Z Rheumatol 61:Suppl 2, II/1–II/5 (2002) DOI 10.1007/s00393-002-1201-0

E. Kunisch D. Pohlers S. Dunger R. Huber A. Kreusch B. Wiederanders R. W. Kinne

What can experimental research offer to rheumatology today – the viewpoint of molecular biology? Contribution of molecular biology to pathogenesis research in rheumatology using the example of rheumatoid arthritis

Dr. rer. nat Elke Kunisch Dr. rer. nat. Dirk Pohlers Sandra Dunger · René Huber Priv.-Doz. Dr. Raimund W. Kinne ()) Nachwuchsgruppe Experimentelle Rheumatologie Friedrich-Schiller-Universität Jena Bachstr. 18 07745 Jena, Germany Tel.: + 49/36 41 / 65 71 50 Fax: + 49/36 41 /65 71 52 E-Mail: [email protected] Prof. Dr. med. Annett Kreusch Prof. Dr. med. Bernd Wiederanders Institut für Biochemie I Friedrich-Schiller-Universität Jena, Germany Die aufgeführten Arbeiten wurden durch das BMBF-Projekt „Fortsetzung der Aufbauförderung für die Gesundheitsforschung in den Neuen Bundesländern“, IZKF der FSU Jena (FKZ: 01 ZZ 9602) sowie das Projekt „Einsatz von „Chip“ (Filter)- und Mikro-Array-Systemen zur vergleichenden Genanalyse in Fibroblasten und Entzündungszellen aus verschiedenen Organen“ des Thüringer Ministeriums für Wissenschaft, Forschung und Kunst (FKZ: B 311-00026) gefördert. René Huber ist Stipendiat der Studienstiftung des Deutschen Volkes Sandra Dunger ist Empfängerin eines Graduiertenstipendiums des Landes Thüringen

EXPERIMENTELLE FORSCHUNG UND VERSORGUNG

Was kann die experimentelle Forschung der Rheumatologie heute bieten – die Sichtweise der Molekularbiologie? Beitrag der Molekularbiologie zur Pathogeneseforschung in der Rheumatologie am Beispiel der Rheumatoiden Arthritis

n Zusammenfassung Die Molekularbiologie spielt eine zunehmende Rolle bei der Entwicklung von innovativen Ansätzen zur Analyse der Pathogenese von rheumatischen Erkrankungen sowie zur Verbesserung der Diagnose und Therapie dieser Krankheiten. Einige solcher Ansatzpunkte/Techniken haben in der letzten Zeit wichtige Erkenntnisse erbracht, z. B. die Analyse 1) von Chromosomenveränderungen (numerische und z. T. strukturelle Aberrationen in synovialen Fibroblasten/Makrophagen bei chronischen Gelenkentzündungen); 2) der Zellklonalität (oligoklonale Expansion von synovialen T-Zellen, B-Zellen, aber auch Fibroblasten); 3) der Bedeutung genetischer Faktoren (Genomweites Screening für Arthritis-Suszeptibilitätsgene); 4) von Mutationen in Schlüsselgenen von Zellzyklus/ Funktion (Mutationen in p53 und Proto-Onkogenen in der entzündeten Synovialmembran); und 5) von Genexpressionsmustern (z. B. durch „High-density microarrays“, „Custom arrays“, in situ Hybridisierung und real-time PCR). Es ist zu erwarten, dass aus diesen Analysen zentrale neue Erkenntnisse zum Verständnis der pathogenetischen Grundlagen von chronischentzündlichen rheumatischen Erkrankungen gewonnen werden, mit dem Potential, differentialdia-

gnostische Kriterien für die bisher sehr heterogenen Krankheitsbilder zu entwickeln und die Basis für individual-orientierte Therapie zu schaffen. n Summary Molecular biology plays an increasing role for the development of innovative approaches to analyze the pathogenesis of rheumatic diseases and to improve diagnosis and therapy of these disorders. Some of these approaches/techniques have recently yielded important results, e.g. the analysis of 1) chromosomal aberrations (numerical and, in part, structural aberrations in synovial fibroblasts/macrophages from chronic joint inflammation); 2) cell clonality (oligoclonal expansion of synovial T-cells, B-cells, but also fibroblasts); 3) the importance of genetic factors (genome-wide screening for arthritis susceptibility genes); 4) mutations in key genes of cell cycle and/or function (mutations in p53 and proto-oncogenes in the inflamed synovial membrane); and 5) gene expression patterns (e.g. by highdensity microarrays, custom arrays, in situ hybridization, and real-time PCR). It can be expected that these analyses will result in central new findings concerning the understanding of the pathogenetic basis of chronic inflammatory rheumatic diseases, with the

