Zeitschrift fiir Zellforschung 79, 507--536 (1967)

Zum Feinbau der Mitochondrien in normalen und durch Vitalfarbstoffe beeinfluBten Miiuse-Ascitestumorzellen* ** n . WIIgKLER Anatomisches Institut der Universit~t Freiburg i. Br. Eingegangen am 17. Februar 1967

Summary. The influence of the vital-dyes: Neutral Red, Acridine-0range and 9-AminoAcridine on the ultrastructure of mitochondria in mouse-ascites-tumour-cells was investigated by means of the electron-microscope. All the changes observed were found to depend obviously on the concentration of the dyes, which, however, caused no single or substrate-specific alterations, but moreover a certain variety of different changes characteristic for each of the dyes. - Higher concentrations of vital-dyes caused the disappearance of peripheral mitochondria. Connections between mitochondria and the endoplasmic reticulum are frequent, while direct communications between the intramitochondrial spaces and the endoplasmic reticulum has never been found. The significant correlation between nucleus and mitochondria might probably influence the transfer of substances from the nucleus into the cytoplasma (and vice versa). The finding that these interrelations are more prominent after application of vital-dyes seems to point to a certain rSle mitochondria might play in this field. I. Einleitung W e r sich m i t Hilfe e l e k t r o n e n m i k r o s k o p i s c h e r M e t h o d e n m i t d e r E i n w i r k u n g molekular-disperser, k a t i o n i s c h e r Vitalfarbstoffe auf die U l t r a s t r u k t u r d e r Zelle befal3t, ~4rd n i c h t e r w a r t e n kSnnen, die b e n u t z t e n F a r b s t o f f e selbst zur D a r stellung zu bringen, d a ihre Molekiildurchmesser aul3erhalb des AuflSsungsvermSgens des E l e k t r o n e n m i k r o s k o p s liegen. D e n n o c h sollten d e r a r t i g e U n t e r s u c h u n g e n aus folgenden Grfinden m e h r A u f m e r k s a m k e i t als bisher linden: 1. erfahren wir Vorg/inge infolge der E i n w i r k u n g von P h a r m a k a - - ihnen k a n n m a n in gewisscnl Sinn die Vitalfarbstoffe z u o r d n e n - - , deren E i g e n s c h a f t e n verh/iltnism/if~ig g u t b e k a n n t sind u n d fiber deren W i r k u n g s o r t e u n d -weisen einige, wenn auch unzureichende B e o b a c h t u n g e n vorliegen, 2. lie fern wir d e m V i t a l m i k r o s k o p i k e r Befunde, die vielleicht geeignet sind, einige P r o b l e m e in einem neuen L i c h t zu sehen. Soweit es die unserer S t u d i e z u g r u n d e liegenden F a r b s t o f f e angeht, n a h m m a n bislang an, d a b ihre A u s w i r k u n g e n auf das u l t r a m i k r o s k o p i s c h e Zellbfld ziemlich ,,oligomorph" sind (vgl. SCtIMIDT, 1961, 1962; STOCKI~G~R, 1964; WITTEKIND, 1965; u.a.). D a s Interesse r i c h t e r sich v o r allem auf die intrazellul/~re V e r a r b e i t u n g und A n r e i c h e r u n g der Vitalfarbstoffe in pr/iformierten oder n e u g e b i l d e t e n G r a n u l a * Das dieser Studie zugrunde liegende Material stammt aus einer Versuchsreihe yon J. STAUBESAND und D. WITTEKIND, fiber die an anderer Stelle berichtet wird. Den Herren Professoren Dr. STXUB~.SANDund Dr. WITTEKIND danke ich ffir ihre Unterstfitzung bei der Durchffihrung meiner Untersuchungen. * * Herrn Prof. Dr. E. RVSKA zum 60. Geburtstag gewidmet. 34 z. Zellforsch.,Bd. 79

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R. WINKLER:

oder Vakuolen. Uber die Mitochondrien linden sich nur relativ sp/irliche Mitteilungen, so bei SCHMIDT (1961, 1962), der Schwellung, Anseinanderdr/~ngung und Verkfirzung der Cristae feststellte und WEISS (1955), der nach subletalen Dosen von Neutralrot eine vakuol/~re Degeneration und Transformation der Mitochondrien in argyrophile, sudanophile und osmiophile Granula beobachtete. Detaillierte Angaben fiber das Verhalten der Mitochondrien nach Einwirkung kationischer Vitalfarbstoffe fehlen in der uns zug/~nglichen Literatur jedoch vSllig. Dies ist umso erstaunlicher, als schon relativ frfihzeitig die Beziehungen zwischen dem Ausfall der Vitalf/~rbung und dem energetischen Zustand der vital zu f~rbenden Zelle bekannt waren (vgl. NASSO:NOV,1930 ; ALEXANDROW, 1933 ; MARKAROV, 1933 ; KEDROWSKY, 1935, 1937). Auf die ohnehin gut bekannte Morphologie der Ascites-Tumorzellen soll in diesem Zusammenhang nicht eingegangen werden (vgl. SELBY, 1953; SELBY U. Mitarb., 1956; WESSEL und BERNHARD, 1957 ; BRAUn, 1958 ; WESSEL, 1959; KLUG, 1961; u.a.). Soweit andere Zellorganellen im Zusammenhang mit Besonderheiten der Mitochondrien von Interesse sind, werden sie berficksichtigt. Die beachtlichen Ver/~nderungen im Kernraum unter der Wirkung der angewandten Vitalfarbstoffe sollen Gegenstand einer sp~teren Mitteilung sein (WINKLERund STAUBESAND,in Vorbereitung). II. Material und Methode ]~ber Implantation des Ascitescarcinoms, Letalit~t der Versuchstiere, Gewinnung und Aufarbeitung der Asciteszellen wird von STAUBESAND,WITTE~:IND,RENTSCItund WI57KLER(in Vorbereitung) berichtet. Folgende Versuchsgruppen wurden gebildet: a) 2 • 50 mg Neutralrot (~ NR), b) 4 • 50 mg NR, c) 4 mg Akridinorange (~ AO), d) 2 • 4 mg AO, e) 2 mg 9-AminoAkridin (~ 9-NH2-A), f) 3 • 9-NH~-A, g) 4 • 9-NH2-A, h) 5 • 9-NH~-A, i) 2 Kontrollgruppen. Die Farbstoffe wurden intraperitoneal appliziert. Fixation in 1% 0sO4 nach Palade, Einbettung in Vestopal, Kontrastierung mit Uranylacetat. Anfertigung der Schnitte mit dem Porter-Blum-Mikrotom und dem Ultrotom, Aufnahmen mit dem Elektronenmikroskop EM 9 (Zeiss).

III. Befunde Mit einer Ausn.ahme gibt es fiir die yon uns festgestellten Variationen im Feinbau der Mitochondrien zahlreiche Literaturbelege. Soweit wie m6glich, haben wir diese Arbeiten geprfift, um Anhaltspunkte zur Deutung der yon uns festgestellten Besonderheiten zu finden. Wo dies der Fall ist, werden wir in der Diskussion darauf zurfickkommen; im fibrigen werden wir aber bei der Besprechung der verschiedenen Strukturvarianten auf die diesbezfiglichen Literaturstellen nicht eingehen, da eine Reihe ausgezeichneter Zusammenfassungen und l~bersichten diesen Problemkreis betreffen (vgl. u.a. THIEL, 1959 ; ROULLIER, 1960 ; NOWKOFF, 1961 ; DAVID, 1961; OBERLINO und BERNHARD, 1961). U m es vorwegzunehmen: alle beobachteten Varianten kommen auch unter Normalbedingungen vor; was sich jedoch in charakteristischer Weise/~ndert, sind quantitatives Verhalten und Lokalisation innerhalb der Zelle dieser Variationen unter der Einwirkung der untersuchten Vitalfarbstoffe. Demnach aktivieren diese lediglich, das sei besonders betont, in den Mitochondrien existierende Potenzen zur Ausformung bestimmter Eigentfimlichkeiten.

Mitoehondrien und Vitalf~rbung

509

.

a) Die Gestalt der Mitoehondrien Unsere Untersuehungen belegen erneut die auBerordentliche Plastizit/~t und den dadurch bedingten Formenreichtum der Mitochondrien. Normalerweise sind sie kurzst/LbchenfSrmig bis ellipsoidisch mit Durchmessern zwischen 0,5 und 1 ~. Daneben gibt es zahlreiche unregelm/il~ig gestaltete Mitochondrien, alle Grade yon Verkriimmungen bis zum alierdings sehr seltenen Bfld napff5rmiger Mitochondrien, die - - quer g e t r o f f e n - - den Eindruck erwecken kSnnen, als hiitten sie einen Protoplasmatropfen ,,verschlungen". Weiterhin sehen wir hantelfSrmige Mitochondrien mit oft sehr dfinnen Mittelstficken. Schlie$lich seien noch Mitochondrien erw/Lhnt, die infolge der Orientierung ihrer Cristae in L/~ngsrichtung an die yon DAVID (1961) und zusammen mit KETTLER (1961) als ,,kaulquappen"-fSrmig beschriebenen erinnern.

