Oeskoslovensk5 MI

K RO BIO

LO

reSni~ 2. ( 1 9 5 7 ) ~

GI

E

~. 2

Sporulace bacilfi. IV. Ovlivn~ni tvorby spot Bacillus megatherium cysteinem a cystinem VLADIM~R V I N T E R Mikrobiologick~ odd~lenl, Biotogiek~ dstav, ~eskoslovensk~ akademie v~d, P r a h a ~editel fistavu akademik I v a n M~lek Do$lo 22. lO. 1956

Jednim z procesfi, charakteristick:~ch pro sporulaci bacilfi, je p~evod v~pniku z prost~'edl do bun~k. V minul6 prs jsme uks ~e sni~eni obsahu vs v mediu p~i sporulaci mikroorganismu Bacillus megatherium mfi~e b:~t pHSinou labilisace proteolytick~ch enzymfi, vylouSen:~ch do prost~edl b6hem mno~enl a vy~adujicich pro svou stabilitu vs (Vinter 1956b). Zjistili jsme tak6, ~e p~ids cys~einu p~ed sporulaci do kultury Bacillus megatherium zabrs poklesu proteolytick6 aktivity media (Vinter 1956a). Je zns ~e cystein aktivuje ~adu protes Zjistili jsme v~ak, ~e v naw p~ipad6 pfisobi nikoliv na protes media, ale na samotn~ mechanismus tvorby spor, co~ se projevuje jednak z~eteln:~mi zm6nami morfologick:~mi, jednak biochemick~mi. Stejn~ pfisobi i cystin. V t~to pr~ci popisujeme ovlivri6ni morfologie tvorby spor a p~evodu v~pniku do sporulujiclch bun~k Bacillus megatherium cystinem a cysteinem. Materidl a metody Pou~.fli jsme k m e n u Bacillus megatherium ze sblrek Biologick@ho d s t a v u ~SAV. Zpfisob oSkov•ni, kultivace a stanovenl procenta spor v kultu~e byly tyt$~ jako v minul6 pr~ci (Vinter 1955), podobn@ i stanovenl proteolytick6 aktivi W media a stupn@ z~kalu kultury (Slavlk a Smetana 1952, Vinter 1956a) a zpflsob barveni spor (Vinter 1956b). Teplota kultivace byla 29 ~ Tvorbu spor jsme pozorovali mikroskopem s f~zov:~m kontrastem. ~ivn~ pfida byla v pokusu, v n~m~ jsme sledovali proteolytiekou a k t i v i t u media, obohaeena p~idavkem 2 mg, u ostatnlch pokus5 4 m g vhpnlku v podob@ chloridu v~penat@he n a 1 litr pfidy. Obsah vhpnlku v bufikheh jsme stanovfli spektr~lni analysou plamenov:~m fotom e t r e m po mineralisael promyt6ho sedimentu. Roztoky eystinu a cysteinu jsme p~ipravovali tak, ~ie jsme rozpustili v 1 N-HC1 takov~ mno~stvl ~ e h t o aminokyselin, abychom doshhli koncentrace 1 . 10-.~ M. Roztoky jsme neutralisovali n a p H 7,0 a sterilisovali b u d filtracl nebo autoklhvovhnlm. Zjistili jsme, ~e v obou p~ipadech sterilisaee vykazo~aly roztoky stejn:~ dSinek n a t v o r b u spor. Ve vheeh pHpadeeh jsme p~id~vali do kultury (k 90 ml media) 10 ml roztoku aminokyseliny, tak~ie v~sledng~ koneentraee cysteinu nebo eystinu v kultu~e byla v~dy 1 . 10- aM.

V~sledky Morfologie tvorby spor u kultury Bacillus megatherium ovlivn~n~ cystehmm nebo cystinem Norms tvorba spor u naw kmene Bacillus megatherium problh~ na pfid~ s kaseinov~m hydrolyss tak, ~e mezi 131~. a~ 14~. hodinou se v protoplasm~ 80