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potential to develop differential diagnostic criteria for these hitherto extremely heterogeneous diseases, and to create the basis for individual-oriented therapy.

n Schlüsselwörter Rheumatoide Arthritis – Molekularbiologie – Chromosomen – Mutationen – PCR

Einleitung Von der rheumatoiden Arthritis (RA) sind ca. 1–3% der Bevölkerung in den industrialisierten Ländern betroffen. Im Zentrum der klinischen Symptome der RA steht die chronische Entzündung der Gelenke und die fortschreitende Zerstörung von Knorpelund Knochengewebe, die zu einem vollkommenen Funktionsverlust der Gelenke führen kann. Dies hat zur Folge, dass nach einer Erkrankungsdauer von 20 Jahren die meisten RA-Patienten nicht mehr arbeitsfähig sind. Außerdem haben RA-Patienten ein erhöhtes Risiko von Begleiterkrankungen und eine verringerte Lebenserwartung (4). Die Pathogenese der Autoimmunerkrankung RA ist trotz intensiver Forschung nach wie vor ungeklärt. Neben der sogenannten „molecular mimicry“ Theorie, d. h. einer angenommenen Kreuzreaktivität zwischen (Auto)-Antigenen und viralen oder bakteriellen Peptiden, ist eine genetische Prädisposition der Erkrankung unumstritten, da z. B. die Frequenz und der Schweregrad der Erkrankung mit der Expression bestimmter Allele des Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse II korreliert (4). Die einzelnen Zelltypen in der Synovialmembran leisten einen unterschiedlichen Beitrag zu der Erkrankung (11). Die Autoimmunreaktion in der RA wird wahrscheinlich von T-Zellen, B-Zellen und dendritischen Zellen getragen. Synoviale Makrophagen (M) könnten sowohl durch Einschleppen von Mikroorganismen oder antigenem Material einen direkten Beitrag zu Entstehung/Verlauf der Erkrankung leisten. Sie tragen aber auch durch die Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen zum Entzündungsgeschehen und durch die Bildung von proteolytischen Enzymen zur Knorpel- und Knochendestruktion bei (12). Weiterhin sind die synovialen Fibroblasten (SFB) maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt. Diese Zellen, die durch eine veränderte Morphologie sowie die Expression bestimmter Marker gekennzeichnet sind (21, 28), zeigen in der RA einen aktivierten Phänotyp, der durch eine erhöhte Expression von ProtoOnkogenen wie c-fos, jun B, egr-1 und c-myc induziert wird. Diese erhöhte Expression deutet auf eine langanhaltende, starke Stimulierung der Zellen mit nachfolgender Aktivierung von Zielgenen wie matrixabbauenden Enzymen hin (13, 14).

n Key words Rheumatoid arthritis – molecular biology – chromosomes – mutations – PCR

In den letzten Jahren verdichteten sich die Ergebnisse/Anzeichen, dass neben einer exogenen Stimulierung der SFB durch Mediatoren von Entzündungszellen bzw. Zell-Zell-Kontakt mit M oder T-Zellen eine endogene Stimulierung der Zellen auf der Basis von Mutationen in funktionellen Schlüsselgenen oder durch retrovirale Infektionen für die Ausbildung des aktivierten Phänotyps der RA-SFB eine wichtige Rolle spielt (3, 24). So wurden in RA-SFB Mutationen in dem Tumorsupressor p53 beschrieben und deren Bedeutung für die gelenkdestruktiven Fähigkeiten von RA-SFB inzwischen ausführlich charakterisiert (6, 14, 24, 27). Aufgrund der hohen volkswirtschaftlichen Kosten (verursacht durch Behandlungskosten und Arbeitsunfähigkeit der Patienten) sowie durch den enormen Leidensdruck für den Patienten hat die Aufklärung der Pathogenese der RA und die Etablierung von differentialdiagnostischen Kriterien nach wie vor höchste Priorität. Dabei spielen etablierte und innovative molekularbiologische Methoden eine entscheidende Rolle. Welche Beiträge können diese Methoden zum Verständnis der RA erbringen?