Abb. 1. Riesenmitochondrien. Beachte die relativ dicht stehenden, deutlich parallel angeordneten Cristae und das auffiillig schmale ~uflere Chondrioplasma. Kontrolle. GesamtvergrSl3erung 36000faeh Eine Sonderbildung stellen ungew6hnlich lange, fadenfSrmige Mitochondrien dar, deren L/~ngsdurehmesser 2 ~ im allgemeinen weir iibertrifft, deren Querdurehmesser jedoch nur unwesentlich grSl3er als der normaler Mitoehondrien ist (Abb. 1). Sie unterscheiden sich damit deutlich von den yon WESSEL und B~NHARD (1957) in Aseites-TumorzetIen als Sonderform angesehenen sog. Riesenmitoehondrien, die einen wesentlich grSBeren Querdurehmesser besitzen, entspreehen aber den yon KLUG (1961) in Ehrlich-Ascitestumorzellen beobachteten Organellen. I m Inneren weisen die yon uns beobachteten Mitochondrien eine ffir Ascitestumorzellen auff/~llige Diehte und Regelm/~$igkeit der Cristae bei relativ loekerer Matrix auf (Abb. 1). Es konnte wahrseheinlich gemacht werden, dal3 die normal groSen Mitochondrien nicht Anschnitte soleher fiberlangen Mitochondrien sind. Letztere stellen also ein Sonderform dar; ob sie mit irgendwelchen speziellen Funktionen in Zusammenhang gebracht werden mfissen, kann auf Grund unserer Untersuehungen nicht entsehieden werden. Eine Beziehun~ zu den angewandten Vital/arbstoffen besteht mit Sieherheit nicht. Ebenfalls mul3 offenbleiben, ob sich die normal grol3en 34*

510

R. WIlffKLER: Mitochondrien yon solchen Fadenchondriosomen abschnfiren bzw. sich zu solchen F/iden vereinigen k6nnen. b) Die/~uSere Mitochondrienmembran und ihre Ver/inderungen

Die Mitoehondrien werden - - in Einklang mit der klassisehen Konzeption yon PALADE (1952) und SJSSTRAND (1954) - - Yon zwei elektronendiehten Membranen umhfillt, zwisehen denen sich ein heller Spaltraum - - das /iuSere Chondrioplasma enthaltend (H. RUSKA, 1953) - - befindet. Dieser ist jedoeh bei den Mitoehondrien der Aseites-Tumorzellen in der Regel auffallend schmM (vgl. Abb. 1, 11, u.a.). An anderen Stellen wiederum, u.U. bei demselben Mitochondrium, ist er Abb. 2. Verlust tier mitochondria- deutlich erweitert, so dal3 an der Doppelmembranlen Aul3enmembranen (Pfeile) natur der Hfille kein Zweifel besteht (Abb. 8). bei gut erhaltenen Cristae, die Bei einer geringen Zahl yon Mitochondrien deutlich verdichtet sind. sind die /~uSeren Membranen nur eben ange4 x 50 mg NR. GesamtvergrSBerung 21300fach deutet bzw. erseheinen verwasehen, wiihrend die Cristae excellent seharf dargestellt sind (Abb. 2). Die M6glichkeit, dab es sich hierbei um Mitochondrien handelt, deren Cristae so zu den Hfillmembranen orientiert sind, dal3 bei bestimmter Schnittffihrung die Cristae senkrecht getroffen werden und sich somit scharf darstellen, die ~uf3eren Membranen dagegen mehr oder weniger tangential nnd somit eine verwaschene Zeichnung geben, dfirfte zumindest fiir die Mehrzahl der Beobachtungen aus folgenden Griinden nicht zutreffen: 1. es ist unm6glich, dab sich bei der zuf/illigen Schnittebene stets nur die beiden Extreme: scharfe Cristae, unscharfe Aul3enmembranen und umgekehrt ergeben. Tats/ichlich ist dies aber der Fall, denn Zwischenformen, die der Wahrscheinlichkeit nach am zahlreichsten sein mfil~ten, fehlen praktisch vSllig. 2. Die Cristae erfahren im Verlaufe der vermutlichen Aufl6sung der Hfillmembranen eine zunehmende Verdichtung ihrer Struktur, so dal~ sic sich schlielMich von den ,,intakten" Mitochondrien durch ihre hShere Osmiophilie deutlich abheben (Abb. 2). 3. Nach NR-Einwirkung kommt es zu einer Zunahme des Phgnomens der Au/15sung der Auflenmembranen (Abb. 2). Dagegen sind die Teilunschi~rfen der Mitochondrienmembranen leicht durch die Schnittfiihrung zu begriinden. Sie lassen folglich auch die oben aufgez/ihlten Kriterien vermissen. c) Die inneren Mitochondrienmembranen und ihre Ver/~nderungen Die Normalstruktur der Mitochondrien zeigt das gewohnte Bild parallelisierter Cristae. Diese stehen mi~13ig dicht, ihre Zahl ist nur selten hSher als 4 - - 6 pro Anschnitt. Es entspricht dies dell allgemeinen Erfahrungen mit Krebsmitochondrien. Vielerorts ist der Zusammenhang der Cristae mit dem inneren Blatt der I-Ifillenmembranen deutlich zu erkermen. Oft verlaufen die Cristae nicht gestreckt, sondern

Mitochondrien und Vitalfiirbung

511

Abb. 3a--c. Normale Mitochondriengestalt. W~hrend das intracristale Spatium meist gut ausgebildet ist, l~13t sich die Doppelmembran der Hiillen oft nur schwer nachweisen, a Mitochondrien mit zentralwiirts konvexen Cristae. MAC Kontrolle. Gesamtvergr513erung 22 000fach; b Mitochondrien mit radi/~r gestellten Cristae. 4 mg AO. GesamtvergrSl3erung 22000fach; c Mitochondrien mit konvergierenden Cristae. Kontrolle. GesamtvergrSBerung 28300fach

Abb. 4a--c. Verschiedene Stadien stark gekriimmter Cristae mitochondriales: a Torbogenartige Formationen, 3 x 4 mg 9-NH-2A. GesamtvergrSl~erung 23600fach; b ringfSrmige Cristae. Kontrolle. GesamtvergrSl3erung 21300fach; c konzentrische Cristae, 4 x 50 mg NR, GesamtvergrSflerung 21300fach in leichten BSgen, deren Konvexit/~t nach innen g e r i c h t e t ist, wobei d e r K r i i m m u n g s r a d i u s zentralw~rts z u n i m m t , so d a b die m i t t e l s t ~ n d i g e Cristae in d e r Regel g e s t r e c k t verl/~uft (Abb. 3 a). A b w e i c h e n d hiervon kSnnen die Cristae auch radii~r a n g e o r d n e t sein (Abb. 3 b u. c). D a b e i sind die Cristae e n t w e d e r anni~hernd gleich lang, ohne sich in der M i t t e

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R. WINKLER :

Abb. 5. Beginnender Zerfall der Cristae mitochondriales. Neben mehr oder weniger stark verwaschenen Abschnitten erkennt man noch gut erhaltene Doppelmembranen. (Diese Art der Cristae-AuflSsung kann durch die Schnittffihrung nicht erkl/irt werden.) Die Aul~enmembranen sind unverKndert. Kontrolle. GesamtvergrSl~erung 47000fach zu berfihren, oder einige Cristae verlaufen durchgehend, so da$ die gegen sie konvergierenden kurzen Cristae mit ihnen spitze Winkel bilden. I n wieweit sich in diesen abweichenden Bildern verschiedene Schnittebenen der grundsi~tzlich gleichen Formation, Formvariationen oder unterschiedliche Funktionszust/inde manifestieren, kann nicht entschieden werden. Ein eigenartiges Ph/inomen ist das der st/irkeren Krfimmung der Cristae, die fiber torbogenartige Bildungen (Abb. 4a) zu vollst/indigen Ringen (Abb. 4b), d.h. jedoch zu mehr oder weniger sich abkugelnden Cristae ffihren. Bei einem Teil dieser ringfSrmigen Membranen handelt es sich allerdings um Anschnitte gegen das Mitochondrien-,,Lumen" sich vorkuppelnder Cristae, bei der Mehrzahl abet um echte Kugel- oder Rotationsellipsoid-Formationen. In der Regel kugelt sich nut eine Cristae ab, die dann u.U. den ganzen Innenraum des Mitochondriums einnehmen kann. Selten verkrfimmen sich mehrere parallele Cristae, so dab konzentrische Innensysteme resultieren (Abb. 4c). Mit steigender Konzentration der gegen die Zelle exponierten Vitalfarbstoffe k o m m t es zu einer zunehmenden Verwaschenheit der Cristae, w/~hrend die AuSenmembranen ihre scharfe Zeichnung behalten kSnnen (Abb. 5, 6). Die Cristae sind schlie$1ich nur noch dutch m/iBig osmiophile ,,Schleierzonen" v o n d e r Matrix abgegrenzt. Dabei geht auch das intracristale Spatium verloren, weil die Abgrenzung der Lamellen gegen das/iuSere Chondrioplasma zu unscharf wird. Interessanterweise beobachtet man dieses Ph/~nomen zuni~chst an den endstiindigen (auBen gelegenen) Cristae, gestuft fortschreitend nach innen. Mit der Auflockerung der Cristaestrukturen geht meist eine typische Schwellung des Gesamtmitochondriums einher. W/~hrend jedoch frfiher immer betont wurde, daf~ mit dieser Schwellung eine Verkfirzung der Cristae verbunden sei, zeigte sich in unseren Versuchen, da6 selbst bei stark geschwollenen Mitochondrien, deren Matrix vollst/indig aufgehellt

Mitochondrien und Vitalf~rbung

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Abb. 6. Kombination yon Mitochondrien-Schwe]lung mit Cristaeverwaschenheit. Beachte die Erhaltung langer Cristae mit z.T. erweitertem intracristalem Spatium sowie die vergleichsweise geringe Erweiterung des endoplasmatischen Reticulum. 2 • 4 mg AO. Gesamtvergr6Berung 36600fach ist, diese von einigen wenigen langen Cristae, die sich u.U. verzweigen, durchzogen werden; die Verwaschenheit der Cristae ist dabei oft gar nicht so ausgepr~gt, stellenweise sind die Doppelmembranen gut erhalten, durch Bl~hung des intracristalen Raumes meist auseinandergedr~ngt (Abb. 5, 6). Erst in welt vorgeschrittenen F~llen verlieren diese Mitochondrien ihre Cristae, jedoch offenbar weniger durch Retraktion als vielmehr durch Fraktionierung der nunmehr hochgradig verwaschenen Lamellen. Es sei betont, dab Schwellung der Mitochondrien und

Schwellung des endoplasmatischen Retikulum ( : ER) o//enbar unabhdngig voneinander verlau/en: wir sehen hochgradige Mitochondrienschwellung ohne die geringste Erweiterung des ER, andererseits zeigen die Mitochondrien bei ausgedehnten Schwellungen des E R keine oder nur unbedeutende Ver~nderungen (Abb. 7). Die letzte der registrierten Ver~nderungen der Innenstruktur betrifft Auftreibungen des intracristalen Raumes (Abb. 8a, b), die so weit gehen k6nnen, dal3 die zu einer Blase geschwollene Cristae den ganzen Innenraum des Mitochondriums ausffillt. Gelegentlich erkennt man in den sonst ,,leeren" blasigen Cristae vereinzelte, zart osmiophile Granulationen, deren Herkunft und Bedeutung unklar sind. Es hat nicht den Anschein, dal3 es sich dabei um Schnittartefakte handelt.