bungk objevujl na jednom konci svitiv~jhi mista velikosti spory (praespory). PN pozorovs fs kontrastem se praespory jevi jako tmav~i, nejasng ohrani~ens mlsta protoplasmy. Praespory rychle nabj~vaji sv~tlolomnosti a vytvs se mladg spory, mlrn~ prota~end, dlouh~ asi jednu t~etinu ddlky mate~sk6 bufiky, silng ls jlci sv~tlo a z~eteln~ ohraniSend vfiSi okolnl protoplasm5 bufiky. Tyro mlad~ spory se je~t~ nebarvl typicky pN pou~itl metod pro barvenl spor, tuto vlastnost zlsk~vaji teprve po dal~ich hodinhch kultivace, poSinaje asi 18. hodinou. Cel:~ proces tvorby mlad~ch spor trvs pNbli~ng dv~ a~ tN hodiny. PNd~nl cysteinu nebo cystinu do ~ivn~ pfidy p~i oSkovs neovlivnl ani dglku lag-fs ani rychlost mno~enl bunSk. Mno~stvi bun~k v kultu~e po dokonSenl mno~enl je p~ibli~n6 stejnd jako u kontrolni kultury. K tvorb'~ spor dochs o n~co pozdgji a proces probihs pomaleji. ~ s t vytvo~enj~ch spor je kulatgjN. Jestli~e pNds cystin nebo cystein v kteroukoliv hodinu kultivace a~ do 10. hodiny, kdy u~ konN rfist kultury, obdr~ime stejnd v)Tsledky. Po pi'id~nl tSchto aminokyselin do kultury starg 11 hodin naru~ime u ~ s t i bunSk sporulaSnl schopnost. V kultu~e se vy~vs vice kulat~jw spor a 5~st bun~k ustrne ve sv6m v~voji ve stadiu praespor. PNds cystinu nebo eysteinu do kultury star6 12 hodin naru~i proces tvorby spor praktieky u vw bun~k. Kultura v t6to dob~ u~ nenl sehopna obnovit mno~enl po pHds ~ivin v poSs koncentraci do prost~edl (Vinter 1956c). Vlivem uveden!~ch aminokyselin se opo~ffuje zaSs tvorby spor p~ibli~n~ o 2--4 hodiny. Po tdto dob~ se zaNnaji zvolna vytvh~et praespory, kter~ po dal~ich hodins kultivace (poSinaje asi 20. hodinou) p~echs v dtvary t6mg~ podobn~ mlad3~m spors liw se vw od nich nejen men~i sv~tlolomnostl a kulat~j~im tvarem, ale p~edev~im neostrou ohrani~ennostl spor vfiSi cytoplasm5 mate~sk~ bufiky. Tyto fitvary jsme pro zjednodu~eni dal~ieh popisfi prfib~hu sporulace oznaNli jako ,,defektnl spory". Tyto ,,defektni T a b . 1. Mno~stvi a charakteristika spor vytvo~en:~ch do 24. hodiny kultivace v kultu~e ovlivn6n6 cystinem. SthH k u l t u r y v okam~.iku pNdhnl Cystinu v hod. 9 10 11 12 13 Kontrola bez c y s t i n u

Procento spor v kultu~e

87,9 85,0 76,6 52,5 20,8 88,1

Charakteristika spor

Normhlni spory, 6asto kulat~jN Norm~lnl spory, 6asto kulat6j~i ,,Defektnl spory", vzhcn6 norms Praespory a ,,defektni s p o r y " Praespory a ,,defektni s p o r y " Norm~lni spory

spory

spory" se barvi stein5 jako mlad6 spory a jsou v~tw kulat~j~i. Zatim co norms spory jsou pN pozorov~nl fs kontrastem svgtld a mail fizky~ tmavj~ okraj, maji ,,defektnl spory" svgti~ st~ed z~eteln6 men~i, tmavj~ okraj neostr~" a jsou men~i (obr. 1--3). Jestli~e pHds cystein nebo eystin do kultury starN, dojde k silngmu naru~enl tvorby spor, a to tak, ~e Nm pozdgji byly uveden6 aminokyseliny do kultury p~ed sporulaci pNd~ny, tim siln~ji byla sporulaee naru~ena. PNds cystinu nebo cysteinu zastihuje bufiky na rflzn6m stupni p~edsporula6nlho vj~voje, proto i ovlivn~nl tvorby spor problh~ u bun~k rfizn~. Za n~kolik hodin po p~ids t~ehto aminokyseiin obsahuje kultura sm~s bun~k s praesporami, ,,defektnimi sporami" i norms sporami. P~i zji~ov~nl procenta t6ehto fitvarfi jsme poNtali v~dy jejieh eelkov6 mno~stvl. 81

Jako pHklad uv&dlme v tabulce l mno~stvi vytvo[en3~eh spor do 24. hodiny kultivace u kultur, k nim~ byl p~ids cystin v rfiznou dobu pged vytvs spor. U norm&ln5 vysporulovan4 kultury dochs b~hem dal~ieh 10--20 hodin k pozvoln4 autolyse bun~k, kter4 obsahuji sporu; doeh&zl k uvolfiovs spor do prostgedl. Voln4 spory na~eho kmene Bac. megatherium siln~ ls sv~%lo a ]sou mirn~ prota~en4 (obr. 4). V kultu[e ovlivn~n4 cysteinem nebo cystinem nast&v& autolysa bun~k, obsahujlcich ,,defektni spory" a~ spory zna6n~ pozd~ji. Do t4 doby autolysuje obvykle jen 6&st bun~k, ve kter3~ch se spory netvo~fly vfibec. Spory vznikajlci v prfib~hu cystinov4 a cysteinov4 inhibiee zachov&vaji p~i zr&nl i po uvoln~nl ze sporangil svfi] kulat~j~i tvar a jsou men~i (obr. 5 a 6). Jsou t4m~[ norm~ln~ sv~tlolomn6 a barvl se podobn~ jako zral4 spory. do sporulujiclch bun6k Bacillus megatherium cystinem a cysteinem

Ovlivn6nl pgevodu vs

Pf'i pokusech, v nich~ jsme zji~ovali krom6 procenta spor v kultuge a obsahu v&pnlku v bufik&ch t4~ proteolytickou aktivitu media, jsme jako ovlivfiujlci amino: kyseliny pou~ili cysteinu. 20

2,30

~,25 15 I /00

~,20 [80 I0

60

),15

4'00,10 20 '

9

.

