Aus dem Hygiene-Institut der Universit~t Freiburg i. Br. (Direktor: Prof. Dr. R. Haas)
Vergleiehende autoradiographisehe Untersuchungen der Generationszeit, DNS-Synthesezeit und des Einbaues in die Chromosomen nach Markierung mit aIt-5-Jod-2'desoxyuridin mid aH-Thymidin an Gewebekulturzellen Von N. Seemayer, R. Haas und G. Maass Mit 2 Abbildungen
(Eingegangen am 2. September 1965) 5-Jod-2'-desoxyuridin (JUDR) wurde 1959 von Pruso]] (20) synthetisiert. Es ist eine dem Thymidin analoge Substanz und wird an dessen Stelle in die DNS eingebaut (15, 21). JUDI~ hemmt die DNS-Synthese, wobei der Angriffspunkt in versehiedenen Zellsystemen untersehiedlich zu sein scheint (3). Besonderes Interesse er]angte die Substanz durch ihre antivirale Wirkung, die sie gegeniiber Herpes- und Vaceinia-Virns in der Gewebekultur und in vivo entfa]ten kann (8, 11, 12). Nach neueren Untersuehungen wird auch die Vermehrung des onkogenen Virus SV40 in der Gewebekultur durch JUDI~ gehemmt [Haas und Maass (6, 7), Maass und Mitarbeiter (13)]. Interessanterweise wird trotz der Hemmung der DNS-Synthese virusspezifisches Protein gebildet (14). Die onkogene Wirkung von Adenovirus Typ 12 bei Hamstern wird dureh JUDl~-Gaben stark herabgesetzt (9). Bioehemisehe Untersuchungen yon Clifton und Mitarbeitern (2) mit J125-markiertem JUDI~ an menschlichen Geweben und Mi~usegeweben zeigen, da{~ das in die Zellkern-DNS eingebaute J U D R sehr stabil ist und erst dureh naehfolgende DNS-Synthesen und Zellteilungen vermindert wird. Feinendegen (4), Fox und Prusso//(5) beriehteten kfirzlieh fiber vergleichende Einbauversuche yon J12~-UDR und att-Thymidin (aH-TdR) in verschiedene Gewebe yon Ratte und Maus. W~hrend sich bei kurzen
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N, 8eemaver, R. Haas und g. Maass:
Versuchszeiten keine wesentlichen U n t e r s c h i e d e zwischen d e m E i n b a u y o n J125UDl~ u n d aI-I-Tdl~ in die D N S e r k e n n e n liegen, wurde n a c h m e h r e r e n T a g e n eine stgrkere A b n a h m e der R a d i o a k t i v i t g t nach J125UDRG a b e n als ngch a H - T d R im K n o c h e n m a r k der l~atte b e o b a c h t e t . Feinendegen g l a u b t , d~/~ dieser U n t e r s c h i e d ~u~ einer geringeren W i e d e r v e r w e n d u n g des J I ~ U D R beruht. T r i t i u m - m a r k i e r t e s J U D I ~ y o n hoher spezifiseher A k t i v i t g t b i e t e t die 1VISg]iehkeit, m i t Hilfe der A u t o r a d i o g r a p h i e den E i n b a u in die Z e l l k e r n - D N S wie auch in die C h r o m o s o m e n zu verfolgen. Kfirz]ich b e r i c h t e t e n Oehlert u n d Magnusson (17) in einer a u t o r a d i o g r a p h i s c h e n U n t e r s u e h u n g fiber den E i n b a u von a H - J U D R in die D N S y o n Ze]len des Y o s h i d a - A s c i t e s - H e p a t o m A H 130. I n d e r vorliegenden vergleiohenden U n t e r s u c h u n g p r i i i t e n wir n a c h M a r k i e r u n g m i t ~ H - J U D R bzw. aH-TdP~ d e n E i n b a u in die Z e l l k o r n - D N S u n d in die Chromosomen, die D N S - S y l t t h e s e z e i t u n d die G e n e r a t i o n s z e i t a n Affennierenepithelien des Cereopithecus a e t h i o p s u n d an H e L a - Z e l l e n in d e r Gewebekultur. Material und lgethode
Gewebekulturen: Die Gewebekultaren aus Nieren yon Cercopithecus aethiops wurden in tiblicher ~u durch Trypsinaufschlul] herges~ellt. Auf dieselbe Weise warden die HeLa-Zellen yon Stammkulturen gewonnen. Als Nghrmedium diorite eine L6sung yon 0,5% Lactalbuminhydrolysat (DIFCO Laboratories, Detroit, USA) und 5% Kg]berserum in Hanks-L5sung. Aulterdem enthielt das Nghrmedium noeh 100E Penicillin G und 1007 Streptomycin pro ml. Bei Versuch~beginn warea die HeLa-Gewebekultarzellen 2 Tage, die Nierengewebekultarzellen 8 Tage alt. Die Aussaat der Zellsuspensionen erfolgte in Reagenzglgser, die ein 0,5 • 7,0 cm grebes Deekglas enthielten.