514

R. WINKLER:

Abb. 7. Stark aufgebl~htes endoplasmatisches Reticulum. Mitochondrien nur geringfiigig veriindert. Vgl. Abb. 6.2 • 4 mg AO. GesamtvergrSl~erung 28300fach d) Die Matrix mitochondrialis (inneres Chondrioplasma) und ihre Veri~nderungen Normalerweise unterscheidet sich die Dichte der Matrix nicht oder nut unwesentlich vom umgebenden Grundcytoplasma. Beinahe regelms sind in die Matrix kleine elektronendichte Granula eingelagert, die den Ribosomen des Cytoplasmas vSllig gleichen und mit den stark osmiophilen ,,Granula mitochondrialia" nicht verwechselt werden diiffen. Diese Granula sind in der Regel den Oberfl~chen der I n n e n m e m b r a n angeheftet (z.B. Abb. 8a, b). Wir erw~hnten bereits die Aufhellung der Matrix w~hrend der Schwellung der Mitochondrien bis zum v511igen Verlust ihrer Darstellbarkeit (Abb. 6). Daneben konstatieren wir in beinahe gleicher Hs eine Verdichtung der Matrix. Diese geht~- allerdings nicht obligatorisch - - mit der soeben beschriebenen BliPhung der Cristae einher (Abb. 8a, b). Die yon der Matrixverdichtung betroffenen Mitochondrien liegen grSl3enm~13ig an der unteren Grenze der Norm, h~ufig darunter, nur gelegentlich dariiber. In sehr seltenen Fi~llen sind in der Matrix gr6bere osmiophile Granula vorhanden, die yon den oben erw~hnten Partikeln unterschieden werden mfissen. •hnliche Grana kommen in den Mitochondrien vieler Zelltypen vor und wurden yon

Mitochondrien und Vit~lf~rbung

515

Abb. 8a u. b. Bl~hung der Cristae mitochondriales. Der osmiophobe Spaltraum zwischen den Hiillenmembranen ist nicht erweitert. Beachte die Matrixverdichtung und die geringe GrSBe der Mitochondrien. In der Matrix ribosomenartige Partikel (8b). a 2 • 4 mg AO, GesamtvergrSl]erung 77000fach, b 4 • 4 mg ~- 2 mg 9-NH2-A. GesamtvergrSl3erung 30000fach KLUO (1961) in den Mitoehondrien von Ascites-Tumorzellen mit der Entwicklung der Mitochondrienstruktur in Zusammenhang gebracht.

2. Das Verhalten der Mitochondrien unter Einwirkung der Vital/arbsto//e Aus Tabelle 1 lassen sich zahlreiche Tendenzen im ttinblick auf die Morphologie der Mitochondrien ablesen, die eine auffallende Abh~ngigkeit v o n d e r Konzentration der angewandten Farbstoffe zeigen. Die hin und wieder zu verzeichnenden Abweichungen dfifften ihre Ursache darin haben, dal~ das intraperitoneale Angehen des Tumors und vor allem die Menge der gebildeten Ascitesflfissigkeit starken Schwankungen unterliegen, so dal~ die tats/~chliche Konzentration des injizierten Vitalfarbstoffes nur sehr schwer zu bestimmen ist. Bei den Asciteszel]en der zur Untersuchung gelangten Tiere war der gebildete Ascites ann~hernd gleich groin, das geht auch aus der Konzentrationsabh~ngigkeit der Resultate indirekt hervor. Die bereits frfiher festgestellte Schwellung der Mitochondrien bei der Einwirkung yon Vitalfarben (ScHMIDT, 1961, 1962) kann best~tigt werden. Hier zeigt sich das eigentfimliche Phi~nomen einer Schwellung, bei der lange, zumeist verwaschene Cristae erhalten bleiben. Der Anteil der geschwollenen Mitochondrien erweist sich sowohl fiir N R als auch ffir die beiden Akridine als konzentrationsabh~ngig. Entsprechend ihrer unterschiedlichen Toxicit/~t (ZEmER, 1938; u.a.) ergibt N R die geringsten, 9-NH2-A die ausgepr~gtesten Effekte. Interessanterweise betrifft die Zunahme geschwollener Mitochondrien in erster Linie solche mit langen Cristae, ihre Zahl n i m m t parallel der Schwellungsrate zu, w~hrend der Anteil geschwollener Mitochondrien mit kurzen Cristae nur geringffigig ansteigt. Immerhin oftenbaren sich die Mitochondrien als relativ schwellungsresistent: so sind bei einer 9-NH~-A-Konzentration yon 5 • 4 mg i.p. viele Zellen bereits ausgepr/~gt pathologisch ver/~ndert, w~hrend die Schwellungsrate der Mitochondrien nur gerade 50% fibersteigt.

516

R. WINKL~.R: Tabelle 1 Ge- p saintzahl

u

rl

wl

rk

wk

gk

gl

ri

d

Besonderheiten

Kontrolle

469

68,5 30,5

28,0 26,7 54,7

8,3 7,5 15,8

2,7 1,7 4,4

2,8

1,0

Neutralrot 2• 50rag tip.

ll0

81,8 18,2

34,3 25,9 60,2

3,6 5,3 8,9

9,5 3,9 13,4

1,8

9,8 21,9v

617

53,8 46,2

24,7 31,8 56,6

15,1 6,8 21,9

13,3 8,9 22,2

558

58,7 41,3

19,7 32,7 52,4

7,9 6,3 14,2

14,6 7,1 21,7

3• 4mg i.p.

226

48,3 51,7

15,3 34,3 49,6

4,2 5,2 9,4

22,2 15,2 37,4

18,1 16,0

4 x 4mg~2 mg i.p.

196

40,8 59,2

14,9 31,5 46,0

7,5 4,5 12,0

25,0 18,5 43,5

10,5 28,0 26,2ba

5• 4rag i.p. Akr.-Orange 4 mg

167

35,3 64,7

13,1 27,6 40,7

1,8 6,0 7,8

21,9 29,0 50,9

22,2 37,0 31,3ha

315

52,5 47,5

ll,0 39,7 50,7

7,0 6,0 13,0

9,5 10,3 19,8

2,9 15,0 19,1 ba

2• 4rag

305

51,5 48,5

17,8 34,1 51,9

8,6 6,5 15,1

12,2 16,4 28,6

6,9 15,8 18,7 ba

4• 50mg tip. 9-NH2-Akr. 2mg i.p.

p -- parallelisierte Cristae rl = reichlich lange Cristae rk ~ reichlich kurze Cristae gk -- geschwollene Mitochondrien mit kurzen Cristae gl ~ geschwollene Mitochondrien mit langen Cristae ri = ringfSrmige Cristae

u ~ wl ~ wk ~ d = ba ~ v ~

8,4v

15,2 14,6 30,3v

2,9

1,0

5,9ba --

ungeordnete Cristae wenig lange Cristae wenig kurze Cristae verdichtete Matrix blasig aufgetriebene Cristae verwaschene Cristae

Die Zahlenangaben erfolgen in Prozent. Zu der Art der Auswertung ist folgendes zu sagen: es wurden nut solche Mitochondrien ausgewertet, die die gestellten Kriterien eindeutig erffillten. Da sich jedoch die Anteile der einzelnen Gruppen notwendigerweise auf die Gesamtzahl aller Mitochondrien in der betreffenden Versuchsgruppe beziehen, ergibt sich daraus zwangsl~iufig, da$ bei der Addition sich erg~nzender Reihen (z. B. Prozent lange ~-Prozent kurze Cristae) praktisch nie 100% ergeben. Selbstverst~ndlich kSnnen einzelne Mitochondrien bei gegebenem AnlaB mehrfach aufgefiihrt werden (z.B. Mitochondrien mit ringfSrmigen Cristae erscheinen auch unter der Rubrik: lange Cristae). U n t e r N o r m a l b e d i n g u n g e n ( = ungefKrbte K o n t r o l l e n ) wird die zweite ffir K r e b s m i t o c h o n d r i e n als t y p i s c h e r a c h t e t e R e a k t i o n , n~mlich die Verdichtung ihrer Matrix, auffallend selten gefunden. Das Bild ~ n d e r t sich deutlich nach E i n w i r k u n g v o n Vitalfarbstoffen. A u c h hier erweist sich d e r p r o z e n t u a l e A n t e i l v e r d i c h t e t e r M i t o c h o n d r i e n als d i r e k t p r o p o r t i o n a l der F a r b s t o f f k o n z e n t r a t i o n , erwartungsgem~B ist der N R - E f f e k t weniger ausgepri~gt. Es e r s t a u n t jedoch die geringere