,m

,

13

15

17

19

9

21

9

23

::

9

38

::

),05

9

62

O b r . 7. V l i v c y s v e i n u n a t v o r b u s p o r a p ~ e v o d v h p n i k u d o b u n 6 k p ~ i d a n 6 h o d o k u / ~ u r y Bac. megatherium p~d s p o r u l a c i ( v 131/2. h o d i n ~ k u l f i i v a c e . ) O s a x : sfl~%H ktflfiury v hodim%ch, o s a y : v l e v o -po6efi m g k a s e i n u n a t r ~ v e n 6 h o z a 30 m i n u t , v p r a v o - - o b s a h v & p n i k u v b u h k & c h , u v n i t ~ g r a f u - procento spor v kultu~e. -- K~ivka 1 - prof. aktivlta u kontrolnl kultury, k~ivka 2 - tvorba spor u k o n t r o l n l k u l t u r y , k ~ i v k a 3 - o b s a h C a v bufik~%ch v p r o c e n t e c h v & h y s u ~ i n y u k o n t r o l n l k u l t u r y , k ~ i v k a 4 - profi, a k t i v i t a u k u l t u r y s c y s t e i n e m , k H v k a 5 - t v o r b a s p o t u k u l t u r y s c y s t e i h e m , k ~ i v k a 6 - o b s a h Ca v b u h k & c h u k u l t u r y s c y s t e i n e m .

Do ban6k s kulturou Bac. megatherium, starou 131/2 hodin, jsme p~idali cystein do koneSn4 koncentrace 1.10 -4 M. Do kontrolnl kultury jsme p~idali stein6 mno~stvl fysiologick~ho roztoku. PoSinaje 13 89 hodinou kultivace zji~s jsme ka~d4 t~i hodiny a~ do 22 89 hodiny procento spor v kultu~e, proteolytickou aktivitu media a obsah vs v bufks Tyto analysy jsme provedli i v 38. a 62. hodin~ kultivace.

82

U kontrolnich ban~k s fysiologick~m roztokem do~lo mezi 131~. a 161~. hodinou k norms sporulaci a k obvykl6mu p~eehodu v~pniku z media do bun@, spojendmu s poklesem proteolytickd aktivity media. U kultury, do kterd jsme p~idali cystein, probih& proces tvorby spor, jak je uvedeno v3;~e. ,,Defektni spory" se objevuji v kultu~e teprve od 22~. hodiny a jejich mno~stvi zfists a~ do 62. hodiny kuttivace stejnd, p~i 5em~ nep~evy~uje hodnoty kolem 70 %. Obsah vs v bufik~ch se nezv:~i ani po vytvo~eni ,,defektnich spor". Teprve po delhi dob~ kultivace p~eehs vs do 5s bunSk, kterd jsou ve sv6m v:@oji z~ejm5 nejds

q25

0,2o

0,15

0,10

o,os

94

B

3

6

12

Obr. 8. Vliv c y s t i n u p~idan6ho b~hem l~g-f&ze a b~hem logaritmick6 f~ze n~ t v o r b u spor a p~evodvs do bun6k. Osa x: s t ~ i k u l t u r y v dob~ p~id~n[ cystinu, os~ y: o b s a h v ~ p n i k u v bufik~ch v procentech v&hy su~iny, zji~t~np 24. h o d i n u kultivace. -- K o n t r o l y : A - s fysiologiek~m roztokem, B - cystin p~id~n p~i o6kov~nL

4

5

6

?

o~

9

I0

It

12

13

Obr. 9. Vliv cystinu p~idan~ho do ~ivn6 pfldy p~ed o6kov&nim (kone6n& k o n e e n t r a c e 1 . 1 0 - 4 M ) n a rflst k u l t u r y Bac. megatherium. Osa x: styli kult u r y v hodin~ch, osa y: s t u p e ~ z~kalu k u l t u r y , vyj&d~en:~ v h o d n o t s optick6 d e n s i t y • 10. K~ivka 1 -- k u l t u r a s cystinem, 2 -- k o n t r o l $ s fysiologick:~m roztokem.

Proteolyticks aktivita media se v prvnlch hodin{Lch po p~id~nl eysteinu pon~kud sni~I, pozd~ji zfist&vs prakticky nezm~n~na. Po n~kolika desltks hodin dalai kultivace, kdy ~s vs p~ech~zl z media do bun~k s ,,defektnlmi sporami", dochs t~, k denaturaci ~s protes a proteolytick~ aktivita media se pon~kud sni~,i. V:~sledky jednoho z t~chto pokus5 jsou vyjs na obr. 7. Zjistfli jsme, ~e stejn:~ d~inek na tvorbu spor a zapojovs vs do bun~k jako eystein ms i cystin (Vinter 1956c). Ob~ aminokyseliny ovlivfiuji tvorbu spor a p~evod vs do media i v prost~edi s nadbytkem vs (tab. 2). V dalw pokuseeh jsme pou~ili jako ovlivfiujieiho ~initele cystinu. Sledovali jsme p~edev~im, jak p~ids eystinu do rfizn~ star5 kultury ovlivni zapojov&ni vs do sporulujicich bun~k Bac. megatherium. Cystin jsme p~ids 83

