J. Afr. Hépatol. Gastroentérol. DOI 10.1007/s12157-014-0506-3

ARTICLE ORIGINAL / ORIGINAL ARTICLE

Virus de l’hépatite C : étude des génotypes au Congo (Brazzaville) Hepatitis C: study of the genotypes in Congo (Brazzaville) B. I. Atipo-Ibara · J. Mimesse · A. Bokilo-Dzia · Deby-Gassaye · C. Ahoui-Apendi · F. Bossali · R. S. Ngami · J. R. Ibara © Springer-Verlag France 2014

Résumé Objectif : Identifier les génotypes du virus de l’hépatite C (VHC) au Congo. Patients et méthode : Il s’est agi d’une étude transversale et descriptive réalisée dans les centres de transfusions sanguine des deux grandes villes du Congo (Brazzaville et PointeNoire) durant une période de 7 mois. Elle a concerné les donneurs de sang réguliers et occasionnels consentants de plus de 18 ans. Le génotypage a été réalisé par séquençage de la région NS5B au laboratoire de virologie UMR 190 de Médecine de Marseille 2. Résultats : En 7 mois, 17351 donneurs de sang étaient prélevés. La sérologie du VHC était positive dans 721 cas, soit une fréquence relative de 4,2%. La fréquence relative était de 4,1% à Brazzaville et de 4,3% à Pointe-Noire. Parmi les 721 séropositifs au VHC, 74 patients ont été inclus, soit 59 hommes (79,3%) et 15 femmes (20,7%). L’âge moyen était de 31,5±7,6 ans, avec des extrêmes allant de 18 à 52 ans. Le tatouage était le facteur de risque le plus fréquent (44,6%) suivi de la transfusion sanguine (36,6%). Parmi les 74 séropositifs, 17 étaient positifs à la PCR, soit 23% dont 16 du génotype 4 et 1 du génotype 2. La majorité des patients infectés par le génotype 4 étaient tatoués (76,5%). L’unique patient infecté par le génotype 2 avait reçu une transfusion sanguine. Conclusion : La connaissance des génotypes est nécessaire pour la prise en charge des porteurs chroniques de VHC. Au Congo, il y a une prédominance du génotype 4.

Mots clés VHC · Génotypes · Congo Abstract Objective: To identify the genotypes of hepatitis C virus (HCV) in Congo Patients and method: It came with a transverse and descriptive study in blood transfusion centers in two major cities of the Congo (Brazzaville and Pointe-Noire) for a period of 7 months. It concerned regular blood donors and occasional consenting over 18 years, Genotyping was performed by sequencing the NS5B region at the virology laboratory UMR 190 Medical Marseille 2. Results: In seven months, 17351 blood donors were collected. The serology of hepatitis C virus (HCV) was positive in 721 cases, a relative frequency of 4.2%. The relative frequency was 4.1% in Brazzaville and 4.3% in Pointe-Noire. Among the 721 HCV positive, 74 patients were included, 59 men (79.3%) and 15 women (20.7%). The average age was 31.5±7.6 years, with extremes ranging from 18 to 52 years. The tattoo was the factor most common risk (44.6%) followed by transfusion risk (36.6%). Of the 74 HIV-positive, 17 were positive by PCR, or 22.97%, including 16 of genotype and 1 genotype 2. The majority of genotype 4 patients were tattooed (76.5%). The only infected with genotype 2 subject had received a blood transfusion. Conclusion: Knowledge of genotypes is necessary for the management of chronic HCV carriers. In the Congo, there is a predominance of genotype 4. Keywords HCV · Genotypes · Congo

B. I. Atipo-Ibara (*) · Deby-Gassaye · F. Bossali · J. R. Ibara Département de médecine, Faculté des Sciences de la Santé de l’Université Marien Ngouabi Brazzaville, Congo e-mail : [email protected];[email protected] B. I. Atipo-Ibara · J. Mimesse · Deby-Gassaye · C. Ahoui-Apendi · R. S. Ngami · J. R. Ibara Service de gastroentérologie et de médecine interne, CHU de Brazzaville, Congo A. Bokilo-Dzia Centre national de transfusion sanguine, Brazzaville, Congo

Introduction Le diagnostic de l’hépatite à VHC passe par la détection de l’ARN du génome viral par Polymérase Chain Réaction (PCR), la détection des anticorps (Ac) anti-VHC par le test Enzyme-linked Immunosorbed Assay (ELISA) [1]. Le VHC présente, comme d’autres virus à ARN, une grande variabilité génétique se traduisant, d’une part au

