Leitthema Orthopäde 2004 · 33:1338–1345 DOI 10.1007/s00132-004-0730-4 Online publiziert: 29. September 2004 © Springer Medizin Verlag 2004

Redaktion C.J. Wirth, Hannover H. Windhagen, Hannover

M. Eblenkamp1 · J. Aigner1 · J. Hintermair1 · S. Potthoff1 · U. Hopfner1 · V. Jacobs2 M. Niemeyer2 · E. Wintermantel1 1 Zentralinstitut für Medizintechnik der TU München 2 Frauenklinik der TU München

Umbilical Cord Stromal Cells (UCSC) Zellen mit osteogenem Differenzierungspotenzial

D

ie „Regenerative Medizin“ stellt eines der spannendsten Felder der biomedizinischen Forschung dar. Als anwendungsorientierte Disziplin hat sie das Ziel, ausgehend von der Erforschung der regenerativen Prinzipien des Organismus neue innovative Methoden zur Behandlung von Gewebsschäden zu entwickeln. Das grundlegende Prinzip regenerativer Vorgänge ist folgendes: Durch den Gewebsschaden wird eine Anreicherung wenig differenzierter Zellen (Vorläuferzellen) am Ort der Schädigung induziert. Dieses wird entweder durch Proliferation ortsständiger Zellen oder durch Einwanderung von Zellen erreicht. Gesteuert durch das äußere Milieu (extrazelluläre Matrix, zelluläre Umgebung, lösliche Mediatoren) differenzieren diese Zellen funktionell aus und bilden ortstypisches Gewebe. Dieses Prinzip legt zwei Therapieansätzen nahe, um die Regeneration von Gewebe zu induzieren bzw. zu unterstützen: F Beeinflussung des äußeren Milieus (Beispiel: Einbringen von osteoinduktiven Substanzen in Knochendefekte), F Anreicherung entsprechender Vorläuferzellen am Ort des Gewebeschadens. Denkbar ist in diesem Zusammenhang die Rekrutierung in situ befindlicher Vorläuferzellen (Einsatz von Zytokinen) oder das gezielte Einbringen in vitro kultivierter Zellen an den Ort des Gewebeschadens. Aus Letzterem ergibt sich eine zentrale Herausforderung in der regenerativen Medi-

1338 |

Der Orthopäde 12 · 2004

zin, nämlich die Suche nach geeigneten Zellpopulationen als Grundlage für eine gezielte Gewebsregeneration. Diese Zellen müssen 2 Voraussetzungen erfüllen: Sie müssen zum einen in vitro eine proliferative Aktivität besitzen, um sie ex corpore vermehren zu können. Zum anderen müssen sie in der Lage sein, sich funktionell in den angrenzenden ortsständigen Gewebsverband einzugliedern. Dieses setzt voraus, dass sie eine phänotypische Plastizität besitzen und sich in ihrer Differenzierung an die Umgebung anpassen können. Multipotente Stammzellen besitzen per definitionem diese Eigenschaften und sind deshalb für die regenerative Medizin von besonderem Interesse []. Da der Einsatz von embryonalen Stammzellen aufgrund ihrer ethischen Problematik limitiert ist, gibt es intensive Bemühungen, auch aus dem postnatalen Organismus Zellen mit ähnlichen Eigenschaften zu gewinnen. Hierbei zeigt sich, dass offenbar in einer Vielzahl von Geweben (insbesondere Knochenmark, Fettgewebe, Blut, Haut) Zellen existieren, die mit einem geringen Determinationsgrad und einer hohen Proliferationskapazität Eigenschaften multipotenter Stammzellen aufweisen [6, 8, 29, 30]. Die diesbezüglich wohl am ausführlichsten untersuchten Zellen sind die „mesenchymalen Stammzellen“ des Knochenmarks [2, 9, 22, 23]. Wenngleich durchaus kontrovers diskutiert, so weisen zahlreiche Untersuchungen darauf hin, dass auch funktionell ausdifferenzierte Zellen ein hohes Maß an Plastizi-

tät besitzen können und über einen Dedifferenzierungs- bzw. Transdifferenzierungsprozess in wenig determinierte Zellen bzw. andere funktionelle Differenzierungsformen übergehen können [, 3, 27]. Auch in vivo finden sich Beispiele, in denen Stammzelleinwirkungen bzw. Deund Transdifferenzierungsphänomen zur Darstellung kommen. Im Hinblick auf den für die Orthopädie spannenden Bereich der Osteoregeneration ist v. a. das Phänomen der heterotopen Ossifikation interessant. Hierbei zeigt sich, dass offenbar gerade in vaskulären Kompartimenten wenig determinierte Zellen vorhanden sind, die unter entsprechenden Bedingungen leicht in osteogene Zellen differenzieren können. So finden sich in atherosklerotischen Plaques, aber auch in verkalkten Herzklappen immer wieder eingelagerte reife Knochenstrukturen, z. T. einschließlich des blutbildenden Knochenmarks [5, 7]. Insgesamt wird offensichtlich, dass die phänotypische Gewebs- und Zelldetermination im postnatalen Organismus viel weniger ausgeprägt ist, als früher angenommen wurde. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass für therapeutische Ansätze der regenerativen Medizin auch solche Zellen verwendet werden können, die zwar nicht den klassischen Stammzellen zugeordnet werden, aber dennoch ein hohes Maß an Plastizität besitzen. Wir denken, dass die Nabelschnur aus folgenden Gründen eine vielversprechende Quelle zur Gewinnung solcher plastischer Zellen für den Einsatz in der regenerativen Medizin darstellt:

Zusammenfassung · Abstract . Aufgrund der engen Beziehung zur Fetalphase ist davon auszugehen, dass Nabelschnurzellen geringer determiniert sind als Zellen des Erwachsenen und sich durch eine hohe Proliferationskapazität auszeichnen. 2. Die Nabelschnur stellt ein großes Gefäß dar, sodass insbesondere in osteogener Richtung ein ähnliches Transformationspotenzial wie bei anderen vaskulären Strukturen zu vermuten ist (s. oben). 3. Das Nabelschnurgewebe steht in großen Mengen und ohne jeglichen Eingriff zur Verfügung. 4. Es existieren bereits Veröffentlichungen, die die Isolation einzelner multipotenter Zellen aus der subendothelialen Schicht der Nabelschnurgefäße bzw. aus der Nabelschnurmatrix beschreiben [4, 24]. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen standen die mengenmäßig dominierenden Zellen der Nabelschnur, nämlich die Nabelschnurstromazellen (Umbilical Cord Stromal Cells (UCSC)). Im Hinblick auf ihren möglichen Einsatz bei zellbasierenden Therapieformen wurde besonderes Augenmerk auf das Wachstumsverhalten und die Plastizität von UCSC gelegt.

Material und Methoden Nabelschnur Siehe . Abb. 1.

Medien Transportpuffer 50 ml Hanks-Lösung (0×), 450 ml steriles Aqua bid., 5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung, 5 ml Partrizin A, 2,5 ml 25 mM HEPES, 2,33 ml 7,5% Na-Bicarbonat-Lösung. Alle Substanzen wurden von Fa. Biochrom, Deutschland, bezogen.

Kulturmedium (KM) 60% DMEM (Fa. Gibco, UK), 40% MCDB (Fa. Sigma, Deutschland), 2% FCS (Fa. HyClone, Deutschland, Lot  CMK093), 00 µM Ascorbinsäure (Fa. Sigma, Deutschland), × ITS (Fa. BD Biosciences, USA), 0 ng/ml EGF (Fa. Sigma, Deutschland).

Orthopäde 2004 · 33:1338–1345 DOI 10.1007/s00132-004-0730-4 © Springer Medizin Verlag 2004

M. Eblenkamp · J. Aigner · J. Hintermair · S. Potthoff · U. Hopfner · V. Jacobs M. Niemeyer · E. Wintermantel

Umbilical Cord Stromal Cells (UCSC). Zellen mit osteogenem Differenzierungspotenzial Zusammenfassung Voraussetzung zur Etablierung zelltherapeutischer Verfahren in der regenerativen Medizin ist die Identifizierung geeigneter Zellsysteme, die 1. in ausreichenden Mengen zur Verfügung stehen, 2. leicht zu gewinnen sind, 3. sich in vitro gut expandieren lassen und 4. dem notwendigen Zelltyp entsprechen bzw. sich in diesen differenzieren lassen. Da die Nabelschnur ohne jegliche Intervention vorliegt und eine beträchtliche Menge an Gewebe darstellt, halten wir diese für eine hoffnungsvolle Quelle zur Gewinnung solcher Zellen. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Umbilical Cord Stromal Cells (UCSC), die Bindegewebszellen des Nabelschnurgewebes, in ausreichenden Mengen gewonnen werden können und sich in vitro gut expandie-

ren lassen. UCSC ähneln mit ihrer phänotypischen Plastizität funktionell den Stammzellen. UCSC können in Zellen mit osteoblastären Eigenschaften (Expression von alkalischer Phosphatase, Ausbildung von Bone nodules) differenziert werden. Fazit: Die Nabelschnur darf nicht länger als wertloses Gewebe betrachtet und gedankenlos entsorgt werden, da sie v. a. für die Reparatur knöcherner Defekte eine wertvolle Ressource zur Gewinnung von potenten Zellen für zellbasierende Therapieansätze darstellen könnte. Schlüsselwörter Nabelschnur · Stammzellen · Plastizität · Osteoblasten · Zelltherapeutische Verfahren

Umbilical cord stromal cells (UCSC). Cells featuring osteogenic differentiation potential Abstract The identification of appropriate cell types is necessary to establish cell-based therapies in regenerative medicine. These cell types must (1) be available in an appropriate amount, (2) be easy to obtain, (3) be sufficiently expandable in vitro, and (4) fit to or at least be able to differentiate into the required cell type. Since the umbilical cord is available without any intervention and represents a notable amount of tissue, we consider it to be a promising source for isolating cells for cell-based therapies. This study demonstrates that umbilical cord stromal cells (UCSC), the connective tissue cells of the umbilical cord, can be isolated in sufficient quantities and be well expanded. UCSC feature phenotypic plastici-

ty and thus are functionally similar to stem cells. UCSC can be differentiated into cells with osteoblastic properties (expression of alkaline phosphatase, formation of bone nodules). It is concluded that the umbilical cord should no longer be regarded as valueless tissue and be unthinkingly discarded. Instead, it should be considered a valuable resource for the isolation of potent cells for cell-based therapies, especially for treatment of bone defects. Keywords Umbilical cord · Stem cells · Plasticity · Osteoblasts · Cell-based therapies