do kultury v koncentraci 1 . 10 -~ IV[ p~i o6kovs v lag-fs a v logaritmick6 fs Po 24. hodin~ jsme stanovili obsah vs v bufiks a procento spor v kultu~e. Ve v~ech uveden~ch p~ipadech do~lo k norm~lnl tvorb~ spor a k p~evodu vs z media do sporulujicich bun~k. Pon~kud vice vs obsahoval sediment bun~k z kultury, do kter~ jsme p~idali cystin v 3. ~ 6. hodin~ kultivace. Tak~ procento spor bylo v t~ehto kulturs o n~co vy~i. V kontrolni kultu~e, do kter~ jsme p~idali eystin a~. p~ed sporulaci (12. hodinu kultivaee), do~lo k obvykldmu naru~eni tvorby spor (vytvo~ilo se pouze kolem 40 % praespor a~ ,,defektnich spor"), spojen~mu 0,30

(],25

0,20

o, ~o

o,o!

A

Obr. 10. Zapojovgml v~pniku do bun~k p~i sporulaci Bac. megatherium po p~id~ni cystinu do rflzn~ star6 kultury. Obsah v~pnlku jsme zjistili 24. hodinu kultivace. Osa x: s t ~ i k u l t u r y v dob~, kdy byl p~ids cystin, osa y: obsah v~pnlku v buffk~ch v procentech v~hy su~iny.

B

2,(,

26

28

30

32

Obr. l l . Odolnost btm~k vfl6i inhibici t v o r b y spor cystinem u kultury vyrostl~ n a pfld~ s cystinem. 0 s a x: styli kultury v okam~iku, k d y byl stanoven obsah vg~pnlku. V p r v n l m sloupci jo v~dy h o d n o t a p~izpflsoben6 kultttry, ve druh~m kul~ury nep~izp~soben~. Osa y: obsah vs v bu/ikg~ch v procentech v~hy su~iny. Kontroly s fysiologick~m roztokem: A - p~izpfisobengL kultura, B - nep~izpflsoben~ kultura.

s omezelfim vstupu vs do bun~k (obr. 8). P~ids cystinu do media p~i oSkovs nem~lo vliv ani na rychlost mno~eni, ani na hodnoty n~rflstu kultury (obr. 9). V dal~ich pokusech jsme p~ids cystin do kultury pozd~ji, po6inaje obdobim ukonSeni vegetativniho mno~.eni. Kdy~ jsme cystin p~idMi 10o ukonSenl rflstu kultury (v 9. a 10. hodin~ kultivace), vytvo~ily se do 24. hodiny norms spory a vs p~e~el do bunSk. Ke zlomu v citlivosti kultury vflSi cystinu dow p~ed 11. hodinou kultivace. 0 d tohoto obdobi naru~ilo p~ids cystinu do kultury siln~ mechanismus tvorby spor i lo~evod vs do sporulujicich bun~k. Hodnoty obsahu v~pniku v bufik~ch, zji~t~n6 ve 24. hodin~ kultivace, jsou uvedeny na obr~zku 10. 84

1)~i dalai prs jsme zjistili, ~e p~izpfisobenl kultury vfl6i cystinu zvy~uje odolnost kultury vfiSi t6to aminokysehn~, p~idan6 znovu p~ed sporulacl. Kultivovali jsme Bac. megatherium jednak v p~itomnosti cystinu (koncentrace 1 . 1 0 -~ M), jednak bez n~ho. Ve 12. hodinu kultivace jsme do obou serii ban~k p~idali cystin ve stejn6 koncentraci, do kon~rolnlch ban~k fysiologick~ roztok. Obsah vs v bufiks procento spor v ktfltu~e jsme stanovfli po6inaje 24. hodinou kultivace ka~d6 dv~ hodiny a~ do 32. hodiny. Tab. 2. Vliv cysteinu a cystinu n a zapojovhni vs do bun~k Bacilus megatherium p~i sporulaci v prost~edl s n a d b y t k e m vKpniku. Obsah vKpniku v bu~kt~ch byl stanoven ve 24, hodini5 kultivace. Pro usnadn6nl popisu s t a v u kultury jsme v tabulce oznaSfli preaspory pismenem 1), ,,defektnl spory" DS a norm~lni spory S. Ve 12. hodin/5 p~idKno do kultury

Obsah vs v bugrk~ch

Fysiologick~ roztok (kontrola) Vhpnik ( 6 . 1 0 -4 M, kontrola) Cystein ( 1 . 1 0 -4 M) Cystein ( 1 . 1 0 -4 M) a v~pnlk ( 6 . 1 0 -4 M) Cystir~ (1. I 0 - 4 M ) Cystin (1 . 10 -4 M) a v h p n l k (6. 10 -~ M)

Procento spor v kultu~9

0,263 0,271 0,035 0,041 0,062 0,064

84,5 87,3 56,2 43,6 38,5 59,6

S S P-DS P-DS P-DS P-DS

Tab. 3. Zvrat cystinov6 inhibice t v o r b y spor Bacillus megatherium n a d b y t k e m glukosy. Pro popis s t a v u kultury jsme pou~fli stejn6ho oznaSenl jako,v tabulce 2. Ve 12. hodinti p~idKno do kultury