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niveau des populations par une distribution en génotypes et en sous types, et d’autre part au niveau des individus par une distribution en quasi-espèces [2]. Actuellement, on décrit plusieurs génotypes, dont les plus fréquemment rencontrés sont : 1, 2, 3, 4, 5 et 6. Leur rôle est important dans la réponse au traitement et la durée du traitement. Le génotype 4 est fréquemment rapporté par des travaux réalisés dans certains pays africains (Cameroun, Gabon, Côte d’Ivoire, République Centrafricaine, Egypte), tandis que le génotype 5 a été localisé en Afrique du Sud et reste relativement rare [3]. Le génotype 6 est essentiellement localisé dans les pays d’Asie du Sud-Est [4]. Au Congo, le profil des génotypes du VHC n’est pas connu. L’objectif de ce travail a été d’identifier les génotypes du virus de l’hépatite C au Congo.

Patients et méthodes Il s’est agi d’une étude transversale et descriptive allant de novembre 2010 à mai 2011 soit une période de 7 mois. Les données épidémiologiques ont été recueillies dans les Centres Interdépartementaux de Transfusion Sanguine (CIDTS) de Brazzaville et de Pointe Noire. Les prélèvements ont été analysés au Laboratoire de virologie UMR 190 de la faculté de Médecine de la Méditerranée de Marseille 2. L’Unité des Virus Emergents, Unité Mixte de Recherche (UMR 190) de Marseille, est un laboratoire qui dispose de moyens techniques adaptés parmi lesquels un laboratoire « P3 », et « P2 », des plateaux d’imagerie cellulaire, de biologie moléculaire, une animalerie. Il existe des accords de coopérations entre ce laboratoire et le Centre National de Transfusion Sanguine du Congo (CNTS). La population cible de notre étude a concerné les donneurs de sang dans les centres de Pointe Noire et de Brazzaville. Les sujets inclus ont été ceux ayant un résultat positif de l’anticorps anti-VHC parmi les donneurs de sang, âgés de plus de 18 ans et ayant accepté de participer volontairement à l’étude après lecture et approbation de la fiche de consentement. Les sujets perdus de vue après un résultat positif et ceux refusant de participer à l’étude n’ont pas été inclus dans l’étude. L’échantillonnage s’est fait par méthode aléatoire simple parmi les donneurs répondants aux critères d’inclusion. La taille de notre échantillon était de 74 patients VHC positifs consentant à l’étude. Après chaque don de sang, la recherche des marqueurs viraux (Ac anti-VHC, AgHBs et le VIH) est réalisée de façon systématique. La recherche de l’Ac anti-VHC s’est

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faite par la technique MONOLISA VHC Ag/Ab Ultra au laboratoire du CNTS de Brazzaville. C’est une technique immuno-enzymatique permettant la détection de l’antigène et de l’anticorps du virus de l’hépatite C dans le sérum des donneurs. Nous avons répertoriés tous les donneurs positifs, à partir du registre des donneurs qui contient les numéros de téléphones et les adresses. Ensuite nous avons convoqué les donneurs positifs, soit par téléphone soit après être rendu à leur domicile. Après avoir obtenu le consentement de chaque donneur, nous avons recueillis les données épidémiologiques sur une fiche d’enquête élaborée uniquement pour l’étude. Le prélèvement sanguin a été effectué sur un tube sec de 4 ml avec gel séparateur. Le tube a été immédiatement centrifugé pendant 5 minutes à 5000 tours/minute. Celle-ci a permis d’obtenir deux compartiments séparés par le gel : sérum et le culot globulaire. Les tubes ont été congelés à 80°c. Les échantillons de Pointe-Noire ont été transportés à Brazzaville par avion dans la carboglace. Le transport a duré 1 heure. Arrivés à Brazzaville, les échantillons ont été transportés en France (Marseille) par avion dans la carboglace contenant l’azote liquide en soute. Le transport a duré 10 heures. A l’arrivée, les échantillons frais ont été conservés à -80° jusqu’au jour de l’analyse. Les variables épidémiologiques ont été : le sexe, l’âge, les facteurs de risque de transmission (tatouages, transfusion sanguine, piercing, toxicomanie IV, scarification, transmission verticale, risque sexuel, antécédent de chirurgie, blessure accidentelle par aiguille de prélèvement. La variable biologique était le génotype des souches de VHC. Pour les échantillons ayant des charges virales faibles, nous avons réalisé une ultra concentration (UC) à partir de 1 ml de sérum centrifugé pendant une heure à 17 000 tours/ minute. L’extraction virale a été réalisée à partir de 200 μl de sérum en utilisant le mini kit virus Qiagen® sur l’automate EZ1. Le volume d’élution était de 60 μl. Nous avons fait la PCR de la NS5B qui est une protéine de 68 Kda qui correspond à l’ARN polymérase ARN dépendante indispensable à la réplication de l’ARN viral. Les amorces reçues lyophilisées étaient diluées au 1/100e (10 μL d’amorce + 990 μL d’eau, répartie en 4 aliquotes de 250 μL. Les aliquotes étaient conservés à -20°C. Nous avons déposé 6 μL d’échantillon sur gel d’agarose de 2% (2 g pour 100 mL) dans du tampon TAE (Tri Acétate EDTA) 0.5X (50 mL de TAE 10X dans 1 L d’eau) + 6 μL de BET (Bromure d’EThidium). La dilution été faite au 1/5e (10 μL des extraits purifiés + 40 μL d’eau). Nous avons utilisé les mêmes amorces que celles utilisées pour la RT-PCR. Le protocole était le suivant : mettre 6 μL de Mix des amorces + 4 μL d’échantillon dilué. A la fin de la PCR de séquençage, nous avons purifié les séquences et utilisé le séquenceur 3100.