Mitochondrien und Vitalf/~rbung

517

A u s ~ r k u n g der 1fiedrigsten 9-NH,-A-Konzentration (2 mg), die zu der recht deutlichen Schwellungsreaktion bei dieser Konzentration kontrastiert. Wiihrend die Verdichtung der Mitochondrien unter den Akridinen typischerweise mit einer Bliihung der Cristae einhergeht, zeigen die verdichteten Mitochondrien unter N R im allgemeinen kr~ftiger kontrastierte Cristae, deren osmiophober Spalt nur selten verbreitert ist. Entsprechend gehen die Prozentzahlen ffir gebls Cristae unter Akridin parallel mit den Verdichtungsraten, ffir N R sind keine nennenswerte Cristaebl~hungen zu verzeichnen (sie wurden deshalb in der Tabelle auch nicht aufgeffihrt). Dagegen kann die Strukturverwaschenheit der Innenmembranen als recht typiseh fiir die NR-Einwirkung angesprochen werden. Sie betrifft gerade die Mitochondrien mit liehter Matrix. Aueh unter den Akridinderivaten stellen wir eine m~Big zunehmende Verwaschenheit der Cristae fest. Diese hat jedoeh nieht ann/~hernd den Anteil wie nach Exposition der Zellen gegen NR. Die Parallelisierung der Cristae nimmt unter NR-Wirkung (2 x 50 mg) betriichtlich zu, unter den Akridinen dagegen st/indig ab. Bei der Maximalkonzentration von 9-NH-A enth/ilt nur noch ein gutes Drittel aller Mitochondrien parallele Cristae, gegenfiber 81,8% naeh 2 x 50 mg N R (normal 68,5%). Diese Tendenzen werden ebenfalls in der Anzahl und L/~nge der Cristae unabh/~ngig yon ihrer Ordnung deutlich: hier offenbaren die Mitoehondrien selbst naeh 4 x 50 mg N R mehr lange Cristae als die Kontrollgruppe. l~berraschend ist die hohe Zahl von Mitoehondrien mit kurzen Cristae bei dieser NR-Konzentration. Unter der Einwirkung der Akridinderivate ist die Zahl der Mitochondrien mit langen wie mit kurzen Cristae stets niedriger als in der Kontrollgruppe und sinkt mit zunehmenden Konzentrationen gleichm/~$ig ab. Dieses Absinken betrifft fiir die erste Gruppe einzig den Anteil der Mitochondrien mit reiehlich langen Cristae, auf deren Kosten die Prozentzahl der Mitochondrien mit wenigen langen Cristae vorfibergehend sogar ansteigt, so dal3 eine Transformation der Mitoehondrien durch Abbau von Innenmembranen wahrscheinlich ist. SchlielMich mu[3 noch auf das eigentfimliche Auftreten ring/Srmiger Cristae (s.a.S. 512) eingegangen werden: sowohl unter N R wie aueh unter den Akridinderivaten nimmt mit steigenden Farbstoffkonzentrationen die Zahl der Ringformationen signifikant zu. Beachtlich ist der starke Effekt von 4 x 50 mg NR. Aus dem Rahmen I/illt der Wert ffir 4 x 4 mg ~- 2 mg 9-NH~-A, der allerdings den Normalwert noch um fast das Vierfache fibertrifft.

3. Die Verteilung der Mitochondrien Die Ascitestumorzellen erseheinen in zwei morphologischen Gruppen (vgl. hierzu WESSWL und BERNHARD,1957, aber auch die lichtmikroskopischen Untersuchungen CASrERSONS, 1950): 1. Zellen mit relativ schmalem Cytoplasmasaum, einem schwach entwickelten E R und Mitochondrienzahlen zwischen 10 und 20 pro Zellanschnitt und 2. Zellen mit breitem Cytoplasmasaum, das ein zwar immer noch sp/irliehes, aber doch ausgedehnteres E R und meist kleinere Mitochondrien enth/s deren Zahl pro Zellanschnitt 25 im allgemeinen deutlich iibersteigt. Die Zellkerne der ersten Gruppe sind iiberwiegend ovoid, die der zweiten langgestreckt, h/~ufig segmentiert. Es dfirfte sich bei diesen Formen entweder um verschiedene

518

R. WINKLER: Tabelle 2. Abstdnde der Mitochondrien vom Karyolemm Kontrolle

bis 0,2 ~ 13,4% bis 1,0 ~ 42,5% bis 2,0 ~ 27,4% bis 3,0 ~ 10,6% bis 4,0 # 3,4% 5,0~z 0,5% Aufteilung in 0,31 5 gleiche Gruppen 0,63 0bere Grenze in ~

1,05 1,75 5,00 1,11 #

Durchschnittlicher Abstand Zahl der Mito435 chondrien

4 • 50 mg Neutralrot

5 • 4 mg 9-NH~-Akridin

15,6% 39,7% 26,9% 10,9% 3,4% 4,4% 0,25 0,58

19,4% 48,2% 24,5% 7,2% 0,0% 0,0% 0,21 0,47

1,22 2,04 7,50 1,03 # 525

0,83 1,64 3,00 0,87 # 138

Tabelle 3. Abstdnde der Mitochondrien vom Plasmalemm

bis 0,2 ~ bis 1,0 ~z bis 2,0 ~ bis 3,0 ~ bis 4,0 ~ bis 5,0 ~z 6,0 ~z Aufteilung in 5gleiche Gruppen obere Grenze in ~

Kontrolle

4 x 50 mg Neutralrot

5 x 4 mg 9-NH2-Akridin

11,3% 39,0% 27,2% 15,4% 4,4% 2,3% 0,3% 0,31 0,77

2,9% 26,9% 39,2% 19,6% 8,0% 1,5% 1,4% 0,77 1,22

1,5% 29,1% 42,8% 18,1% 8,0% 0,0% 0,0% 0,78 1,17

1,33 2,12 6,00 1,27 ~

Durchschnittlicher Abstand Zahl der Mito435 chondrien

1,76 2,41 7,50 1,61 ~ 525

1,53 2,23 3,90 1,53 138

A l t e r s g r u p p e n derselben Zellst/s oder u m M u t a n t e n verschiedenen Ploidisierungsgrades h a n d e l n (s.a. MAKINO, 1956). Bezfiglich des Mitochondrienverhaltens zeigen sich zwischen diesen beiden Z e l l t y p e n keine Unterschiede, so dal~ auf eine A u f t r e n n u n g der Ergebnisse v e r z i c h t e t wurde. WESSEL u n d BERNHARD (1957) k o n s t a t i e r e n eine Dreischichtung der Zelle, deren erste Zone v o m Zellkern, die zweite v o m E R , G o l g i - A p p a r a t e , M i t o c h o n d r i e n u . a . e i n g e n o m m e n wurde, w/~hrend die d r i t t e sich als aul~erordentlich s t r u k t u r e n -

Mitochondrien und Vitalf~irbung %

519

\

60 50 ~0 3g 20 \

00

q

2

,

3

4

5 p.

Abb. 9. Prozentuale Verteilung der Mitochondrienabst~nde vom Karyolemm, zusammengefaBt zu Gruppen von jeweils 1 it. + § Kontrolle, o o 5 X 4 mg 9-NH2-A, * * 4 x 50 mg Neutralrot. Weitere Erkl~rung s. Text S. 519f arm erwies (Hyaloplasma). In der Tat zeigen viele Zellen scheinbar diesen Aufbau. Vergleiehende Messungen, die die jeweils kfirzeste Verbindung zwisehen der/~ul~eten Mitoehondrienmembran und der K e r n m e m b r a n bzw. dem Plasmalemm aufzeiehnen, ergeben jedoch, da$ kein signifikanter Unterschied in den Abst/~nden, wie er bei obiger Konzeption zu fordern wiire, unter Kontrollbedingungen besteht (Tabelle 2, 3). Es linden sich nut geringf/igig mehr Mitoehondrien, die gr6Bere Abst/inde vom Plasmalemm aufweisen als andere vom Karyolemm. Hierbei mu6 notwendigerweise der dreidimensionale Zellaufbau vernachl/tssigt werden, so da6 ein Mitoehondrium, das scheinbar tief im Zelleib liegt, einer Cytoplasmabucht, die nieht mehr im Sehnitt erseheint, eng benaehbart sein kann. Es ist weiterhin zu beriieksiehtigen, da6 das Bild einer Schiehtung leieht durch Flach- oder Tangentialschnitte hervorgerufen wird, die die wahre Ausdehnung gewisser ,,Zonen" erheblieh verzerren. Diese Verh/~ltnisse/~ndern sich in unserem Material grundlegend naeh Einwirkung hoher Dosen yon Vitalfarbstoffen. Es finden sieh aueh jetzt noch gelegentlich Mitoehondrien in unmittelbarer N/~he des Plasmalemms. W/thrend normalerweise 2/5 aller Mitochondrien einen Abstand vom Plasmalemm yon weniger als 0,77 aufweisen, sind es nurmehr 1/5. In einem Abstand yon weniger als 0,2 ~ finden sich sogar nur noch 2,9% (4 x 50 mg NR) bzw. 1,5% (5 x 4 mg 9-NH~-A) gegeniiber normalerweise 11,3%; 26,9% bzw. 29,2% liegen weniger als 1 [x entfernt (normal 39,0 %)! Ein wesentlicher Unterschied besteht bezfiglich der NR- bzw. 9-NH,-AWirkung nicht. Die Abst/inde vom Karyolemm werden dureh die Vitalfarbstoffe praktisch nicht beeinflu6t. Stellt man dieses Verhalten graphisch dar (Abb. 9), so

520

R. WINKLER:

5g

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0

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1

1 2

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3

~

~

5

..... -,u,

Abb. 10. Prozentua]e Verteilung der Mitoehondrienabst~nde v o m P]asma]emm, zusammeng e h B t zu Gruppen yon jewei]s 1 t~. + + Kontrolle, o o 5 • 4 mg 9-NH~-A, *--