Obsah vs v bufik~ch

Fysiologick:~ roztok (kontrola) Glukosa (kontrola) 5 . 1O-~ iVl Glukosa (kontrola) 5 . 1 0 - a M Cystia ( 1 . 1 0 -4 M) Cystin a glukosa ( 5 . 1 0 - a M) Cystin a glukosa ( 5 . 1 0 - a M)

~Procento spor v kultu~e

0,243 0,236 0,248 0,029 0,031 0,173

88,4 84,9 87,6 41,3 49,7 83,9

S S S P-DS P-DS DS-S

Tab. 4. Vliv pHd~ni sirnlku sodn6ho (koneSns koncentrace 1 . 1 0 - 4 M ) do rfizn6 star6 kul$mT n a zapojovKnl v~pniku do sporulujicich bun6k Bacillus megatherium. Popis s t a v u kultury je stejn:~ jako v tab. 2. Obsah vKprdku v buhkg~ch byl stanoven 24. hodinu kultivace. Stg~i kultury v okam~,iku pHd~ni sirniku v hod. 10 11 12 13 Fysiologick:~ roztok (kontrola)

Obsah v{rprdku v bufrkhch 24. hodinu kultivace 0,232 0,241 0,176 0,085 0,237

Procento spor v kultu~e 24. hodinu kultivace 69,4 72,1 66,2 63,7 86,9

kulat~jw kulat~jw DS-S P-I)S S

S S

U kontrol do$1o k norms sporulaci a k p~evodu v~pniku do bun~k. U kultury vyrostld za p~itomnosti cystinu prob~hla i po opStovn6m p~id~nl cystinu sporulace normMn~ a bufiky zapojfly do sv6 struktury obvykl6 mno~stvi vs U kultury 85

vyrostl~ v mediu bez cystinu do~lo po p~ids tdto ls p~ed sporulaci k obvykldmu naru~eni tvorby spor (v kultu~e se nevytvo~flo vice ne~ 50 % praespor a~ ,,defektnich spor") a mno~stvi vs v bufiks zfistalo nizk~. V~sledky pokusfi jsou uvedeny na obr~zku 11. Siln:~ nadbytek glukosy, p~idan:~ souSasn~ s cystinem, sni~uje inhibiSni fiSinek t~to aminokyseliny na tvorbu spor. Do kultury Bac. megatherium jsme p~ed sporulaci (12. hodinu kultivace) p~idali jednak samotn~ cystin (1 . 10 -4 M), jednak cystin s nadbytkem glukosy (50.10 -4 M a 5 . 1 0 -4 M). Do kontrolnich ban~k jsme p~idali glukosu a fysiologick~ roztok. Ve 24. hodin~ kultivace jsme mikroskopicky zjistili stay kultury a v bufiks stanovili obsah vhpnlku. V kontrolnich bafiks dow jak po p~ids glukosy, tak fysiologick~ho roztoku k norms sporulaci a k zapojeni vs do bun~k. V kultu~e, kam jsme p~idali eystin samotn~ nebo s mal:~m nadbytkem glukosy ( 5 . 1 0 -4 M), do~lo k shodn~mu naru~eni tvorby spor a obsah vs v bufiks zfistal nlzk:~. V kultu~e, kam byl~ souSasn~ s cystinem p~ids glukosa ve znaSn4m nadbytku (50.10 -4 M), se vytvo~fla sm~s spor a ,,defektnlch spor", p~i 5em~ spor bylo,asi dv~ t~etiny z celkovdho poStu. Tal~e obsah vs v bufiks byl podstatn~ v y ~ . Sting nadbytek glukosy p~idan~ spolu s cystinem tedy znaSn~ omezil inhibici tvorby spot touto aminokyselinou. V:~sledky jsou uvedeny v tabulce 3. P~i sledovs ots specificity fiSinku cysteinu a cystinu na tvorbu spor jsme zji~ovali t ~ vliv mnoha jin:~ch ls Vyzkouw jsme n~kter~ aminokyseliny (alanin, methionin, glutamovou kyselinu), glutathion a thioglykols ~s163 z t~chto ]s p~idan:~ch p~ed sporulacl do kultury, neovlivnl tento proces. Sporulaci neovlivnfly ani anorganick~ slouSeniny siry jako siran sodn:~, sirnatan sodn:~ a si~i5itan sodn)~. Pouze po p~id~ni sirniku sodn~ho v koncentraci 1 . 10-4 M do kultury p~ed sporulaci dochs k podobn~mu naru~eni tvorby spor jako p~i pou~iti cystinu. V tabulee 4 jsou uvedeny hodnoty vs a procenta spor ve 24. hodin~ kultivaee u kultury, do kter~ byl p~ids sirnik sodn:~ v rfiznou dobu p~ed sporulaci. Nejvice je ovlivn~na kultura, do nil byl p~ids sirnik p~ed samotnou tvorbou spor (13. hodinu kultivace). U kultur, k nim~ byl p~ids sirnlk v 10, 11. nebo 12. hodin~, vytvo~flo pouze asi 70 % bun~k spory nebo ,,defektnl spory". Ionty CN- p~idan~ v koneentraci 1 . 10 -~ M p~ed sporulacl, nemaji n~ tento proces t~m~" vliv (Vinter 1956c). Diskuse P~i sledovs dSinku cysteinu a cystinu na sporulaSnl mechanismus jsme zjistili, ~e tyto aminokyseliny pfisobi nejsiln~ji, jsou-li p~ids p~ed samotnou tvorbou spor, tedy v dob~, kdy u~ je z~ejm~ bufiky nemohou rychle metabolisovat. Nejb~n~jw cestou rozkladu cystinu u mikroorganismfi je pravd~podobn~ redukce na cystein (Kallio a Porter 1950, Romano a Nickerson 1954) a d~le deaminace a desulfhydrace t~to aminokyseliny. Z literatury je zns ~e prvni fs rozkladu cysteinu je urychlovs p~idavkem glukosy (Tamiya 1951, 1954). B~hem na~eho studia vlivu cysteinu a cystinu na tvorbu spor Bacillus megatherium uve~ejnfli Benigno, Visentini a Franceschini (1955) prs ve kter~ popisujl bakteriostatick~ dSinek cysteinu vfiSi E. coll. Tito autoli uv~d~ji, ~e fi~in cysteinu je mo~no zvr~tit velk~m nadbytkem pyrohroznovd kyseliny. Zs o kter~ch se domnivs ~e vedou k rychlej~imu rozkladu cystinu, na p~iklad p~izpfisobeni kultury t~to aminokyselin~, nebo mound zv:~eni respirace vlivem nadbytku glukosy, zvy~uji odolnost kultury vfiSi cystinov~ inhibici tvorby spor. V~sledky pokusfi s ob~ma aminokyselinami a sirnlkem uks ~e v dSinku t~chto ls je jist~ podobnost. Taro skuteSnost by mohla nasv~dSovat tomu, ~e dSinn:~m 86