Der Orthopäde 12 · 2004

| 1339

Leitthema Analytische Methoden Immunozytochemie

Abb. 1 8 a Nabelschnurquerschnitt. Die Nabelschnur besteht in großen Teilen aus einer gelatinösen proteoglykanhaltigen Matrix, dem Nabelschnurstroma (NS), auch „Whartonsche Sulze“ genannt. In das Nabelschnurstroma sind 3 Nabelschnurgefäße (2 Nabelschnurarterien, A; 1 Nabelschnurvene, V) eingebettet, deren äußere Wandschichten fließend in das Stromagewebe übergehen. Äußerlich wird die Nabelschnur von einem einschichtigen Amnionepithel (AE) überzogen. b Segmente von 2 verschiedenen Nabelschnüren gleich alter Neugeborener, die deutliche Kaliberunterschiede zeigen

Gewinnung der Umbilical Cord Stromal Cells (UCSC) Innerhalb einer halben Stunde nach der Geburt wurde ein Teil der Nabelschnur abgetrennt, in Transportpuffer überführt und für maximal 24 h bei 4°C gelagert. Das Nabelschnursegment wurde dann gründlich gewaschen und in 2–3 mm dicke Scheiben geschnitten. Anschließend wurden die Nabelschnurgefäße mit einer Pinzette aus den Nabelschnurscheiben herausgezogen und verworfen. Das übrige Gewebe der Nabelschnurscheiben wurde mit einem Gewebeschneider (McIlwain Tissue Chopper, Fa. The Mickle Laboratory Engineering, UK) in ca. 0,5 mm dicke Fragmente zerkleinert. Die so gewonnenen Gewebsfragmente wurden für 3 h bei 37°C auf einem Taumler in einer Enzymlösung (2 ml/cm Nabelschnur) verdaut, die 4 mg/ml Collagenase II (Fa. Worthington, UK, 96 U/ml), 0, mg/ ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (Fa. Sigma, Deutschland),  mg/ml Hyaluronidase II (Fa. Sigma, Deutschland), 4 mg/ml BSA (Fa. Sigma, Deutschland) und 0 µg/ml DNase II (Fa. Sigma, Deutschland, 3000– 8000 U/mg Protein) enthielt. Die so gewonnene Lösung wurde :0 mit PBS verdünnt, durch ein Nylonfilter (Porengröße: 00 µm) gegeben und anschließend bei 300 g für 0 min zentrifugiert. Nach Dekantierung des Überstandes wurden die im Zellpellet verbleibenden Zellen (Umbilical Cord Stromal Cells, UCSC) mit PBS

1340 |

Der Orthopäde 12 · 2004

gewaschen und in einer geeigneten Menge an Kulturmedium aufgenommen. Die UCSC wurden in einer Dichte von 3×04 Zellen/cm2 in handelsüblichen (nichtbeschichteten) Polystyrol-Zellkulturgefäßen ausgesät. Nach einem Tag wurde das Medium gewechselt, um nichtadhärente Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.

Expansion von UCSC Alle 2–3 Tage wurde ein Mediumwechsel (KM) durchgeführt. Die . Passage fand am Tag 4 statt. In der anschließenden Expansionszeit wurden die UCSC immer in einem deutlich subkonfluenten Stadium kultiviert. Eine Passage wurde durchgeführt, wenn die Zellen eine ca. 30%ige Konfluenz erreicht hatten. Zur Passagierung wurden die Zellen mit einer Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst und in einer Dichte von ×03 Zellen/ cm2 in neuen Kulturgefäßen ausgesät.

Differenzierung von UCSC Zur Differenzierung der Zellen wurden diese ohne weitere Passagierung in KM kultiviert. Wöchentlich erfolgte ein Medienwechsel. Unter diesen Bedingungen zeigten UCSC eine über die Kultivierungsdauer zunehmende Tendenz zur Ausbildung dreidimensionaler Sphäroide (. Abb. 2c).

Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit 70% Ethanol (−20°C) für 0 min bei RT fixiert und anschließend erneut 2-mal gewaschen. Nach Blockierung mit PBS + 5% BSA ( h bei RT) wurden die Zellen mit der Primärantikörperlösung über Nacht bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Alle primären Antikörper („mouse anti human“) wurden von Fa. Dianova, bezogen und mit PBS + % BSA wie folgt verdünnt: Vimentin :250, Desmin :300, SMA :200. Der Sekundärantikörper (Alexa 488 „goat anti mouse“, Fa. Molecular Probes) wurde :300 mit PBS + % BSA verdünnt und für 2 h bei 37°C im Dunkeln appliziert. Die Zellkerne wurden mit Ethidium Bromid (Fa. Sigma,) gegengefärbt.