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Les séquences ont été corrigées sur le logiciel Sepscape©. Ensuite, nous avons fait un alignement des séquences sur le logiciel CLUSTALX© et la phylogénie, était faite sur le logiciel MEGA2©. Nous avons fait un blast sur le site NCBI (http:/blast ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) pour connaitre les génotypes de nos séquences. La saisie des données a été faite à l’aide du logiciel EPIDATA© 3.1. Le logiciel EPI info© 6.04 a permis l’analyse des données. Les p-values ont été calculées en utilisant le test de Chi deux (χ2). Le seuil de signification a été inférieur ou égal à 0,05.

Résultats Durant les 7 mois d’étude la population générale était constituée de 17 351 donneurs de sang pour les deux départements. Les sujets de sexe masculin ont représenté 86,9% et ceux de sexe féminin 13,1%. Parmi ces donneurs nous avons identifié 721 VHC positifs à la technique ELISA soit une fréquence de 4,2%. La fréquence de Brazzaville était de 4,1% et celle de Pointe-Noire était de 4,3%. L’échantillon de notre étude était constitué de 74 VHC positifs soit une fréquence de 10,3% des 721 VHC positifs. Les 74 patients VHC positifs retenus étaient constitués de15 femmes (20,7%) et 59 hommes (79,3%), soit un sexratio de 4,6. Le génotype était fait chez 17 des 74 VHC positifs, soit 23%. L’âge moyen était de 31,56 ± 7,26 ans avec des extrêmes de 18 et 52 ans. La tranche d’âge de 30-39 ans était la plus représentée avec un effectif de 36 soit 48,6%. Les facteurs de risque de transmission étaient le tatouage, la transfusion sanguine la transmission verticale (antécédent de VHC chez les parents), chez 5 patients, soit 6,8%. Nous avons obtenu après séquençage des 17 échantillons, 16 génotypes 4 (G4) et 1 génotype 2 (G2). La répartition des génotypes en fonction des facteurs de risque présumés est représentée dans le tableau 1.

Aucun patient n’avait une notion de piercing, pas d’antécédent de toxicomanie intraveineuse, ni d’antécédent de blessure accidentelle à l’aiguille.

Discussion Notre étude n’a pas un caractère épidémiologique et notre effectif réduit nécessite de confirmer nos résultats à plus grande échelle. Nous avons réalisé le génotypage par séquençage de la région NS5B, par ce qu’elle demeure la meilleure méthode pour l’investigation moléculaire visant une caractérisation plus complète des souches virales. Nicot et al en France [5] avaient utilisé la même technique, ainsi que Ndong et al [6]. La fréquence du VHC dans la population générale (Brazzaville et Pointe-Noire) de notre étude était de 4,2%. Elira et al en avaient trouvé 3,6% dans la population des donneurs de sang en 2001 [7]. Cette différence pourrait s’expliquer par une rupture de la réalisation de sérologie pendant 3 mois au cours de leur étude en raison des événements sociopolitiques que subissait le Congo pendant leur période d’étude. Notre séroprévalence reste élevée plaçant le Congo dans l’une des zones de forte endémicité mondiale selon l’OMS [8]. Durant notre d’étude, l’effectif des VHC positifs retenus était majoritairement représenté par les hommes. Elira et al [7] avaient trouvé la même prédominance masculine de l’ordre de 81% contre 19% des femmes. Ceci vient du fait que dans les CIDTS, les donneurs sont majoritairement des hommes. Ceci pourrait s’expliquer par les multiples contreindications au don de sang chez les femmes (allaitement, menstruations, gestation). Le tatouage était le facteur de risque le plus fréquent dans notre série, touchant la tranche d’âge de 30 à 39 ans. Ce résultat est similaire à celui de Ndong et al au Gabon [6], où le tatouage représentait le premier facteur de transmission dans leur étude ainsi que Ndjomou et al au Cameroun [9]. La transfusion représentait le premier facteur de risque de