6initelem p~i inhibici tvorby spor jsou skupiny SH, a~ v podob~ cysteinu nebo sirovodiku. Spory bacilfi obsahuji mnohem m6n~ SH-skupin ne~ vegetativni bufiky (Mortenson a Beinert 1953). Cytochemickou metodou zjistil Widra (1956), ~e praespory Bacillus megatherium a Bacillus mycoicles obsahuji zv~en6 mno~stvi SH-skupin, v~zan)~eh v proteinech, a ~e p~i p~echodu praespory ve sporu doch~zl zi'ejm~ k sni~eni jejich mno~stvl. Je mo~n@, ~e sni~eni obsahu SH-skupin v bufik~ch b6hem sporula6nlho procesu je jednim z mechanismfi, kter@ zaji~uji spor&m vysokou odolnost vfi6i ~ad6 ~kodliv~ch 6initelfi. Domniv&me se, ~e p~id~ni slou6erdn, kter6 mohou z v ~ i t obsah SH-skupin v bufice a~ p~imo, nebo 10orozkladu, mfl~e v tomto obdobi zna6n~ch zm~n v obsahu SH-skupin naru~it norm&lni sled biochemick~eh reakcl vedoucich k v y t v ~ e n i spor. Dal~im mechanismem, kter~ vede k zvy~ov~nl odolnosti spor, je p~echod v~pniku do sporulujicich bun~k (Curran, Brunstetter a Myers 1943, Powell 1953, Poweil a Strange 1956, Sugiyama 1951, Tine]li 1955a, b, Vinter 1956b, c). P~i studiu tvorby spor Bacillus megatherium naru~en@ cysteinem nebo cystinem jsme zjistili, ~e p~echod v&pniku z media do bun~k je naru~en. V~pnlk je ve spor~ch v~z~n na kyselinu 2,6-dipikolinovou (Perry a Foster 1955, Powell 1953, Powell a Strange 1956, Tinelli 1955a, b). Je mo~n@, ~e pli poru~eni sledu praesporulaSnich mechanismfl vj?~e uveden~mi l~tkami je naruw t@~ syntesa dipikotinov6 kyseliny a nedojde tedy k p~evodu v&pnlku do bun~k. Ve studiu inhibice tvorby spor Bacillus megatherium cysteinem a cystinem budeme d&le pokra6ovat.