* 4 • 50 mg Neutralrot. Weitere Erkl~rungen s. Text S. 519 f

zeigt sich, dab die Kurven ffir die Distanzen v o n d e r K e r n m e m b r a n nahczu identisch sind und einen logarithmischen Verlauf nehmen. Das gleichc Kurvenbild ergibt sich hinsichtlich des Abstandes vom Plasmalcmm (Abb. 10) unter Normalbedingungen, das der Vitalfarbstoffe zeigt dagegen eine eindrucksvollc Depression im Anfangsteil. Es sei noch darauf hingewiesen, dab die Mitochondrien der Ascitcstumorzellen dcr Kontrolle wie in den Farbstoffversuchen einc bemerkenswerte Neigung zeigen, sich in Feldern zu gruppieren. Diese Bezirkc sind allerdings nut locker gcpackt und yon anderen Cytoplasmakompartimenten unregclm/il]ig durchsetzt. Morphoogische Ordnungsprinzipien innerhalb der Mitochondriengruppen bestehcn nicht. 4. Beziehungen der Mitochondrien zu anderen Zellstrukturen

a) Zellkern Aus dem vorangehenden Abschnitt konnte bereits entnommen werden, dab die Mitochondrien in relativer Hiiufung in Kernn/~he liegen. So finden sich 13,4% aller Mitochondrien nicht mehr als 0,2 ~ vom K a r y o l e m m entfernt. Diese Zahl steigt noch geringffigig nach Einwirkung von Vitalfarbstoffen an (bis 15,6% ffir NR, 19,4% ffir 9-NH2-A ). Der Anstieg ist jedoch nut z.T. eine echte Vermehrung der Mitochondrien in der unmittelbaren Kernumgebung. Wie wir gerade gezeigt haben, sinkt die Zahl peripherer Mitochondrien nach Farbstoffeinwirkung betr/ichtlich, w/~hrend die Zahl der zentralcn, kernnahen Mitochondrien weitgehend unbeeinfluBt bleibt, so dab zwangsl~ufig eine Erh6hung des prozentualen Anteils kernnahcr Mitochondrien resulticrt. Zum anderen jedoch liegt diescr Erh6hung offenbar aueh eine echte Vcrsehiebung von Mitochondrien in die N/the des Kernes zugrunde. Sie ist allerdings nur yon geringem Ausma6 und mit den angewandten Methodcn in ihrer exakten H6he nur schwer zu ermitteln. Sie wird deutlicher, wenn man die Gcsamtzahl dcr Mitochondricn in gleiche Gruppen aufteilt und durch Interpolation jeweils den Grenzwert des Abstandes in ~ bestimmt (Tabelle 2).

Mitochondrien und Vitalf~rbung

521

Abb. l l a u. b. Mitochondrien-Kernbeziehungen. Man erkennt die Ausrichtung der Cristae mitochondriales auf das Karyolemm, die auffl~llige Anordnung der Ribosomen auf die Cristae hin (Pfeile), sowie die Korrespondenz der Cristae mit gerichteten granul/~r-fibrill~ren Strukturen des Kerninnern (Doppelfpeile). a 2 • 4mgAO, Gesamtvergr61]erung 41000fach, b 2 • 4 mg AO, Gesamtvergr613erung 31000fach Hier zeigt sich der spiirbare Abfall des Grenzwertes unter der Einwirkung der Vitalfarbstoffe. So registrieren wir z. B., dal~ 2/5 aller Mitochondrien unter Normalbedingungen einen Abstand von weniger als 0,63 ~, unter N R yon weniger als 0,58 ~ und unter 9-NHs-A von weniger als 0,47 ~ aufweisen. Es sei jedoch noch einmal betont, dal~ diese Effekte vom Schwund peripherer Mitochondrien (lurch Vitalfarbstoffeinwirkung iiberlagert werden. Die dem Kern benachbarten Mitochondrien zeigen eino Ausrichtung ihrer Cristae naeh der Zellkernmembran (Abb. l l a, b). K n a p p 85% aller kernnahen Mitochondrien sind so orientiert, da~ ihre Cristae mehr oder weniger senkrecht zum Karyolemm stehen. Die Cristae gewinnen dabei hiiufig mittelbaren Ansehlu~ an gerichtete Strukturen im Kerninneren oder weisen Beziehungen zu Extrusionen granulgren Kernmaterials (in der Regel yon Ribosomencharakter) auf (Abb. l l a, b). K o n t a k t e zwischen Mitochondrien und i~uI~erer K e r n m e m b r a n werden gelegentlich, Fusionen nie beobachtet. I n etwa 10% war die Beurteilung solcher Orientierungen und Beziehungen unsicher, in rund 5% liel~en sich diese morphologisch nicht nachweisen. Es ist zu beachten, da~ nur solche Mitochondrien ausgewertet werden, zwischen deren Oberfl~che und der K e r n m e m b r a n keine Anteile des E R eingebaut sind. Ist dies der Fall, so erweisen sich die Innenstrukturen der Mitochondrien als vSllig regellos bezfiglich ihrer Ausrichtung. Die Beurteilung wird dadurch erschwert, dal~ die Ausbildung der Innenmembranen kernnaher Mitochondrien vergleichsweise recht diirftig ist. So enthalten nur 40,8% aller kernnahen Mitochondrien mehrere Cristae, 46% besitzen ein wenig strukturiertes Inneres; in der Zellperipherie betri~gt dieses Verh~ltnis 70 % :23 % zugunsten einer reichlicheren Cristaeentwicklung. Auf diese Ordnung der Mitochondrien haben die Vitalfarbstoffe wiederum einen bedeutenden Einflu~. W~hrend ni~mlich under Kontrollbedingungen die Orientierung gar nicht so ausgepr~gt ist (73 % deutliche Zuordnung, 16,5 % unsichere und 10,5 % ohne Beziehungen) n i m m t diese mit steigenden Vitalfarbstoffkonzentrationen signifikant zu: z.B. liegen f/ir 2 mg 9-NH~-A die Prozentzahlen jetzt bei: 76% sichere, 16% unsichere und 6% keine Zuordnung, ffir 4 mg A 0 bei: 82% :12% : 5 %. Oberhalb yon Konzentrationen yon 3 • 4 mg 9-NH2-A und bei 4 • 50 mg N R

522

R. WINKLER:

ist eine fehlende Orientierung iiberhaupt nicht mehr zu verzeichnen, gleichzeitig ist auch der Anteil unsieherer Beurteilungen betrgchtlich zurfickgegangen. I m iibrigen erweisen sieh die Mitochondrien mit zahlreicheren Cristae als wesentlich deutlicher ausgerichtet. b) Die Beziehungen der Mitochondrien zum E R Verst~ndlicherweise ist es schwierig, in Zellen, die nur ein sp~rliches E R enthalten, exakte Beziehungen zwischen diesem und den Mitochondrien zu ermitteln. Allgemein f~llt auf, dab an 0rten, wo das E R eine gewisse Verdichtung erf~hrt, auch eine Anh~ufung von Mitochondrien vorliegt. Dabei lagern sieh Vesikel und

Abb. 12. Beziehungen zwischen Mitochondrien und endoplasmatischem Reticulum. Direkte Anlagerung eines Kanals des endoplasmatischen Reticulum an ein Mitochondrium (Pfeil). Die aneinanderliegenden Membranen bleiben als Diaphragma erhalten. 2 mg 9-NH2-A. GesamtvergrSBerung 17 600fach Abb. 13. Beziehungen zwischen Mitochondrien und ER. Relativ zahlreiche Schl~uche des ER im Mitochondrienfeld. Unmittelbare Nachbarschaft zwischen Teilen des ER und Mitochondrien. 4 mg AO. Gesamtvergr5Berung 19400fach Tubuli der Oberfl~che der Mitochondrien oft unmittelbar an (Abb. 13). Nicht selten entspringen an diesen Anlagerungsstellen Cristae ; hierbei bleiben die Au~enmembranen, die meist nieht als zwei distinkte Profile ausgemacht werden kSrmen, als diaphragmaartige Struktur erhalten (Abb. 12). Eine unmittelbare Kommunikation des Inneren der Cristae mit dem endoplasmatisehen Retikulum konnten wir im Gegensatz zu KO~ISSARCHIK (1963) niemals iiberzeugend beobachten. Wenn diese Konnexionen auch in den beschriebenen Feldern besonders ausgepri~gt sind, so werden sie doch in der fibrigen Zelle nicht vermiBt. Dabei gewinnt man den Eindruck, dal~ ein Teil der angelagerten Vesikel, besonders an oberfli~chennahen Mitochondrien, mikropinocytotischen Ursprungs ist (vgl. hierzu Abb. 14 bei STAUBESAND,1964). Unter Normalbedingungen konstatieren wir bei nahezu 11% aller Mitochondrien derartige Beziehungen. Bei Anwendung von 9-NH~-A, das anf~nglich offenbar zu stgrkerer Entwieklung des E R fiihrt, ist eine beinahe parallele ErhShung der Zahl der Anlagerungen zu verzeiehnen (bis 2 mg ca. 16,3%). Bei massiveren Angeboten sinkt sie jedoch best~ndig und betrgehtlich unter das

Mitochondrien und Vitalf~rbung

523

Abb. 14. Beziehungen zwischen Mitochondrien und intraplasmatischen Lipiden. Beachte die nur z.T. deutliche Ausrichtung der Cristae. Zwischen Mitochondrien und Lipiden ,,Resorptionslakunen" (Pfeile). Kontrolle. GesamtvergrSBerung 26000fach

Normalmal3 ab. N a c h 5 x 4 m g 9-NH2-A ist sie so gering - - n i c h t wohl z u l e t z t wegen erheblicher D e f o r m i e r u n g e n des E R - - , dal3 eine sinnvolle B e s t i m m u n g des w a h r e n Anteils n i c h t m e h r mSglich ist (er liegt m i t Sicherheit d e u t l i c h u n t e r 5 % ). S e t z t m a i l die Mitochondrienoberfl/~che zur r e l a t i v e n K l e i n h e i t d e r a n g e l a g e r t e n Teile des E R u n d d e r S c h n i t t d i c k e in Beziehung, wird verstiindlich, d a b der Proz e n t s a t z d e r M i t o c h o n d r i e n m i t Verknfipfungen z u m E R normalerweise 11% welt fibersteigt, d a r f m a n a n n e h m e n , dal3 jedes M i t o c h o n d r i u m m i n d e s t e n s a n einer Stelle m i t d e m E R in K o n t a k t steht. 35 Z. Zellforsch.,Bd. 79

524

1~. WINKLER:

Abb. 15. Keine deutlichen Beziehungen zwischen Mitochondrien und vitalfarbstoffbedingten ZellverKnderungen wie Vakuolen (V) und Granula (G). MAC 4 • 50 mg NR. Gesamtvergr613erung 20700fach c) Beziehungen der Mitochondrien zu intraplasmatischen Lipidtr6pfchen I m Grundcytoplasma der untersuchten Zellen sind relativ oft LipidtrSpfchen y o n regelloser F o r m und einer meist ausgenagt oder ausgefranst wirkenden Oberfl/~che vorhanden. Ihre Beziehungen zu anderen Zellstrukturen sind nicht sehr ausgepragt, Mitochondrien finden sich nur an 41,4% aller Lipidtropfen assoziiert. Von diesen steht fiberwiegend nur ein Mitochondrium in K o n t a k t mit dem Lipideinschlul~ (51% ), 2 Mitochondrien sind es in 27,5%, drei in 9,8%, mehr als fiinf in 1,3 % aller F/~lle.