Alizarin-Rot-Färbung Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit 70% Ethanol (−20°C) für  h bei 4°C fixiert und erneut mit PBS gewaschen. Anschließend wurde die Zellpopulation mit einer :5 verdünnten 40 mM Alizarin-RotLösung (Fa. Sigma), pH 4, für 0 min inkubiert und abschließend 3-mal mit PBS gewaschen.

Nachweis der AlkalischePhosphatase-Aktivität Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und anschließen mit 70% Ethanol (−20°C) für  h bei 4°C fixiert. Nach einem 2. Waschschritt wurden die Zellen für 3 h mit der Substrat-Lösung (SIGMAFAST™BCIP/ NBT, Fa. Sigma) inkubiert und abschließend mit PBS gewaschen.

Ergebnisse E UCSC lassen sich leicht isolieren und expandieren. UCSC lassen sich mit dem oben beschriebenen enzymatischen Verfahren leicht isolieren. Die durchschnittliche Ausbeute an UCSC, isoliert aus Nabelschnüren von ausgereiften Neugeborenen, betrug ,×06±5,7×05 (n=4). Hiervon gingen durchschnittliche 36±% (n=3) in einen adhärenten Phänotyp über. Es zeigte sich, dass eine Ischämiezeit bis zu 24 h bei 4°C

Abb. 2a–c 8 Typischer morphologischer Differenzierungsverlauf einer UCSC-Kultur in P0 (a), P2 (b) und P6 (c). d–f Nachweis einer myofibroblastären Differenzierung von primären UCSC (P0) mittels immunzytochemischer Färbungen gegen Vimentin (d), Desmin (e) und SMA (f). g–i Nachweis einer osteoblastären Differenzierung von UCSC nach Langzeitkultivierung. In g und h ist jeweils eine zytochemische Färbung für den Nachweis einer zellulären Aktivität von alkalischer Phosphatase gezeigt (braune Zellverbände). i zeigt einen „bone nodule“ mit Anfärbung der kristallinen Elemente mittels Alizarin-Rot (Messbalken =200 µm, gültig für alle Bilder)

in Transportpuffer keinen signifikanten Einfluss auf die Zellausbeute hat. Auffällig ist die große Varianz der Zellausbeute trotz in etwa gleichem Schwangerschaftsalter zum Zeitpunkt der Geburt und gleicher Ischämiezeit bis zur Aufarbeitung des Nabelschnurgewebes. Die nahe liegende Vermutung, dieses hänge mit den beträchtlichen interindividuellen Schwankungen der Nabelschnurgröße (. Abb. 1b) zusammen, konnte unsererseits nicht bestätigt werden. Insgesamt ist die Zellausbeute aus der Nabelschnur jedoch sehr zufrieden stellend: Aufgrund der Menge des zur Verfügung stehenden Materials (Nabelschnur-

länge ca. 60 cm) ist die mögliche Anzahl der zu gewinnenden UCSC pro Nabelschnur mit ca. 6×07 Zellen sehr hoch. Die Schwankungen in der Ausbeute pro Zentimeter Nabelschnur werden durch die starke In-vitro-Proliferationsaktivität von UCSC kompensiert, sodass spätestens nach der . Passage anfängliche Unterschiede in der Zellzahl nicht mehr ins Gewicht fallen. Darüber hinaus zeigte sich in unseren Untersuchungen, dass die interindividuelle Varianz in der Qualität der isolierten Zellen bzgl. ihrer Morphologie und ihrem Proliferationsverhalten im Vergleich zu anderen Zelltypen als eher gering einzustufen

ist und diesbezüglich keine Abhängigkeit von der primären Zellausbeute besteht. E Primäre UCSC sind Myofibroblasten. Primäre UCSC wurden 4 Tage nach Aussaat fixiert und auf ihre Expression von Vimentin, Desmin und Smooth Muscle Antigen (SMA) immunzytologisch untersucht. Morphologisch zeigen primäre UCSC einen charakteristischen, zumeist sternförmigen Aspekt mit scharfen Zellgrenzen und zipfeligen Zellausläufern sowie einer feinen perinukleär konzentrierten Granulierung (. Abb. 2a).