Souhrn 1. P~ids aminokyselin cystinu nebo cysteinu (koneSn& koncentrace 1 . 10-4 M) p~ed tvorbou spot do kultury Bacillus megatherium siln~ naruw tento proces. ZaSs sporulace se opozdi a proces ustme na delhi dobu ve stadiu praespor a fitvarfi, kter~ jsme oznaSili jako ,,defektnl spory". Inhibice tvorby spor je prov&zena omezenim vstupu vs do sporulujicich bun~k. ,,Defektnl spory" neobsahujl vice vs ne~, vegetativnl bufiky. 2. l~Sinek cystinu na tvorbu spot Bacillus megatherium z~visl na tom, v kter~ dob~ kultivaee byl p~ids do kultury. Naruw tvorby spor se projevuje teprve po p~ids cystinu do kultury nach~zejlci se v p~edsporulaSnim stadiu, a to tak, ~e 51m star~i je kultura v okam~iku p~id~nl, tim siln~j~i je fiSinek. 3. Kultivace Bacillus megatherium za p~itomnosti cystinu zvy~uje odolnost kultury vfiSi fiSinku t@to aminokyseliny, znovu p~idan6 p~ed sporulaci. 4. Inhibici tvorby spor cystinem mfi~eme 5s zvrs p~ids znaSndho nadbytku glukosy spolu s touto aminokyselinou. 5. Podobn~ inhibiSni fiSinek na tvorbu spor Bacillus megatherium jako cystein a cystin vykazuje i sirnik sodn~. A u t o r d6kuje Marii SouSkov@ za t e c h n i c k o u spolupr~ci. Literatura B e n l g n o , P., Visentini, P., F r a n c e s c h i n i , V. : Ricerche sul meccanismo della batteriostasi. ~Vlodificazio~i ~*el metabolismo dell' E. coli per azione della eisteina, l~icerca Sci. 25 : 828, 1955. C u r r a n , H . R., B r u n s t e t t e r , B. C., Myers, A. T.: Spectrochemical analysis o/vegetative cells and spo~'es o] bacteria. J . B a c t . 45 : 485, 1943. K a L i o , R . E., P o r t e r , J. R . : The metabolism of cystine and cysteine by Proteus vulgaris and P~'oteus morganii. J. B a c t . 60 : 607, 1950. M o r t e n s o n , L. E., B e i n e r t , H . : Appearance o] sul/hydryl groups during growth of Bac. globigii. J. B a e / . 66 : 101, 1953.

87

Ferry, J-. J., Foster, J. W.: Studies on the biosynthesis o] dipicolinie acid in spores o] Bacillus cereus var. mycoides. J. Bact. 69 : 337, 1955. Powell, J. F.: Isolation o] dipicolinic acid (pyridine 2,6.dicarboxylie acid) ]rom spores o] Bacillus megatherium. Biochem. J. 54 : 210, 1953. :powell, J. F., Strange, R. E.: Biochemical changes occuring during sporulation in Bacillus species. Biochem, J. 63 : 661, 1956. Romano, A. H., Niekerson, W. ~.: Cystine reduetase o] pea seeds and yeasts. J. Biol. Chem. 208 : 409, 1954. Slavik, K., Smetan~, it. : Stanoveni aktivity proteolytick~ch enzym~ biuretovou reakcl. Chem. listy 46 : 649, 1952. Sugiyam~, H.: Studies on ]actors affecting the heat resistance o] spores o/Clostridium botulinum. J. Bact. 62 : 81, 1951. Tamiya, N.: Aerobic decomposition o] cysteine by Escherichia coll. J. Chem. Soc. Japan., Pure Chem. Sect. 72 : 118, 1951. Tamiya, N.: Aerobic decomposition o] cysteine by Escherichia coll. I., J. Biochem. (Tokyo) 41 : 199~ 1954. Tinelli, R. : J~tude de la bioehimie de la sporulation ehez Bacillus megaterium. I. Composition des sporex obtenues par carence des diffdrents substrats carbonds. Ann. Inst. :Pasteur 88 : 212, 1955a. - 1 1 . Modifications biochimiques et dchanges gazeux aceompagnant la sporulation provoqude par carence de glucose. Ann. Inst. :Pasteur 88 : 364, 1955b. Vinter, V.: Nerovnocennost bun~k Bacillus megatherium v pr,~bghu sporulace. ~s. biologie 4 : 294, 1955. Vinter, V.: Sporulace bacil~. I I . Proteolytickd enzymy v procesu sporulace u Bacillus megatherium. ~s. mikrobiol. 1 : 63, 1956a. I I 1 . P~echod vdpnlku do bun~k a pokles proteolytickd aktivity prost~edl p ~ sporulaci Bacillus megatherium. (~s. mikrobiol. 1 : 145, 1956b. Vinter, V.: Zdkladn~ biologickd a biochemickg pro]evy p~i sporulaci. KandidAtsks disertaSnl prgme. :Praha 1956e. Widra, A.: Studies on the cytochemistry o] bacteria. ~. Bact. 71 : 689, 1956.

Cnopoo6paaoBanHe6aaHaa. IV. BO3i~efiCTBHe aHCTeHHOM H ~HCTHHOM na o6paaoBaHHe chop y Bacillus m e g a t h e r i u m

