI. Nel corse dei mutamenti morfologici e biochimici di questo apparato distingue alcune fasi caratterizzate da una propria morfologia e da determinati processi biochimici; fra le sostanze che vengono elaborate si trova la vitamina C. Nella cellula, secondo CARMELO CIACCIO, si distinguono due categorie di sostanze lipidiche: i lipidi allo state diffuse (lipidi metabolici) e i lipidi legati alle sostanze citoplasmatiche (istolipidi). A questi ultimi sono dovute le immagini rivelate con i metodi generalmente usati per la dimostrazione dell'apparato reticolare interne. A proposito di questo CARMELOCIACClO(1936)afferma: ((Io credo di dover insistere sul mode enunciate in note precedenti e cio~: che le immagini ottenute col metodi all'argento ed all'osmio sono equivalenti a
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Giacinto Ciaccio: Ricerche sul significato istochimico
quelle ottenute con i proeessi di lipofanerosi e the tali immagini sono variabili a seconda delle condizioni in cui si trovano gli istolipidi dell'ergoplasma e a seconda di condizioni tecniche, e cosi i granuli, le gocciole, i filamenti, i reticoli altro non sarebbero che immagini che seguono allo smescolamento >). Gi5~ in precedenti mie rieerche (1936--1938) ho dimostrato ehe nella fibra museolare striata le sostanze lipidiche sono loealizzate esclusivamente nei granuli interfibrillari: in essi si dimostrano tanto i lipidi allo stato diffuso, quanto gli istolipidi. Quadri strutturali assai simili ho ottenuto nelle presenti rieerche con i metodi d'impregnazione argentica con i quali si mettono in evidenza i granuli interfibrillari. Una siffatta concordanza di reperti viene a confermare per la fibra muscolare l'affermazione di CARMELO CIACCIOsull'identits fra le immagini rilevabili con i metodi della lipofanerosi e quelle ottenute con i metodi in uso per la dimostrazione dell'app~rato reticolare interno di GOLG]. Ci5 permette di supporre che nella fibra muscolare mediante i procedimenti impiegati per la dimostrazione di quest'apparato vengono messi in evidenza gli stessi aggruppamenti di sostanze lipoproteiche dimostrati con ]a metodica della lipofanerosi. Tanto le fibre impregnate con l'argento quanto que]le sottoposte alla ricerca dei lipidi concordano nel dimostrare che i granuli rappresentano il substrato materiale di tutte le sostanze di natura lipidica (lipidi metabolici, istolipidi). Perci5 in essi si possono avere quadri strutt1~rali riferibili tanto all'apparato mitocondriale quanto all'apparato reticolare interno di GOLGI. Come ~ noto, secondo CARMELO CIACCIO e PENSA i lipidi metabolici si dimostrano nei mitocondri, mentre gli istolipidi entrano a fare parte dei complessi citoplasmatici, che con i metodi d'impregnazione argentica, danno luogo alle immagini comprese nell'apparato di GOLGL I granuli interfibrillari debbono quindi essere interpretati come organelli cellulari deputati all'esplicazione di particolari attivits metaboliche. Questo ~ in accordo con i reperti desunti da indagini istochimiche. BOVR~E rileva nei muscoli scheletrici di volpe granuli argentofili interfibrillari che interpreta quali depositari della vitamina C. HERINGA e BOEKE in ricerche sulle terminazioni nervose nei muscoli hanno rilevato l'elettiva impregnazione dei granuli interfibrillari connessi con le terminazioni stesse e l i hanno considerati sede di fenomeni ossido-riduttivi simili a quelli che si svolgono in seno alle fibre nervose. Nello studio dell'azione delle soluzioni argentiche, io mi sono sempre attenuto alia pratica di porle a diretto contatto con fibre appena prelevate dagli esemplari. Cib per impedire che i liquidi fissativi o conservativi determinassero nelle fibre immagini strutturali ehe potessero sovrapporsi a quelle dell'impregnazione argentiea. I miei reperti dimostrano che i reticoli di CAJAL-FUSARI sono esclusivamente dovuti a]l'impregnazione
e funzionale delle granulazioni interfibrillari.