Der Orthopäde 12 · 2004

| 1341

Leitthema In den immunzytologischen Untersuchungen stellten sich nahezu 00% der primären UCSC deutlich positiv für Vimentin sowie Desmin und SMA dar (. Abb. 2d–f). Aufgrund der Koexpression eines mesenchymalen (Vimentin) und zweier glattmuskulärer Marker (Desmin, SMA) sind UCSC der Klasse der Myofibroblasten zuzuordnen. E UCSC zeigen eine ausgeprägte phänotypische Plastizität. Nach der . Passage ändert sich die charakteristische Morphologie primärer UCSC: Die Zellen zeigen eine vermehrte Granulierung sowie eine Elongation des Zytoplasmas (. Abb. 2b). Das Auftreten von spindelförmigen Zellen mit einem breiten flossenartigen sowie und einem spitz zulaufenden Pol weist auf einen migratorisch aktiven Zelltyp hin. Darüber hinaus besitzen zahlreiche Zellen mit einem Saum aus membranständigen Vesikeln einen sekretorischen Phänotyp (. Abb. 2b, Detail). E UCSC können in Zellen mit osteoblastären Eigenschaften differenzieren. Werden UCSC unter Differenzierungsbedingungen kultiviert, so nehmen sie mehr und mehr eine ausgeprägte Spindelform ein (. Abb. 2c). Gleichzeitig bilden sie – auch in deutlich subkonfluenten Arealen – umschriebene Zellverbände aus, die sich in die 3. Dimension aufwerfen (. Abb. 2c). Offenbar ist das Fehlen der Subkultivierung unter Differenzierungsbedingungen mit Ausbildung von engen Zell-Zell-Kontakten ein Stimulus für die Ausbildung eines Zellphänotyps, der ein dreidimensionales Wachstum bevorzugt. Diese Änderung des Phänotyps geht mit der Zunahme an Zellen einher, die eine Expression von alkalischer Phophatase (AP) aufweisen (. Abb. 2g, h). Die APpositiven Zellen sind feldförmig über die Kultur verteilt und besonders konzentriert in der Umgebung von sowie in Aufwerfungen zu finden. Gleichzeitig zeigen sich v. a. im Bereich der Aufwerfungen kristalline Ablagerungen, die sich deutlich mit Alizarin-Rot, einem Farbstoff zum Nachweis von Ca-Verbindungen, anfärben lassen (. Abb. 2i). Insgesamt kommt der typische Aspekt von „bone nodules“ zur Darstellung.

1342 |

Der Orthopäde 12 · 2004

Diskussion Wir konnten in Übereinstimmung mit anderen Publikationen zeigen, dass UCSC der Klasse der Myofibroblasten angehören [5, 6]. Interessanterweise machen unsere hier vorgestellten Untersuchungen jedoch deutlich, dass darüber hinaus UCSC offenbar eine erstaunliche phänotypische Plastizität besitzen. Im Vordergrund steht hierbei die Beobachtung, dass UCSC unter geeigneten Bedingungen osteoblastäre Eigenschaften gewinnen können, was sie zu einem interessanten Zellmodell für osteoregenerative Therapieansätze werden lässt. Dieses ist umso mehr der Fall, da UCSC als fetale bzw. frühkindliche Zellen eine außergewöhnlich hohe Proliferations- sowie Langzeitexpansionskapazität aufweisen und Nabelschnurgewebe als Quelle der UCSC reichlich, ohne jegliche Interventionen vorliegt und ohne ethische Bedenken verwendet werden kann. Es könnte somit leicht eine für therapeutische Ansätze ausreichende Menge an Zellen zur Verfügung gestellt werden. Die Eigenschaft der Plastizität teilen UCSC mit pluripotenten Stammzellen, wie sie z. B. im Knochenmark in Form der „mesenchymalen Stammzellen (MSC)“ gefunden werden können. Es ist daher zu diskutieren, wie UCSC und etablierte Stammzelltypen zueinander in Beziehung stehen. In diesem Zusammenhang sind Veröffentlichungen interessant, die darstellen, dass Myofibroblasten offenbar aus Stammzellen des Knochenmarks (MSC) entstehen können [3, 4]. Außerdem stellt sich eine Subpopulation der Stromazellen des Knochenmarks, die nur unscharf von den mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks abgegrenzt sind [7, 0], selbst als Myofibroblasten dar [8, 26]. UCSC gehören auch der Klasse der Myofibroblasten an, sodass auch zwischen UCSC und MSC eine Verwandtschaft bestehen könnte. Doch gibt es in unseren Untersuchungen auch deutliche Unterschiede zwischen UCSC und MSC: So riefen in unseren Versuchen die für MSC etablierten osteogenen Differenzierungsmedien bei UCSC keine Bevorzugung der osteoblastären Differenzierung hervor. Darüber hinaus scheint insgesamt die Plastizität von UCSC im Vergleich zu MSC nicht so ausge-