Tableau 1 Répartition des génotypes en fonction des facteurs de risque (n=17). Facteurs de risque

Transfusion sanguine Toxicomanie intraveineuse Tatouage Scarification Relations sexuelles Antécédent de chirurgie Transmission verticale

G2

p

G4

Effectif

%

Effectif

%

Total

0 2 1 0 1 0 0

0 2,7 5,9 0 5,9 0 0

9 72 13 2 8 1 1

52,9 97,2 92,4 11,8 47,1 5,9 5,9

9

0,518

14 2 9 1 1

0,643 0,579 1 0,715 0,715

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transmission du VHC chez ces auteurs et il était diversement apprécié. La signification du tatouage est très différente dans notre pays de celle des pays occidentaux. Au Congo, dans les années 70 et 80, le tatouage était à la mode et représentait un symbole de grande valeur dans la jeunesse. Il est fort probable que les conditions de stérilisation du matériel utilisé n’étaient pas adéquates à cette époque, ce qui pouvait être une source de contamination majeure. Au cours de notre série le génotype 4 était prédominant par rapport au génotype 2. Ndong et al [6] avaient trouvé une prédominance du génotype 4, Mcomish et al [10] en Egypte avaient trouvé uniquement le génotype 4 dans la population des donneurs de sang, Nicot et al [5] en France avaient trouvé une prédominance pour le génotype 1. Les sujets infectés par le génotype 4 dans leur étude, étaient pour la majorité des immigrants africains. Le génotype 2 était retrouvé chez un seul sujet. Ndjomou et al [9] avaient trouvé une prédominance du génotype 1, le génotype 2 venait en second rang. Dans notre série les sujets infectés par le génotype 4 étaient majoritairement des hommes, ce constat a été aussi fait par Ndjomou et al au Cameroun [9]. Les C infectés par le génotype 4 et l’unique patient infecté par le génotype 2, avaient une notion de tatouage, qui par le phénomène de mode, devient de plus en plus pratiqué au Congo sans prendre les précautions d’asepsie. La transfusion sanguine a été retrouvée chez les patients infectés par le génotype 4, le seul patient infecté par le génotype 2 n’avait pas une notion de transfusion sanguine. Il se pose toujours le problème de la sécurité transfusionnelle dans les pays en développement, surtout ceux ayant connus des guerres civiles. Aucun des patients porteurs du génotype 4 ou 2 n’avaient un antécédent de toxicomanie. Ces résultats sont similaires avec ceux de Ndjomou et al [9]. Nicot et al [5] avaient retrouvé la toxicomanie comme première source de contamination pour les sujets infectés par le génotype 4. La toxicomanie par voie intraveineuse est peu courante dans notre pays. Deux patients infectés par le génotype 4 avaient une scarification, pour Ndong et al [6], la scarification représentait le deuxième facteur de risque de transmission. La scarification représente une pratique courante dans les pays d’Afrique centrale. Elle est réalisée d’une part dans un but

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thérapeutique et d’autre dans un but spirituel ce qui pourrait être une source de transmission. Le piercing, la blessure accidentelle à l’aiguille, n’avaient pas été retrouvés. Les auteurs d’Afrique centrale [6,9] n’avaient pas retrouvé les mêmes résultats, même si la déclaration des accidents d’expositions aux produits sanguins n’a pas un caractère obligatoire dans la sous-région ; aussi certaines pratiques esthétiques diffèrent d’une région à une autre.

Conclusion La connaissance des génotypes est nécessaire pour déterminer la posologie et la durée du traitement. Les résultats obtenus, après la réalisation du séquençage de la région NS5B, indiquent que le génotype 4 est prédominant au Congo. Cependant dans un proche avenir, le traitement de l’hépatite C pourrait être non génotype dépendant, ceci grâce aux molécules de deuxième génération en développement qui possèdent une efficacité complète sur les virus de génotypes 1, 2, 4, 5 et 6 et une efficacité partielle sur le génotype 3.

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