Mitochondrien und Vitalf~irbung

525

Auch die Ausrichtung der Cristae assoziierter Mitochondrien ist nicht sehr ausgepr/~gt: 50,2 % offenbaren eine fiberzeugende Ausrichtung in Richtung auf den Lipidtropfen, in 16,8% ist diese fraglich, in 15,2% besteht sie rdcht, w/thrend der Rest nicht zu beurteilen ist. Es zeigt sich, dab die fransenartigen Ausl/iufer der Lipide oft mit den Cristae korrespondieren, wobei zwischen den Ausl/~ufern R/iume entstehen, die an Resorptionsvakuolen erinnern (Abb. 14). Interessanterweise verdeutlicht sich die Cristae-Ausrichtung zu den benachbarten Lipiden in dem Mal3e, wie die Zahl der angelagerten Mitochondrien zunimmt: bezogen auf alle auswertbaren Mitochondrien zeigen 61% eine sichere, 20,4 % eine fragwfirdige und 18,6% keine Ausrichtung; lagern sich zwei Mitochondrien an, so lauten die Prozentzahlen 67,5% zu 18,6% zu 13,9%, bei mehr als zwei assoziierten Mitochondrien 84,5% zu 8,4% zu 7,3%. Die Beziehungen der Mitochondrien zu den Lipiden werden durch das Einwirken der Vitalfarbstoffe nicht erkennbar beeinfluBt. DaB solche Einfl/isse freilich bestehen kSnnen, geht aus den oft betr/~ehtlichen Schwankungen der Verh~ltniszahlen unter den verschiedenen Farbstoffen und deren Konzentrationen hervor, wobei jedoch die oben aufgezeigten Tendenzen immer eindeutig gewahrt bleiben. d) Mitochondrien und die durch Vitalfarbstoffe bedingten Zellver/inderungen Es soll bier nieht auf die verschiedenen Formen der Farbstoffvakuolen und Granula bzw. das Krinom-Problem eingangen werden. Wir begniigen uns mit dem Hinweis, dab derartige Bildungen oft mit sehr geringen oder gar fehlenden Ver/~nderungen des Mitochondrierdeinbaues einhergehen (Abb. 15). Den segregierenden Membranen dieser Formationen finden sich Mitochondrien h~ufig benachbart. Solche Nachbarschaft kann rein zuf/illig sein, da gar nicht so selten der ganze Zelleib mit Vakuolen und Granula ausgefiillt ist (Abb. 15). Eine Ausrichtung der Mitochondrien auf diese Formationen besteht offenbar nieht. IV. Diskussion

a) Ver/~nderungen der Mitochondrienmorphologie Wie wir gezeigt haben, wird das Erscheinungsbild der Mitochondrien durch Vitalfarbstoffe der angewandten Art beeinflul~t. Es ist nicht beabsichtigt, hier auf die Problematik der Vitalf/~rbung einzugehen. Aus der Ffille yon VerSffentlichungen und Monographien zu diesem Thema sei besonders ~uf die Arbeiten yon RIES (1938), Z]~IGER(1938), WEISSMANN (1953), WITTEKI•D (1958, 1960, 1965), SCHMIDT (1962) und STOCKINGV~R(1964) hingewiesen. Im Hinblick auf unsere Studie erheben sich die Fragen: 1. Sind die beobachteten Mitochondrienver/~nderungen Folge der direkten Farbstoffeinwirkung auf das Mitoehondrium, wenn ja, an welchen Strukturen greifen die Farbstoffe an ?, oder 2. sind die morphologischen Ver~nderungen Anpassungen an die ver/inderte Stoffwechselsituation der Zelle ? DaB die Auseinandersetzung der Zelle mit den Vitalfarbstoffen ein energiekonsumierender ProzeB ist, wurde bereits eingangs betont (NAssoNov, 1930; ALEXANDROW, 1933; MAKA~OV, 1933; KEDROWSXY, 1935, 1937; W~SISS~A~N, 1953; Ws.ISSMANN und GILGI~N, 1956; u.a.). Es unterliegt weiterhin keinem Zweifel, dal] eine Kardinalfunktion der Mitoehondrien die der Bereitste]35*

526

R. WINKLER:

lung energiereicher Phosphate (ATP) ist. Das Ausma$ der Energiebereitstellung ist an die Zahl und Ausbildung der Cristae gebunden (PAcKE~, 1961 ; GI~EE~ und HATE•I, 1961; GRE]~ und ODA, 1961; MATTISO~ und BIRcH-A~D]~SE~, 1962; KLI~GV,~BEI~G, 1963; VOGELL, 1963; WILSO~ und LEDUC, 1963; GI~VND~A~, 1964 ; SCHWAT,BACHund AGOST~NI,1964 ; SLAUTTEaBACK,1965 ; U. a.) Die Erh6hung tier Zahl der Cristae unter niedrigen NR-Konzentrationen kann als Adaptationserscheinung an die gesteigerten Energiebedfirfnisse der Zelle gedeutet werden. Es ist das wahrscheinlichste, dab die neu formierten Membransysteme yon den vorbestehenden gebildet werden. Neben dem gesteigerten Energiebedarf k6nnte dieser Cristaevermehrung eine direkte Einwirkung der Farbstoffe zugrunde liegen, unbeschadet der Tatsache, dab die Mitochondrien nicht zu den mit den verwandten Farbstoffen vital zu f/trbenden Zellstrukturen geh6ren (s. S. 526 u.). ZEIGEa und SCHMIDT(1957) sehen in der l~eaktion der mitochondrialen Nukleins~uren mit den Farbstoffen die Primiirreaktion, die eine St6rung der Atmungskettenenzyme bedingen soil, welche kompensatorisch infolge sich entwickelnden ATP-Mangels zu Cristae-Bildung ffihren k6nnte (s.a. WILSON und LEDUC, 1963). STOCKINGER (1953) vertritt die Ansicht, dab den Mitochondrienverfall durch AO-Intoxication. eine zellul/~re Atmungsst6rung begleite. Das Verhalten der Mitochondrien unter NR beweist ihre grunds/~tzliche Adaptationsf/~higkeit an erh6hte Energieleistungen. Wenn bei Exposition gegen h6here Vitalfarbstoffkonzentrationen eine Desintegration der Mitochondrienstruktur erfolgt, so ist diese vermutlich eben doch das Ergebnis einer direkten toxischen Beeinflussung. Ob dabei die Atmungskettenfermente, die Membranen, mitochondria]e Nukleins/iuren oder andere Substanzen mit den Vitalfarbstoffen reagieren, kann nicht entsehieden werden. Dabei errreicht der Farbstoff intramitochondrial normalerweise nicht die Konzentrationen, die zum lichtmikroskopischen Sichtbarwerden erforderlich sind. Lediglich nach hoch toxischen Dosen k6nnen die Mitochondrien zur Darstellung gelangen: so naeh subletalen NR-Dosen (WEISS, 1955) - W~Iss sah darin einen Ausdruck ffir die Funktion der Mitochondrien, Kationen anzureichern - - , oder nach hochkonzentrierten Dosen AO (GvTKINA et al., 1964). Schon 1937 hatten GERSCH und RI~S auf die Abh/~ngigkeit der NR-Darstellung der Mitochondrien von bestimmten Funktionszusti~nden der Zelle aufmerksam gemacht. DaB die Mitochondrien dekompensieren, geht daraus hervor, dab die Toleranz der Zellen gegen Vitalfarbstoffe durch gleichzeitiges Angebot energiereicher Verbindungen wie Glucose und besonders ATP wesentlich gesteigert werden kann (WmssMANN und GILGEI~,1956). Die auSerordenthche Labilit~t der Mitochondrien vitalgef/~rbter Zellen erweist sich auch in den Versuchen von BEssls et al. (1966). Diesen Forschern gelang es, isoliert die Mitochondrien vitalgef/~rbter Zellen mit Hilfe des Laser-Strahles auszuschalten. Hierbei sind nicht nur die klassiehen Mitoehondrienfarbstoffe (z. B. Janusgrfin), sondern auch die von uns verwandten Farbstoffe in Konzentrationen effektiv, die bei weitem nicht zur Vitaldarstellung der untersuchten Zellen genfigt h~tten (1 / 100-- 1/ 1000 der sonst iibhchen Konzentrationen). Diese Aussehaltung ist sieher nicht allein als radiodynamischer Effekt, womit indirekt die Farbstoffaufnahme durch Mitoehondrien bewiesen w~re, sondern nur in Kombinationen mit einer praedekompensatorischer Hyperaktivit~t der Mitochondrien zu verstehen.