prägt zu sein, wenngleich wir neben der Entwicklung eines osteoblastären Phänotyps auch die Generierung eines glattmuskulären Zelltyps aus UCSC zeigen konnten (hier nicht gezeigt). Weitere Untersuchungen sind notwendig, um das ganze Ausmaß der Plastizität von UCSC abschätzen zu können. Aus folgenden Gründen steht unseres Erachtens die auf Zellen basierende Therapie von frühkindlichen Defekten, wie z. B. angeborenen knöchernen Missbildungen, als Kandidat für ein zukünftiges Einsatzgebiet für UCSC im Vordergrund: . Bei zellbasierenden Therapieformen ist immer ein autologer Ansatz zu bevorzugen, um Abstoßungsreaktionen zu vermeiden. Im Gegensatz zu Erwachsenen ist bei Säuglingen jedoch aufgrund der geringen Größe kaum genügend körpereigenes Quellgewebe zur Isolation geeigneter Zellen (z. B. MSC des Knochenmarks) zu gewinnen. Eine Ausnahme ist hier die Nabelschnur, die als ein Teil des Neugeborenen reichlich körpereigenes Gewebe darstellt, das ohne Eingriffe zur Verfügung steht. 2. Ein Szenario, bei dem prophylaktisch alle Nabelschnüre zur Zellisolation aufgearbeitet werden, die Zellen in einer Zellbank gelagert und nach Jahren bis Jahrzehnten dem adulten Menschen im Rahmen einer Zelltherapie autolog wieder zugeführt werden, ist zzt. wegen des hohen logistischen Aufwandes, der Kosten sowie des ungewissen Einflusses der Langzeitkryokonservierung auf die Zellqualität nur schwer denkbar. Dieses ist umso mehr der Fall, da offenbar auch im adulten Menschen mit den MSC Zellen vorhanden sind, die bei Bedarf in ausreichendem Maße aus dem Knochenmark gewonnen werden können. Eine Vorhaltung von Zellen aus dem frühkindlichen Lebensabschnitt ist somit vorerst nach bisherigen Erkenntnissen nicht notwendig. Anders ist dieses jedoch bei der Therapie von angeborenen Defekten, bei denen in der Regel eine möglichst frühzeitige Behebung angestrebt wird: Aufgrund der großen Fortschritte in der pränatalen bildgebenden Diagnostik

e g i e z n A e n i e t h Hier ste a c e n e Z Astra

Leitthema Partner des STEMMAT-Verbundes: • Zentralinstitut für Medizintechnik der TU München (Direktor: Prof. Dr. Dr. Erich Wintermantel) • III. Medizinische Klinik der TU München (Direktor: Prof. Dr. Christian Peschel) • Klinik für Herz-, Thorax- und herznahe Gefäßchirurgie, Universität Regensburg (Direktor: Prof. Dr. Dietrich Birnbaum) • Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes gGmbH, München • Binder GmbH, Tuttlingen Sponsor: Gesundheitsinitiative „Bayern Aktiv“ des Freistaates Bayern

ist es heutzutage möglich, Missbildungen in der Regel schon vor der Geburt zu diagnostizieren. Man kann sich somit gezielt darauf vorbereiten, die Nabelschnur für den therapeutischen Einsatz zu asservieren und entsprechend aufzubereiten. Eine evtl. notwendige Kryokonservierung von Nabelschnurzellen bzw. -gewebe ist ebenfalls denkbar, da der Zeitraum der Lagerung bis zur therapeutischen Verwendung überschaubar bleibt. Da die Alternative, eine ausreichende Menge von Zellen zum Zeitpunkt der Defektbehebung vom Säugling selbst zu gewinnen, kaum vorstellbar ist, ist der notwendige Aufwand auch gerechtfertigt. Aufgrund ihrer Eigenschaft, leicht einen osteoblastären Phänotyp auszubilden, wäre vor allem ein Einsatz von UCSC bei der Therapie von (angeborenen) knöchernen Defekten vorstellbar. Darüber hinaus sind primäre undifferenzierte UCSC der Klasse der Myofibroblasten zuzuordnen. Myofibroblasten stellen ein etabliertes Zellmodell im Bereich des kardiovaskulären Tissue Engineering dar [2, 25, 28], und insbesondere bei der Entwicklung von biologischen Herzklappen fanden die Zellen des Nabelschnurstromas schon Anwendung [9]. Ein breiterer Einsatz von UCSC bei der Behebung von (angeborenen) kardiovaskulären Defekten ist somit ebenfalls denkbar. Schließlich zeigten Untersuchungen in unserem Labor, dass UCSC auch in Zellen mit glattmuskulärem Charakter differenziert werden können (hier nicht gezeigt).

1344 |

Der Orthopäde 12 · 2004

Denkbar wäre somit auch ein zukünftiger Einsatz von UCSC bei der Behandlung von Defekten glattmuskulärer Gewebe. Hier sind v. a. (angeborene) Missbildungen des Urogenitaltraktes zu berücksichtigen. Die Eigenschaft der Plastizität ist bei allen Anwendungen von UCSC als großer Vorteil anzusehen: Zahlreiche Untersuchungen liefern Hinweise darauf, dass sich die Richtung der Ausdifferenzierung von undifferenzierten multipotenten Zellen an der geweblichen Umgebung am Implantationsort orientiert. So scheinen z. B. undifferenzierte Zellen des Knochenmarks bei Defekten im Myokard zu Kardiomyozyten, bei Defekten in der Niere jedoch zu Nierenzellen zu differenzieren [20, 2]. Aufgrund ihrer Plastizität ist daher auch bei den UCSC davon auszugehen, dass die ortstypische Integration der in vitro vordifferenzierten implantierten Zellen bzw. Zellkonstrukte in die gewebliche Umgebung gut sein wird, da der Einfluss der Umgebung im Körper noch ein „fine tuning“ der Differenzierung bewirken kann.