Autoradiographie: Die M~rkierung der Gewebekulturzellen yon Cercopithecus aethiops und der HeLa-Zellen erfolgte dareh 60 Minuten lange Inkubation mi~ t #C/rot ~H-5-Jod-2"-desoxyuridin (spea. Aktivits 744 mC/mM, RadiochemicM Ceuter, Amersham, England) oder aH-Thymidin (spez. Aktivit a t 1,9 C/mM Schwarz Bioresearch) im N~hrmedium (ohne Kalberserum) bei 37 ~ C. Die Konzentration yon 1 #C/ml 3H-JUDR entsprieht etwa einer Gewichtsmenge von 0,5 7/ml. Nach darchgeffihrter Markierung warden die Gewebekultaren zweimal mit Hanks-L6sung gewasehen und mit radioaktivfreiem Nahrmedium ohne Kglberserum weiter bebrfltet. Die Autoradiogramme warden in der frtiher beschriebeneu lu hergestellt (16), wobei geringe Modifikationen ifir die Gewebekultar nStig waren. Die mit 4%igem neutr~lem Formalin odor nach Bouin fi~ierten Prgparate wurdon mi~ ftt~saiger Emulsion (G-5 odor K-2 Ilford L~d., Essex, England) bedeekt u a d 8 Tage bis 3 Wochen b d i c h t e t . Naeh erfolgter Entwicklung und Fixierung warden die Prs mit H~m~toxylin-Eosin odor Kresylviolett gefgrbt. Der Prozentsatz markierter Zeilen (all-Index) warde dureh Auszs yon jeweils 2000 Zellen nach einstiindiger radioaktiver Inkubatiou ermittelt. Den Prozentsatz markierter ~ i t o s e n erhielten wir durch Auswerten yon 300 bis 400 Mitosefigaren (mit Ausnahme der frtihen Prophasea) hinsiehtlich Zeit und Versuchsansatz. Der ~Sitoseindex warde an 2000 Zellen bestimmt.
Autoradiographisehe Untersuchungen an Gewebeku]turzellen
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Chvomosomendarsteltung: Nierenepithelien-Deckglaskulturen von Cercopithecus aethiops wurden ftir die Dauer yon 8 Stunden mit 1 #C/ml 3H-JUDR oder 3H-TdR bei 37 ~ C inkubiert. 4 Stunden vor der Spreizung der Chromosomen, die nach der Methode yon goth/els und Siminovitch erfolgte (23), wurde 1 7/ml Colchicin hinzugegeben. Die fertigen Chromosomenpr/iparate wurden mit K2-Emulsion beschickt und 3 Woehen belichtet. Naeh Entwieklung und Fixierung f/irbten wir sie mit verdfinnter Giemsa-LSsung durch die Emulsion hindurch. Die Pr~parate wurden in Eukitt eingesehlossen und mit 01immersion untersucht. Fiir die Mikroaufnuhmen benutzten wir ein Zeiss-Photo-l~ikroskop. Ergebnisse Die I-IeLa-Zellen zeigten nach Markierung mit 3H-Td1% eine genaue Verteilung der SilberkSrner fiber den Chromatinstrukturen der Zellkerne unter deutlicher Aussparung der Nukleoli. Auch nach Markierung mit Prozent
morkierter Mitosen 100 O
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30
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A b b . 1. D a s A u f t r e t e n m a r k i e r t e r M i t o s e n b e i I I e L a - Z e l l e n n a c h 60 r a i n I n k u b ~ t i o n 1 v C / m l ~ I ~ - J U D R b z w . aH-Td1% i n A b h / i n g i g k e i t y o n tier Z e i t .