Mitochondrien und Vitalfiirbung

527

Ausdruck dieser Dekompensation ist die Mitochondrienschwellung, die anf~nglich durchaus noch als physiologisches ,,Oedem" im Zuge gesteigerter Leistungen, als Phi~nomen vermehrter Austauschvorg/inge an der Mitochondrienmembran aufgefaBt werden kann, wobei auch der oberfli~chenvergrSBernde Faktor eine Rolle spielt. Die fortgeschrittenen F~lle mitochondrialer Schwellung sind, unbeschadet ihrer Reversibilit~t, seit langem als Kardinalsymptom pathogener Einwirkungen auf die Zelle bekannt. Die Toxizit~t der Vitalfarbstoffe erweist sich diesbezfiglieh als konze~trationsabh/~ngig. DaB Schwellung durch einen Eingriff in den Energiehaushalt des Mitoehondriums erzeugt werden kann, hat sieh aus vielen Beobachtungen zu diesem Problem Mar herausgestellt. Es liegt daher nahe, als Ursaehe der Sehwellung eine Einwirkung der Vitalfarbstoffe auf die Atmungskette im oben erw/ihnten Sinne zu sehen (s. a. ZEIGER und SCHMIDT, 1957; LEm NINGER und SCHNEIDER,1959; HABA, 1960 und 1961; HARMAN und O'HEOARTY, 1962; WILSON und LEDUC, 1963). PACXER vertritt hingegen die Ansieht, dab Entkoppelung der oxydativen Phosphorylierung und Verhinderung des Elektronentransportes eine Mitochondrienschrumpfung verursachen. Analog kann man die Ansichten LYNNS et al. (1964) verstehen, die die Schwellung der Mitoehondrien durch Elektronentransportsubstrate als ein Beispiel ffir die Aktivierung der Kationen-Translokation - - es sei an die Ansichten von WEISS erinnert (s. S. 526) - auf Kosten der H20-Translokation interpretieren. Wichtiger scheint uns in diesem Zusammenhang die Frage, welche Bedeutung der Strukturdesintegration der Cristae zukommt. Wir betonen, dab die Verwaschenheit der Cristae ein Ph~nomen sei, das zwar grunds~tzlich mit der Schwellung korreliert ist, jedoch dem AusmaB der Schwellungsreaktion keineswegs parallel geht. GREEN u. Mitarb. (1961 a, b) hatten festgestellt, dab die Ffi,higkeit der Mitochondrien, den vollst/~ndigen CSZ zu katalysieren, an deren strukturelle Integrit/it gebunden ist, dab aber zur oxydativen Phosphorylierung nur die Grundeinheit, E T P genannt, in Kombination mit der Doppelmembran notwendig ist. Eben dieser Doppelmembrancharakter geht bei der beschriebenen Cristae-Transformation morphologisch verloren; damit aber w/irde die Bildung der ATP vermindert, was seinerseits zu einer Schwellungszunahme ffihrte und so fort. Die Kombination von Strukturzerfall der Cristae und Schwellung des Mitochondriums scheint in dieser Sieht verst/tndlich. Mit der umstrittenen partikul/~ren Transformation GABLERS (1961 a, b, c), die eine Anpassung der Mitoehondrien an erh6hte Energiebediirfnisse darstellen soll, dfirften die beobaehteten Vorg/~nge nicht identisch sein. F/ir das Erhaltenbleiben langer Cristae wissen wir z.Z. keine iiberzeugende Erkl/irung, mSglicherweise handelt es sich hierbei um resistente Strukturproteine. Die Modelle, die die Oberfl/ichenvergr6gerung bei der Schwellung dureh Retraktion der Cristae in die AuBenmembranen erm6glichen, sind wenig geeignet, die Ph/~nomene an den untersuehten Mitochondrien zu erkl/iren. M6glicherweise spielen in diese Problematik noch unbekannte Farbstoffeffekte hinein, da der Anteil verwaschener Cristae unter NR, verglichen mit anderen Transformationen unter dem gleiehen Farbstoff, unverh/iltnism/~gig hoch ist. GRUNDMANN (1964) sieht in einer initialen Erweiterung des osmiophoben Spaltes der Cristae den Beginn eines circulus vitiosus, der - - in Anlehnung an GREEN infolge der Entkoppelung der oxydativen Phosphorylierung zu fortsehreitender Mitoehondrienschwellung ffihren soll. Nun erweist sich in unseren -

-

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R. WI~:LER:

Versuchen, da$ in der Regel gerade das Gegenteil der Fall ist. Nicht Schwellung, sondern Verkleinerung und Matrixverdichtung begleiten die Cristaebl~hung. Es scheint fiberhaupt fraglich, ob das Auseinandertreten der in ihren gegenseitigen Beziehungen erhaltenen Cristaemembranen eine Entkoppelung bewirkt. THI~L (1959) deutet die Zunahme der Osmiophihe der Matrix als Folge einer FunktionsstSrung, die zur Anh~ufung elektronendichten Materials ffihre, das wahrscheinlich sonst nur passager in das Organell aufgenommen wird. Nach HARMAN~ und O'HEGARTY (1962) soll die Matrixverdichtung irgendwie mit dem Elektronentransportsystem in Verbindung stehen; WILSO~ und LEDUC (1963) sehen diese als vermutlich durch eine Entkoppelung der oxydativen Phosphorylierung bedingt an. In Zusammenhang mit 02-MangelzustKnden wird sie yon BJSRKMA:NN und THORSELL (1962) und DVNCAN und HILD (1960) gebracht. Es lassen sich hier also wieder Querverbindungen ziehen zwischen diesen Beobachtungen und den MutmaI~ungen fiber einen Angriffspunkt der verwandten Vitalfarbstoffe an der Atmungskette. Schwellung und Schrumpfung kSnnten demnach auf eine gemeinsame Ursache zurfickgehen. Es steht dies in Einklang mit l~berlegungen, die eine Matrixverdichtung als besondere Schwellungsform betrachten (HARMAN und O'I-IEGARTu 1962). Der Cristae-Bl~hung dfirfte eine Einw~sserung in den intracristalen Raum zugrunde liegen (DAVID,1961). Vermutlich hi~ngt auch sie mit der gestSrten Energiefreisetzung zusammen. Es w~ire zu erw~gen, in wieweit sich die Mechanismen Matrixverdiehtung und Cristaeschwellung gegenseitig bedingen, dergestalt, dab diesem Vorgang eine Flfissigkeitsverschiebung yon einem in den anderen Raum zugrunde liegt, da Einws aus extramitochondrialen R~umen erfahrungsgem~i~ zu Schwellung des Gesamtmitochondriums mit Aufhellung der Matrix ffihrt. Bemerkenswerterweise verursacht NR Matrixverdichtungen ohne oder mit nur geringer Cristae-Blhhung. Sehr i~hnliehe Bilder wie bei unseren Akridin-Versuchen sahen wir bei YANAGIMOTO (1962), der Leberzellmitoehondrien elektronenmikroskopisch nach intragastrialer Injektion yon SesamS1 beobachtete. Zu ganz anderen Anschauungen gelangen OBERLING und BERNHARD (1961): Demnach sei die Hiiufigkeit des Vorkommens von Mitochondrien mit dichter Matrix in Krebszellen tin Ausdruck erhShter Regereationsfrequenz. Ffir diese Interpretion mag das Ansteigen der Zahlen bei zunehmender Intoxikation, d.h. j edoch zunehmendem Mitoehondrienzerfall und dadurch ausgelSster Mitoehondrienneubildung, sprechen. Es f~llt uns jedoch schwer, diese These zu stfitzen, einmal wegen der oben entwickelten Anschauung, zum anderen wegen der Kombination mit Cristaebli~hungen, vor allem aber anch wegen des Fehlens yon Bindegliedern, die einen Hinweis auf die Entstehungsart dieser Mitochondrien liefern wfirden. Ebenfalls auf dem Boden der Spekulation bewegen wir uns bei den Uberlegungen bezfiglich der Entstehung ringf5rmiger Cristae. Da~ die Vitalfarbstoffe diese fSrdern, hat sich eindeutig erwiesen. Berichte anderer Antoren fiber ringf5rmige Lamellensysteme lassen dig Beziehung dieses Ph~nomens zu angespannten Energieversorgungszusti~nden der betreffenden Zellen erkennen (DAVID, 1961; HAYWARD, 1961; BJORKMANN und THORSELZ, 1962; KIESSLING und TOBY, 1964). Anderen F~llen liegen vermutlich Degenerationserscheinungen zugrunde (DE I:~OBERTIS und SABATINI,1958; DAVID, 1961; WESSING, 1962). Die von uns beobaehteten Mitochondrien mit ringfSrmigen Cristae lassen keinerlei Degenerations-