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argentica, che non sono artefatti e che corrispondono ai granuli interfibrillari della fibre striate. Fra le varie soluzioni argentiche da me usate, alcune sono considerate specifiche per la vitamina C, altre per le granulazioni argentaffini. I1 fatto che per tutte io ho ottenuto reperti positivi a carico delle granulazioni interfibrillari, e che queste non hanno dimostrato una specificitk per una piuttosto che per l'altra delle reazioni in questione fa pensare che nelle granulazioni stesse non sia dimostrabile con i metodi usati a]cuna sostanza chimica specifica. Mi sembra invece lecito ammettere che tale elettiva impregnazione sia la dimostrazione di processi ossido-riduttivi in seno alle suddette granulazioni. Questa conclusione non solo permette di confrontare le formazioni granulari della fibra striata con le immagini morfologiche presenti generalmente nelle cellule (apparato mitocondriale e apparato di GOLCI), ma anche di portare un contributo all'interpretazione biochimica di queste stesse formazioni. Essa permette inoltre di dedurre alcune considerazioni a proposito del significato morfologico e biochimico dei costituenti della libra in accordo alle concezioni attualmente accettate. Nella fibra striata, secondo quanto b risultato dall'esame di fibre sopravviventi (D'A~coNA 1930) e di quelle sottoposte all'azione di agenti chimici (G. CTACCm 1935--1938), si debbono riconoscere quali costituenti caratteristici le miofibrille, i granuli interfibrillari e la membrana Z. Quest'ultima ~ un costituente a funzione meccanica di sostegno, mentre le miofibrflle, date da solo materiale proteico (miosina) rappresentano la struttura specifica deputata all'attivit~ contratti]e. Quanto ai granuli interfibrillari, le indagini istochimiche precedentemente svolte (dimostrazione dei carbidrati, lipidie ceneri fosfatiche) mi hanno indotto a ritenere che ad essi debba attribuirsi il significato di sostanze energetiche (G. C~ACClO 1938). Le nuove indagini, esposte nel presente lavoro, mi confermano in questa supposizione. I fenomeni che si verfficano al livello dei granuli sotto l'azione delle impregnazioni argentiche dimostrano che in essi si svolgono fenomeni di ossido-riduzione e ehe essi possono venire riferiti all'apparato di GOLC~, non nel significato esclusivamente morfologico che un tempo veniva assegnato a tale formazione, ma in accordo alla concezione che assegna a questo apparato il significato di una zona morfologicamente e biochimicamente differenziata del citoplasma. Questi reperti morfologici e biochimici ehiariscono il significato funzionale dei granuli di fronte agli altri costituenti della libra. Mentre le miofibri]le rappresentano la sede dell'attivit~ contrattile, i granuli devono essere ritenuti la sede dei materiali energetici e dei processi metabolici inerenti all'attivit~ contrattile. Ci6 sta a dimostrare c h e l a
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Giacinto Ciaccio: Ricerche sul significato istochimico
funzionalith della fibra museolare striata b eondizionata da due eostituenti morfologici distinti: miofibrille e granuli interfibrillari.
Conelusioni. I risultati delle rieerche riferite in questo lavoro possono essere riassunte nelle conclusioni seguenti: 1. I metodi istochimici d'impregnazione argentica helle fibre muscolari di Artropodi e di Vertebrati mettono in evidenza in modo elettivo i granuli interfibrillari (J e Q). 2. Le immagini ottenute con le impregnazioni metalliche corrispondono topograficamente ai reticoli descritti da CAJAI~e da FUSARI e riferite da Veratti all'apparato reticolare interno. Esse sono da interpretarsi, sotto il rispetto biochimico, come espressione di fenomeni di lipofanerosi determinati dall'impregnazione argentica. Questa dimostra a livello dei granuli interfibrillari processi ossido-riduttivi. 3. I reperti biochimici illustrati nel presente lavoro portano nuova documentazione all'interpretazione dei granuli quali sede di materiali energetici (carboidrati, lipidi, eeneri fosfatiche), e dei processi metabolici inerenti alla elaborazione di questi (processi ossido-riduttivi). 4. Nella fibra museulare striata vanno distinti, in rapporto all'attivitb~ speeifiea di questa, sia morfologieamente ehe fisiologieamente, due eostituenti fondamentali: miofibrille e granuli interfibrillari. Alle miofibrille va attribuita l'attivith eontrattile, ai granuli il signifieato di organelli di riserva e di elaborazione delle sostanze neeessarie all'attivitS, eontrattile delle miofibrille.
Zusammenfassung. Auf Grund der ausgefiihrten Forschungen komme ich zu folgenden Ergebnissen : 1. Die histoehemischen Methoden der Silberimpr/~gnation f/irben elektiv die interfibrill/tren K6rnchen (J und Q) der Arthropoden- und Wirbeltier-Muskelfasern. 2. Die durch Metallimpr/ignationen erhaltenen Bilder entspreehen topographisch den yon CAJAL und FusA~I beschriebenen Netzen, welche von VERATTI dem GoLGIschen Binnenapparat zugesehrieben ~orden sind. I n biochemischer Ansicht sind sie als Ausdruck der durch Silberimpregnation hervorgerufenen Lipophaneroseerscheinungen zu betrachten. Eine solche Impr/~gnation zeigt, dab auf der H6he der interfibrill~ren K6rnchen oxydoreduktive Reuktionen ablaufen. 3. Die in dieser Arbeit aufgekl/~rten biochemischen Befunde geben einen weiteren Beweis fiir die Anschauung, dab die K6rnchen Sitz von energetischen Stoffen (Kohlehydrate, Lipide, Phosphataschen) und der zu ihrer Ausarbeitung fiihrenden Stoffweehselvorg~nge (oxydoreduktive Reaktionen) sind.
e funzionale delle granulazioni interfibrillari.
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4. I n b e z u g a u f die s p e z i f i s c h e T ~ t i g k e i t d e r q u e r g e s t r e i f t e n M u s k e l f a s e r n s i n d i n d i e s e n s o w o h l p h y s i o l o g i s c h als a u c h m o r p h o l o g i s c h h a u p t si~chlich zwei v e r s c h i e d e n e B e s t a n d t e i l e z u u n t e r s c h e i d e n : M y o f i b r i l l e n u n d i n t e r f i b r i l l ~ r e K S r n c h e n . D e n M y o f i b r i l l e n i s t die K o n t r a k t i l i t s z u z u s c h r e i b e n , die K S r n c h e n d a g e g e n s i n d als S i t z d e r E r s a t z m a t e r i a l i e n u n d d e r B e a r b e i t u n g d e r fiir die M y o f i b r i l l e n k o n t r a k t i l i t i ~ t n S t i g e n S t o f f e zu betrachtem
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