mit
3H-JUDR wurde ausschliei]lich eine Markierung der Zellkerne beobachtet, w/ihrend die Nukleoli unmarkiert blieben. N~ch 60 Minuten langer Inkubation yon HeLa-Zellen mit 1/zC/ml aH-Td1% oder a H - J U D R war der Prozentsatz markierter Zellen (,,aH-Index") bei beiden Versuchsansiitzen praktisch gleich (aH-Tdl~ ~ 37,3% ; aH-JUDI% ~ 33,0%). Auch der Verlauf der Mitosekurve ergab v611ig identische Ergebnisse (Abb. 1). 2 Stunden naeh Versuchsbeginn wurden die ersten markierten Prophasen sowohl nach aH-TdR- als auch nach a g - J U D R - I n k u b a t i o n gesehen. 6 Stunden nach Versuchsbeginn sind etwa 50% der Mitosen markiert. Um die 10. Stunde sind fast 100% der Mitosen markiert. 14 Stunden nach Markierungsbeginn treten neben markier~en wieder unmarkierte Mitosen in gr6Berer Zahl auf. Die Zahl der markierten Mitosen nimmt bis zur 24.
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N. Seemayer, R. Haas und G. M~ass:
Stunde weiter ab, wo sie den Tiefpunkt erreicht. U m die 28. bzw. 32. Stunde naeh Versuchsbeginn ist wieder eine deutliche Zunahme der Zahl der markierten Mitosen zu verzeiehnen. Da die ersten markierten Mitosen etwa 2 Stunden nach Markierungsbeginn auftraten, l/~fit sieh auf eine minimale pr/imitotisehe l~uhepause (G-2-Zeit) yon etwa 2 Stunden sehliel~en. Der symmetrische Verlauf der Mitosekurve, sowohl nach 3H-TdR als auch nach 3H-JUDR-Markierung, spricht ffir eine relative Konstanz der DNS-Synthesezeit (18). Unter Berfieksichtigung des Zeitablaufes zwischen den 50~o-Werten ffir markierte Mitosen am anf- und absteigenden Ast der Mitosekurve (22) erh~lt man eine DNS-Synthese-Zeit yon etwa 8 Stunden. Der Zeitabsehnitt zwischen 2 g]eichwertigen Punkten an den aufsteigenden Asten der Mitosekurve betr~gt etwa 24 Stunden, und er entspricht damit der Generationszeit (18, 19). Die DNS-Synthese-Zeit betr~gt im Durchschnitt unter Berficksichtigung eines 3H-Index yon 33--37~o und einer Gener~tionszeit yon 24: Stunden etwa 8 bis 8,8 Stunden (10). Dieser Wert yon 8 bis 8,8 Stunden ffir die DNS-Synthese-Zeit steht in guter T]bereinstimmung mit dem oben unter Berfieksichtigung der 50~o-Mitosewerte berechneten ~%rt. Die Gesamtzahl der Mitosen bei HeLa-Zellen lag zwischen 2 bis 40/0. Die Autoradiogramme isolierter Metaphasen-Chromosomen (Abb. 2b) yon Cercopitheeus aethiops-Nierenepithelien zeigten nach Markierung mit titriertem Thymidin eine entspreehende Anordnung der Silberk6rner fiber den einzelnen Chromatidenstrs (1). Aueh nach ~ H - J U D R - G a b e waren die SilberkSrner wieder fiber den einzelnen Chromatidenstr~ngen ]okalisiert (Abb. 2a). Sowohl naeh ~H-JUDE- als auch nach ~H-Tdl~Inkubation waren beide Chromatiden eines Chromosoms markiert.