Analyse von Chromosomenveränderungen Im Synovialgewebe und in SFB oder synovialen M (frühe Passagen) von Patienten mit RA, OA und anderen entzündlichen Gelenkerkrankungen wurden vergleichbare chromosomale Aberrationen detektiert (verschiedene Trisomien, insbesondere von Chromosom 7). Obwohl diese Veränderungen möglicherweise eine funktionelle Bedeutung für die pathologische Rolle von SFB und synovialen M in der RA haben, stellen sie daher eher eine allgemeine Antwort auf chronischen entzündlichen Stress in rheumatischen Erkrankungen als eine spezifische Veränderung in der RA dar (15, 16).

Analyse von Klonalität Eindeutige Hinweise auf eine mono- bzw. oligoklonale Expansion von SFB in der RA wurden sowohl durch Untersuchungen zur „X-linked inactivation“

E.. Kunisch et al. Was kann die experimentelle Forschung der Rheumatologie heute bieten

bestimmter Gene (10) als auch durch Mini/Mikrosatelliten-Analysen erbracht (29; Kooperation mit Priv. Doz. C. Hardt, Prof. J. Epplen, Institut für Humangenetik, Universität Bochum). Allerdings war diese Expansion nicht immer spezifisch für die RA, sondern wurde auch in der Osteoarthritis und im Morbus Bechterew beobachtet (29). Die Bedeutung dieser Befunde ist aber unklar, da bei dem Nachweis von mesenchymalen Stammzellen bereits im normalen peripheren Blut (30) und in der normalen Synovialmembran (1) die oligoklonale Expansion von SFB in der Gelenkentzündung entweder einen beschleunigten physiologischen Prozess darstellen oder der Vorbereitung der eigentlichen entzündlichen Infiltration dienen könnte (18). Weder die Analyse von Chromosomenveränderungen noch die Analyse von Klonalität ergaben bisher einen eindeutigen Zusammenhang mit der Pathogenese der RA. Vielversprechender für die Klärung dieser Frage erscheinen die Ergebnisse aus der Analyse von genetischen Faktoren, Mutationen in Schlüsselgenen und der Genexpression.

Bedeutung genetischer Faktoren (Arthritismodelle und humane RA) Durch Genom-weites Screening für Arthritis-Suszeptibilitätsgene konnte in verschiedenen Arthritismodellen (z. B. Kollagen-induzierte Arthritis, Pristan-induzierte Arthritis, Proteoglykan-induzierte Arthritis) aber auch in Kollektiven von Patienten mit RA eine Reihe von Genregionen identifiziert werden, die eine Assoziation mit dem Auftreten der Arthritis bzw. der Schwere der klinischen Symptome in der akuten oder chronischen Phase aufweisen. Die Regionen zeigen in den verschiedenen Spezies eine auffällige Ko-Lokalisation und es besteht die Hoffnung, mit neuen, schnelleren Herstellungstechniken für genetisch veränderte Mäuse (sogenannte „Speed congenics“) die relevanten Genregionen schnell einzuengen und einzelne pro- oder anti-arthritische Gene zu identifizieren (8, 19, 26).

Mutationen in Schlüsselgenen Mutationen in Schlüsselgenen von Zellzyklus bzw. Zellfunktion, z. B. Tumorsuppressorgenen und ProtoOnkogenen, stellen eine attraktive Erklärung für eine veränderte Expression pro-inflammatorischer und anti-inflammatorischer Moleküle dar. Nach den initialen Veröffentlichungen über Mutationen in den Genen für p53, H-ras und Hypoxanthin-Guanin

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Phosphoribosyltransferase (17, 24, 27) konnten in eigenen Untersuchungen Missense-Mutationen in der kodierenden Region von verschiedenen jun/fos-Proto-Onkogenen detektiert werden (2, 3). Die funktionelle Bedeutung solcher Mutationen für die SFB, die im Falle von dominant negativen p53-Mutationen bereits belegt wurde (6), muss aber noch endgültig analysiert werden.