Fazit für die Praxis Wir sind der Meinung, dass die Nabelschnur nicht länger als wertloses Gewebe betrachtet und gedankenlos entsorgt werden darf. Vielmehr stellt die Nabelschnur eine wertvolle Ressource zur Gewinnung von potentem Zell- und Gewebsmaterial dar, dass im Hinblick auf eine therapeutische Verwendung intensiv erforscht werden sollte. Dieses Ziel wird im Forschungsverbund STEMMAT verfolgt, in dem auch die hier vorgestellten Untersuchungen durchgeführt wurden: Im Rahmen der Gesundheitsinitiative „Bayern Aktiv“ fördert der Freistaat Bayern unter Federführung des Zentralinstitutes für Medizintechnik der TU München die Erforschung des Potenzials von Nabelschnurgewebe und -blut im Hinblick auf eine zukünftige therapeutische Verwendung. Besonderes Augenmerk wird hierbei auf die Stammzelleigenschaften von Nabelschnurzellen sowie geeignete Kryokonservierungstechniken gelegt.

Korrespondierender Autor Dr. med. M. Eblenkamp Zentralinstitut für Medizintechnik der TU München, Boltzmannstraße 11, 85748 Garching E-Mail: [email protected]

Danksagung Ein besonderer Dank gilt dem Team des Kreißsaals der Gynäkologie des Klinikums rechts der Isar der TU München. Ihr Engagement bei der Gewinnung der Nabelschnüre und des Nabelschnurblutes stellt eine der Stützen des Erfolgs des STEMMAT-Projektes dar. Darüber hinaus sei allen Müttern gedankt, die durch ihre Einwilligung zur Gewinnung der Nabelschnüre einen Beitrag zur Erforschung dieses wertvollen Gewebes leisten. Interessenkonflikt: Der korrespondierende Autor versichert, dass keine Verbindungen mit einer Firma, deren Produkt in dem Artikel genannt ist, oder einer Firma, die ein Konkurrenzprodukt vertreibt, bestehen.

Literatur 1. Burns CE, Zon LI (2002) Portrait of a stem cell. Dev Cell 3: 612–613 2. Caplan AI (1991) Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 9: 641–650 3. Direkze NC, Forbes SJ, Brittan M et al. (2003) Multiple organ engraftment by bone-marrow-derived myofibroblasts and fibroblasts in bone-marrowtransplanted mice. Stem Cells 21: 514–520 4. Emura M, Ochiai A, Horino M, Arndt W, Kamino K, Hirohashi S (2000) Development of myofibroblasts from human bone marrow mesenchymal stem cells cocultured with human colon carcinoma cells and TGF beta 1. In Vitro Cell Dev Biol Anim 36: 77– 80 5. Eyden BP, Ponting J, Davies H, Bartley C, Torgersen E (1994) Defining the myofibroblast: normal tissues, with special reference to the stromal cells of Wharton’s jelly in human umbilical cord. J Submicrosc Cytol Pathol 26: 347–355 6. Forbes SJ, Poulsom R, Wright NA (2002) Hepatic and renal differentiation from blood-borne stem cells. Gene Ther 9: 625–630 7. Herzog EL, Chai L, Krause DS (2003) Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood 102: 3483–3493 8. Huss R (2000) Isolation of primary and immortalized CD34-hematopoietic and mesenchymal stem cells from various sources. Stem Cells 18: 1–9 9. Kadner A, Hoerstrup SP, Tracy J et al. (2002) Human umbilical cord cells: a new cell source for cardiovascular tissue engineering. Ann Thorac Surg 74: S1422–1428 10. La Russa VF, Schwarzenberger P, Miller A, Agrawal K, Kolls J, Weiner R (2002) Marrow stem cells, mesenchymal progenitor cells, and stromal progeny. Cancer Invest 20: 110–123 11. Liu Y, Rao MS (2003) Transdifferentiation – fact or artifact. J Cell Biochem 88: 29–40