B. Bunmep Pe3~oMe IIpH6asaenHe n uyabType Bacillus m e g a t h e r i u m aM~HOnHC~IOT ~ C T ~ a Ha~ ~CTe~Ha (B ono~qaTeahnofi ~ r I . t 0 -4 M) nepe~ o6paaoBaH~eM chop cnaLHo uapymaeT aTOT npo~ecc: ~aqaao cnopoo6pa3osaHH~ aanaa~usaeT, H npo~ecc ~a ~oaroe BpeM~ np~oCTaHaBaHBaeTcu B CTa~IHtI (mpecnop)) ~ o6paaoBaH~fi, ~OTOpUe MlaI ~aaBaa~ (qle~eKTHhIMHcuopaMm). IIo~aB~eHHe o 6 p a a o B a H ~ chop conpoBom~aeTc~ orpaH~eH~eM np0H~HOBeH~u Kam, a ~ s oSpaay~om~e c n o p ~ ~aeT~m (,]~e~enTn~Ie cnop~)> co~epmaT ~ a a ~ He 6ore, me, qe~ s e r e T a T ~ H ~ e I~IeTKH. ~efiCTBHe H~ICTHna na cnopooSpa3osaHHe y B. m e g a t h e r i u m 3aBHCHT OT TOrO, n l~aI~ofi nep~o~ nya~THna~I~ri OK 6~Ia npH6anae~ ~ ~yx~Type: Hapymeu~e o6paaoBanu~ chop n p o ~ e c T ~ I TO~I~O nocae npuSasaeHHn RHCTHna ~ n y ~ , T y p e s npe~cnopoo6pa3oBaTeJ~sHofi cTaR~m rI HeM cwapme ~ya~Typa s MoMenT ero n p n 6 a n ~ e u ~ , TeM cH~iLnee ~eficTsue. I ~ y a ~ , T ~ s a ~ B. m e g a t h e r i u m B HpHcyTCTBHH ~CTIIHa noBMmaeT yCTOI]qHBOCT~, Kya~Typ~ no OTHOmeHH~O ~ HOBOMy up~6anJ-IeHl?IIO BTOffaM~HOHZCaOT~,I nepe~ c n o p o o S p a ~ o s a ~ e M , rlo~aBaeHHe c n o p o o S p a a o B a ~ a E~CT~HOM MOh~HOy~[ep~TS nyTeM O~HoBpeMeH~oro n p H S a s a e ~ i ~ 3Ha,~Teasnoro H35MTI4a r a m n o 3 ~ . IIo~o6noe n o ~ a B ~ I o ~ e e ~eficTB~e, I~an ~InCTHH r~ ~HCTeHH, onaa~BaeT Ha CHOpOOSpaaoBaH~e B. m e g a t h e r i u m cepn~cT~fi ~aTpH~.

88

Obr. 1. Preparht z neovlivnSn~ vysporulovan6 kultury, star~ 22 hodin. Obr. 2. Preparht z kultury, star~ 22 hodin, do kter4 byl 12. hodinu kultivace p~idhn cystein. Obr. 3. Preparht z kultury star~ 22 hodin, do kter6 byl I2. hodinu kultivace p~idgm cystin. Na snlmcich jsou vyzna6eny p~iklady praespor (1) a ,,defektnich spor" (2). Zv~tw 2000krttt.

Obr. 4. Norm~lni voln~ spory v kttltu~e star~ 82 hodin. Obr. 5. Sm~s norm~lnlch a kulat~jhlch spor z kultury, star~ 82 hodin, k ni~. byl p~id~n c.ystin 10. hodinu kultivace. Obr. 6. Voln~ spory z kultury, star~ 82 hodin, k ni~ byl p~idhn cystin l l. hodinu kultivace. Snlmky poHdil za pou~itl fhzov~ho kontrasSu J. Fiala. Zv~t~eno 2000krht.

Sporulation of Bacilli. IV. T h e Effect o f C y s t i n e a n d Cysteine o n Spore F o r m a t i o n in Bacillus megatherium

V. Vinter Summary T h e a d d i t i o n of t h e a m i n o acids c y s t i n e or c y s t e i n e (final c o n c e n t r a t i o n 1 • 10 - 4 M) to a c u l t u r e o f Bacillus megatherium prior to t h e f o r m a t i o n o f t h e spores m a r k e d l y d i s o r g a n i s e s t h i s process. T h e c o m m e n c e m e n t of s p o r u l a t i o n is d e l a y e d a n d t h e p r o c e s s is h a l t e d for a considerable t i m e a t t h e prespore s t a g e a n d t h a t of f o r m a t i o n s w h i c h we h a v e t e r m e d ,,defective spores". I n h i b i t i o n of spore f o r m a tion is a c c o m p a n i e d b y a r e d u c t i o n in t h e u p t a k e of c a l c i u m into t h e s p o r u l a t i n g cells. T h e cells w i t h ,,defective s p o r e s " do n o t c o n t a i n m o r e c a l c i u m t h a n v e g e t a t i v e cells. T h e effect o f c y s t i n e o n t h e f o r m a t i o n of spores of Bacillus megatherium d e p e n d s o n t h e p o i n t a t w h i c h it is a d d e d to t h e culture. I n h i b i t i o n of spore f o r m a t i o n is m a n i f e s t e d only w h e n c y s t i n e is a d d e d to t h e c u l t u r e in t h e p r e s p o r u l a t i o n period, t h e degree of i n h i b i t i o n b e i n g in direct p r o p o r t i o n to t h e age of t h e c u l t u r e a t t h e m o m e n t w h e n t h e c y s t i n e is added. T h e c u l t i v a t i o n of Bacillus megatherium in t h e p r e s e n c e o f c y s t i n e increases r e s i s t a n c e of t h e c u l t u r e to t h e a c t i o n of t h i s a m i n o a c i d w h e n a d d e d a g a i n prior to s p o r u l a t i o n . I n h i b i t i o n of spore f o r m a t i o n b y c y s t i n e c a n be p a r t i a l l y r e v e r s e d b y a d d i n g a considerable excess of glucose t o g e t h e r w i t h t h e a m i n o acid. S o d i u m s u l p h i d e h a s a similar i n h i b i t o r y effect o n t h e f o r m a t i o n of s p o r e s o f Bacillus megatherium to t h a t o f c y s t e i n e a n d e y s t i n e .

89