Genexpression n High-density microarrays Durch die simultane Analyse der Expression einer großen Anzahl von Genen (idealerweise des kompletten humanen Genoms) wird der Einsatz dieser jungen Technologie in der nächsten Zukunft ein besseres Verständnis der Pathogenese der RA ermöglichen sowie die diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten optimieren helfen (7). Trotz der berechtigten, hohen Anforderungen an die Reproduzierbarkeit der Methoden, die statistische Analyse, die Probenauswahl und die Validierung der Ergebnisse mit einer unabhängigen Methode (5) sind erste interessante Daten mit dieser Technologie erhoben worden (22, 25). In eigenen Untersuchungen wurde inzwischen die Genexpression in der Synovialmembran und den daraus isolierten SFB, M, sowie nicht-adhärenten synovialen Zellen und synovialen T-Zellen (28) mittels High-density oligonucleotide microarrays bestimmt und verglichen. Aus diesen Ergebnissen wurden Algorithmen entwickelt, die eine Zusammensetzung des Genexpressionsprofils der RA Synovialmembran aus der Genexpression der isolierten Zellen und damit eine Abschätzung der relativen Prozentsätze der einzelnen Zelltypen im Gewebe erlauben.

n Custom arrays Nach der anfänglichen Hochdurchsatz-Analyse mit High-density microarrays wird sich eine zweite Phase mit Custom arrays anschließen, die auf eine begrenzte Anzahl von pathogenetisch relevanten Genen fokussiert sind und damit eine einfachere und kostengünstigere Analyse einer großen Anzahl von normalen und pathologischen Proben ermöglicht. Mit solchen Systemen konnte in unserem Labor bereits die differentielle Expression von Proteasen-Inhibitoren in SFB aus der RA und der Osteoarthritis belegt werden (20).

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Abb. 1 Die Kombination von Ergebnissen aus der Analyse von Suszeptibilitätsgenen, der Genexpression und von Mutationen in Schlüsselgenen wird in Zukunft den Hauptbeitrag zum Verständnis der pathologischen Grundlagen der RA liefern. Perspektivisch können daraus nach entsprechender Validierung auch differentialdiagnostische Kriterien abgeleitet werden

n In-situ-Hybridisierung/real-time PCR Diese Techniken sind weiterhin unverzichtbar, einerseits um die Genexpression in komplexen Geweben

einzelnen Gewebsregionen bzw. Zelltypen zuzuordnen (13), andererseits um die Ergebnisse aus Highdensity microarrays und Custom arrays im Sinne der o. a. Anforderungen in Gewebeproben und isolierten Zellpopulationen zu validieren. In eigenen Untersuchungen erwies sich dabei die quantitative Real-time PCR der konventionellen, semiquantitativen PCR in puncto Präzision und Reproduzierbarkeit als deutlich überlegen, allerdings auch als ca. 4-mal teurer (9). Zusammenfassend ist festzustellen, dass sowohl innovative und als auch bewährte molekularbiologische Methoden einen wesentlichen Beitrag zur weiteren Erforschung der Pathogenese von chronischentzündlichen rheumatischen Erkrankungen liefern können, insbesondere wenn der Bezug zur in vivo Kranheitssituation des Patienten sowie eine deutliche Orientierung an einer Hypothesen-getriebenen Forschung erhalten bleibt (Abb. 1). Allerdings muss im diagnostischen Bereich damit gerechnet werden, dass bis zur vollständigen Aufklärung sämtlicher Pathomechanismen auch Mustererkennungen (z. B. Genexpressionsmuster) zur Verbesserung der Diagnose und Differentialdiagnose herangezogen werden können (7, 23).

n Danksagung Wir danken Frau Dr. Ernesta Palombo-Kinne für die kritische Durchsicht des Manuskriptes sowie Frau Priv.-Doz. Dr. Cornelia Hardt und Prof. Dr. Jörg Epplen, Institut für Humangenetik, Ruhr-Universität Bochum, für die Durchführung der Mikrosatelliten-Analysen in SFB.

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