Fachnachrichten 12. Maish MS, Hoffman-Kim D, Krueger PM, Souza JM, Harper JJ 3rd, Hopkins RA (2003) Tricuspid valve biopsy: a potential source of cardiac myofibroblast cells for tissue-engineered cardiac valves. J Heart Valve Dis 12: 264–269 13. Meivar-Levy I, Ferber S (2003) New organs from our own tissues: liver-to-pancreas transdifferentiation. Trends Endocrinol Metab 14: 460–466 14. Mitchell KE, Weiss ML, Mitchell BM et al. (2003) Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells 21: 50–60 15. Mohler ER 3rd, Gannon F, Reynolds C, Zimmerman R, Keane MG, Kaplan FS (2001) Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation 103: 1522–1528 16. Nanaev AK, Kohnen G, Milovanov AP, Domogatsky SP, Kaufmann P (1997) Stromal differentiation and architecture of the human umbilical cord. Placenta 18: 53–64 17. Pauli S, Lauwers P, Van Schil P et al. (2000) Lamellar bone formation in an atherosclerotic plaque of the carotid artery, with a review of histogenesis – a case report. Angiology 51: 77–81 18. Peled A, Zipori D, Abramsky O, Ovadia H, Shezen E (1991) Expression of alpha-smooth muscle actin in murine bone marrow stromal cells. Blood 78: 304– 309 19. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC et al. (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284: 143–147 20. Pittenger MF, Martin BJ (2004) Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res 95: 9–20 21. Poulsom R, Forbes SJ, Hodivala-Dilke K et al. (2001) Bone marrow contributes to renal parenchymal turnover and regeneration. J Pathol 195: 229–235 22. Reyes M, Verfaillie CM (2001) Characterization of multipotent adult progenitor cells, a subpopulation of mesenchymal stem cells. Ann N Y Acad Sci 938: 231–233; discussion 233–235 23. Ringe J, Kaps C, Burmester GR, Sittinger M (2002) Stem cells for regenerative medicine: advances in the engineering of tissues and organs. Naturwissenschaften 89: 338–351 24. Romanov YA, Svintsitskaya VA, Smirnov VN (2003) Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord. Stem Cells 21: 105–110 25. Schnell AM, Hoerstrup SP, Zund G et al. (2001) Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts. Thorac Cardiovasc Surg 49: 221–225 26. Sitnicka E, Wang QR, Tsai S, Wolf NS (1995) Support versus inhibition of hematopoiesis by two characterized stromal cell types. Stem Cells 13: 655–665 27. Slack JM, Tosh D (2001) Transdifferentiation and metaplasia – switching cell types. Curr Opin Genet Dev 11: 581–586 28. Steinhoff G, Stock U, Karim N et al. (2000) Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation 102: III50–55 29. Toma JG, Akhavan M, Fernandes KJ, Barnabe-Heider F, Sadikot A, Kaplan DR, Miller FD (2001) Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol 3: 778–784 30. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P et al. (2002) Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 13: 4279–4295

Mangelernährung im Krankenhaus In Deutschland leiden 20-30% der Krankenhauspatienten an Unterernährung. Dadurch wird nicht nur ihre Lebensqualität und ihr Wohlbefinden beeinträchtigt. Sie erholen sich auch langsamer, erleiden häufiger Komplikationen, sind verstärkt pflegebedürftig und weisen eine längere Krankenhausaufenthaltsdauer auf. Indes hilft eine effektive Vorbeugung und Behandlung der Mangelernährung nicht nur dem Patienten, sondern spart auch Kosten im Gesundheitswesen. In einer Studie (Pierlich M et al., Dig Dis 2003;245-251) konnte erstmals gezeigt werden, dass mangelernährte Krankenhauspatienten eine wesentlich höhere Sterblichkeit aufweisen, als gut ernährte Patienten mit derselben Krankheit. Ein Lösungsansatz kann die Etablierung von Ernährungssystemen sein, wie es in einigen europäischen Ländern bereits üblich ist. Adäquate Ernährungstherapien müssen individuell entwickelt werden und können bei vielen dieser Patienten durch Sondenernährung gewährleistet werden. Es gibt jedoch Überlegungen, medizinisch notwendige Sondenernährung nur noch bei wenigen Krankheitsbildern zu erstatten. Vor wenigen Monaten veröffentlichte das European Council eine Resolution zur Ernährung in Krankenhäusern, in der auf die gesundheitlichen, therapeutischen und ökonomischen Folgen deutlich verwiesen wird(https://wcm.coe.int/rsi/CM/index.jsp). Quelle: Deutsche Gesellschaft für Ernährungsmedizin, Berlin

Deutsches Forum Prävention und Gesundheitsförderung geht online Das Deutsche Forum Prävention und Gesundheitsförderung, das Bündnis von derzeit 68 auf dem Gebiet der Prävention und Gesundheitsförderung in Deutschland maßgeblich tätigen Verbänden und Institutionen in Deutschland, ist jetzt auch im Internet präsent. Neben den kontinuierlichen Berichten über die Arbeit des Forums finden sich hier zukünftig auch Informationen und Tipps für ein gesundes Leben und den verantwortungsvollen Umgang mit der Gesundheit. Das Deutsche Forum Prävention und Gesundheitsförderung war im Juli 2002 auf Initiative von Bundesgesundheitsministerin Ulla Schmidt gegründet worden, um die Bedeutung der Prävention als gesamtgesellschaftliche Aufgabe hervorzuheben. Zu den Mitgliedern gehören nicht nur Spitzenverbände und Organisationen aus dem Gesundheitswesen, sondern auch weitere Verbände und Ministerien in Bund und Ländern, die einen Beitrag zur Prävention leisten können. Das Deutsche Forum hat zum Ziel, eine präventive Ausrichtung der Aktivitäten im deutschen Gesundheitswesen und allen Politik- und Lebensbereichen zu verankern und zu stärken. Prävention und Gesundheitsförderung müssen daher als grundlegende Aufgaben in allen Politik- und Gesellschaftsbereichen etabliert werden. Das Deutsche Forum versteht sich als Plattform, auf der gemeinsame Ziele, Inhalte, Maßnahmen und Instrumente vereinbart, veranlasst und kommuniziert werden. Die Internet-Plattform ist unter http:// www.forumpraevention.de/ erreichbar. Quelle: Bundesministerium für Gesundheit und Soziale Sicherung

Der Orthopäde 12 · 2004

| 1345