Besprechung der Ergebnisse Die Lokalisation der SilberkSrner in den Autoradiogrammen fiber den Ze]lkernen unter Aussparung der Nukleoli und besonders die Anordnung der SilberkSrner fiber den einzelnen Chromatiden der Chromosomen spricht ffir den Einbau von 3H-JUDI~ in die Zellkern-DNS. Die Anordnung und Verteilung der SilberkSrner ist die gleiche wie naeh ~H-TdR-Markierung. ~H-Tdl~ ist ein selektiver Vorl~ufer der DNS und wird w/~hrend der D~qS-Einbauphase in die Zellkerne aufgenommen. Der gleiche all-Index naeh 3H-JUDI~- wie nach ~H-Tdl~-Markierung spricht daffir, da~ auch 3 H - J U D R nur w~hrend der DNS-Synthesephase in die Zellkern-DNS aufgenommen wird. Das zeitlich und quantitativ fibereinstimmende Auftreten markierter Mitosen kann als weiterer Beweis daffir gelten. Die prs Ruhepause, die DNS-Synthese-Zeit wie auch die Generationszeit zeigen bei den van uns verwandten niedrigen 3H-JUDI~-Konzentrationen keine Ver~nderungen. Die unmittelbare Teilungsf~higkeit
Abb. 2. Markierte C h r o m o s o m e n aus Affenniereuepithelze]len (Cercopithecus a cthiops). ~) ncuch " H - 5 - J o d - 2 ' - d e s o x y u r i d i n - I n k u b ~ t i o n 1 ~tC/ml 8 Stunden, b) n a c h a H - T h y m i d i n - I n k u b ~ t i o n l~tC/ml 8 Stunden. Giems~-F~irbung', 01immersion, Vergr. 1000 •
Q
c+
t60
N. Seemayer, R. Haas nnd G. h{aass:
der Zellen blieb erhalten. Die vorliegenden Befunde schliegen die M6glichkeit jedoeh nicht aus, dab der Einbau yon 3H-JUDI~ in der yon uns benutzten Konzentration doeh noch eine sp/~ter eintretende Zellsch~digung bewirkt. Diese Ergebnisse stehen in guter ~bereinstimmung mit den yon anderen Autoren mit anderen Methoden erzielten Ergebnissen fiber den Einbau yon JUDtr in die DNS von S~ugetierzellen (2, 4, 15, 21). Oehlert und Magnusson (17) kamen bei autoradiographischen Untersuchungen am Yoshida-Ascites-Hepatom A I t l 3 0 der l~atte mit 3H-JUDE zu ~hnlichen Ergebnissen. Zusammenfassung Der Einbau yon aH-5-Jod-2'-desoxyuridin in die Zellkern-DNS und die Chromosomen wurde in der Gewebekultur yon HeLa-Zellen und Affennierenepithelien (Cereopithecus aethiops) mit Hilfe der autoradiographischen Methode untersucht, a H - J U D R wird w~hrend der DNS-Synthesephase in die DNS eingebaut und zeigt anch hinsiehtlich des zeitlichen und quantitativen Auftretens markierter ?r ein dem 3H-Tdl~ vergleiehbares Verhalten. Bei den verwendeten geringen Konzentrationen von aH-JUDR wurden keine Ver//nderungen in der Generationszeit, DNS-Synthesezeit nnd pr~mitotischen Ruhepause gefunden. Die Lokalisation der Silberk6rner nach 3H-JUDR und aH-TdI~Markierung wird fiber ausgebreiteten Chromosomen yon Cereopitheeusaethiops-Nierenzellen gezeigt.
Summary The incorporation of tritiated 5-iodo-2'-deoxyuridine into the nuclear DNA and into the chromosomes was studied in cultures of HeLa cells and kidney epithelium cells of Cercopithecus aethiops by light microscopic autoradiography. Tritia,ted 5-iodo-2"-deoxyuridine is incorporated into the DNA during the DNA synthesis phase. Also regarding the temporal and quantitative occurrence of labelled mitoses its behaviour is similar to that of tritiated thymidine. At the low concentrations, at which it was used, tritiated 5-iodo-2'deoxyuridine did not alter the generation time, the DNA synthesis time and the pre-mitotie rest period. The localization of silver grains after labelling with both mentioned compounds is demonstrated over spread chromosomes of Cercopithecus aethiops kidney cells.
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