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zeichen erkennen. Nach HAYWARD sollen Ringformationen durch Wachstum existenter Cristae entstehen. Auch wir glauben, belegen zu kSnnen, dab die Cristae, die ohnehin in den Ascitestumorzellen eine Neigung zeigen, schwachbogig zu verlaufen, sich immer starker vorkuppeln bis zur mehr oder minder vollst~ndigen Abkugelung. Dabei erfahren die Cristae eine erhebliche 0berfl~chenvergrSBerung, was einer Vermehrung atmungsaktiver Enzyme gleichkommt. Zum anderen stellt die Abkugelung einen Zustand dar, zu dessen Strukturerhaltung weniger Energie notwendig ist, als wenn es sich um ein System parallelisierter Lamellen handeln wiirde. So betrachtet, stellt die Bildung ringfSrmiger Membransysteme eine Adaption an die erhShten Energieanforderungen dar, zumal diese Ver~nderung besonders gut erhaltene Mitoehondrien betrifft. 0 b sie das Ergebnis direkter Farbstoffeinwirkung ist, mug offenbleiben. Den umstrittenen Beobachtungen fiber Verluste der MitochondrienauBenmembranen haben wir eigene hinzuffigen kSnnen. Unsere Befunde unterstfitzen dabei die Ansicht, da[~ solche Ver/~nderungen intravital vorkommen. Dabei k6nnen diese Verluste Ausdruck einer bestimmten Stoffwechselaktiviti~t der betroffenen Zellen sein (LEVER, 1957; PALADE und SCHIDLOWSKY,1959) oder sie repr/isentieren eine Stufe des Mitochondrienabbaues (DAVID, 1961; HOFFMEISTER, 1961). HOFFMEISTER beschreibt eine Perforation der Mitochondrienhfille in ersch6pften Flugmuskeln der Wespe, wobei der Inhalt der Mitochondrien ausflieBen soll. In unseren Untersuchungen scheinen die AuBenmembranen eher zu ,,verd~mmern". Dieses Geschehen w~re mit einer fortschreitenden Aufhebung der molekularen Orientierung innerhalb geriehteter Phospholipid-Protein-Folien zu erkli~ren. Aufbrfiche und Verlust der umhfillenden Mitoehondrienmembran werden auch von WEISSEHFELS (1957, 1958), WOHLFARTH-BOTTERMANN(1957, GUSEK (1960, 1962), GusEx und SANTORO (1961) mitgeteilt und als Aktiviti~tssteigerung (Aussehleusung von Enzymen) gedeutet. Wir mSehten annehmen, dab es sich bei den von uns beobachteten Mitochondrien um eine spezielle Form der Degeneration handelt, speziell deshalb, weft lediglieh NR eine massive Vermehrung solcher fast ,,hfillenloser" Mitochondrien bewirkt. Ffir den degenerativen Charakter spricht ebenfalls, dal~ zahlreiche Untersucher des Schwellungsverhaltens der Mitochondrien die Reversibilit~t dieses Vorgangs a|s abh/~ngig v o n d e r Intaktheit der AuBenmembran erkannten. b) Beziehungen der Mitochondrien zu anderen Zellstrukturen Die Zusammenlagerung von Kern und Mitochondrien wird gewShnlieh auf zweierlei Ursaehen zurfickgeffihrt: 1. als Zusammenwirkung bei der Verarbeitung und Ubertragung von Substanzen vom Kern zum Cytoplasma und umgekehrt (ORHSTEIN, 1956; NORTH und POLLAK, 1961; u.a.), 2. als Ausdruck der Mitochondrienbildung durch den Zellkern bzw. seine Bestandteile (HOFFMANN und GRIGG, 1958; BRANDT und PAPPAS, 1959; MOLLENHAUER, WtIALEY und LEECH, 1960; SCHJEDE und MCCANDLESS,1962; SCttJEDE,McCANDLESSund MUNH, 1964; BELL und MOHLETHALER,1964; BiczYsKo, 1964) oder in der unmittelbaren Kernumgebung (BERGER,1964, 1966; BLUME und SCHARF, 1964). Wir selber konnten keine Formationen entdecken, die die Kern-Mitochondrien-Beziehung als in die Mitoehondrienbildung integriert begfinstigen. Die geringe Differenzierung kern-

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naher Mitochondrien freilich kSnnte in dieser Weise interpretiert werden. I m Verlaufe der Kontaktaufnahme erfolgt mSglicherweise eine Ausstattung der Mitochondrien mit im Kern gebildeten Substanzen, vermutlich Nukleins/iuren. Diese Beobachtung 15st iedoch das Problem der Mitoehondrienmorphogenese nicht, da die assoziierten Mitochondrien zwar weniger differenziert, aber eben doch eindeutig Mitoehondrien waren. Sie mag allenfalls zur K1/~rung von Fragen der Mitochondriendifferenzierung beitragen. Die oben angedeutete MSglichkeit wird noch weiter dadurch eingeschr/inkt, daB peril)here Mitochondrien h~ufig Ribosomen angelagert haben, so dab auch fiber diese eine RNS-Ausstattung erfolgen k6nnte. Die Mitochondrien-Zellkern-Beziehungen diirften also wohl der Transaktion von Stoffwechselprodukten dienen. Wenn wir mit KLINGENBERG (1965) U.a. annehmen, dab ein t~bergewieht der Matrix fiber die Membransysteme ein Hinweis auf hShere synthetische Aktivit/it der betreffenden Mitochondrien ist, so kSnnte die ,,mangelhafte" Mitochondrienstrukturierung in Kernn/~he mit Syntheseleistungen der Mitochondrien erkl/irt werden, wie es ORNSTEIN (1956) rut, der sie an der Bildung feulgennegativen Materials beteiligt glaubt. NORTH und POLLAK (1961) sehen in dieser Zusammenlagerung m6glicherweise eine Kontrolle des zellul/iren DPNStoffwechsels und verweisen auf die H/tufigkeit/~hnlieher Beobachtungen in rasch sich entwickelnden Zellen. Die Art des Zusammenwirkens dfirfte sich unter Vitalfarbstoffen bedeutend /indern. Wie wir gesehen haben, k o m m t es hierbei zu einer relativen und absoluten Konzentration der Mitoehondrien in der Kernumgebung. Der Schwund peripherer Mitochondrien, der wohl durch die Intoxikation mit den Farbstoffen bedingt erkl/~rt werden kann, ffihrt zu einer relativen, die Verschiebung peripherer Mitochondrien nach zentral zu einer absoluten Verdiehtung. - - MSglicherweise spielen auch hier Effekte mit, wie sie STAUBESAND,WITTEKIND und RENTSCH (1965, 1966) hinsichtlich der Einwirkung verschiedener Vitalfarbstoffe auf die Bildung der Substantia granulo-filamentosa in Reticulozyten feststellen konnten. Gleichzeitig pr/igt sich die Orientierung der Cristae zu K e r n m e m b r a n und Kernstrukturen st/irker aus, wobei die zur selben Zeit erfolgenden Verfallserscheinungen sich weniger an den kernnahen Mitochondrien abzuspielen scheinen. Die oft schlechte Darstellbarkeit des Zellkernes mit Vitalfarbstoffen, obwohl gerade er mit seinem hohen Gehalt an Nukleins/iuren den kationisehen Farbstoffen genfigend Reaktionspartner bSte, wurde schon frfihzeitig betont. ZEmEX~ (1938) sah die Anfhrbbarkeit des Zellkerns als mit einem ,,ganz bestimmten Kolloidzustand" verquiekt, der bei vereinzelten Kerntypen schon normalerweise ausgebildet sein soll. Naeh NASSONOV (1930) wfirde Asphyxie zu reversibler Gelbildung ffihren, die erst die M6glichkeit einer st/irkeren Farbstoffreaktion schaffen soil. Entweder ist die K e r n m e m b r a n prim/ir nieht permeabel, erst naeh erheblieher Seh/~digung, oder der Kern nimmt st/indig Farbstoff auf und entf/irbt sieh im selben MaBe wieder, es sei denn, das Farbstoffangebot ist zu hoch, so WEISSMAN~ (1953). In Untersuchungen Buc~EnS (persSnliehe Mitteilung an W~ISSMA~) und W~ISSMA~NS f/~rben sich versehiedene Zellkerne erst naeh einer Seh/idigung der Zelle, wobei dem 02-Mangel offenbar eine hervorragende Bedeutung zukommt. Es liegt daher nahe, die Intensivierung der Zellkern-Mitoehondrien-Beziehung als Ausdruek daffir zu sehen, dab die Mitochondrien an der Farbstoffelimination aus dem Kernraum entscheidend beteiligt sind u n d - - weiterfolgernd--, dab sehon nor-

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malerweise die Mitochondrien Substanzen aus dem Kernraum eliminieren, wenn auch der Turn-over lange nicht so hoch ist, was in der weniger ausgepriigten Strukturorientierung seinen Niederschlag findet. Mit der Insuffizienz der Mitochondrien, sei es (lurch Mangel an Sauerstoff oder oxydierbarem Substrat oder durch Intoxication mit Vitalfarbstoffen, kommt es zur Insuffizienz der aktiven Transportsysteme. So betrachtet, erkli~ren sich die Befunde (SE]~Gn~S, 1938) von selbst: weder mit basischen noch mit sauren Farbstoffen erzielte er eine Anf~rbung der Kerne der kleinen und mittleren Ascitestumorzellen. Zellen, die Granula und Vakuolen im Cytoplasma enthielten, speicherten den Farbstoff mehr oder weniger oft im Kern und Nukleolus, wi~hrend die degenerierten und abgestorbenen Zellen eine intensive irreversible Kern- und Plasmaf~rbung aufwiesen. Es scheint uns nicht vonnSten, wie WEISSMA~N eine ptt-Senkung als Ursache der Anf~rbung des Kernes anzunehmen. Eine solche kSnnte allerdings infolge des Versagens der Mitochondrien fiber eine Anh~ufung saurer Metabolite aus dem Kohlenhydrat- und Fettabbau erfolgen. Die intraplasmatischen Lipide stellen fraglos einen Energiepol dar, an dessen Metabolisierung durch die Mitochondrien heute nicht mehr ernsthaft gezweifelt wird. In der Ascitestumorzelle werden offenbar bestimmte Lipideinschlfisse unter Betefligung mehrerer Mitochondrien verstoffwechselt, w~hrend andere, ohne mit Organellen in Kontakt zu stehen, im Cytoplasma ruhen. Die Ausrichtung der mitochondrialen Innenstrukturen erwies sich dabei als abhi~ngig yon der Zahl angelagerter Mitochondrien, mithin v o n d e r Aktivit~t, mit der die betreffenden Lipide in den Stoffwechsel einbezogen werden. In besonders eindrueksvoller Weise oftenbart sich das Zusammenwirken von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum bei der Metabolisierung der Lipide in Chloragogenzellen des Regenwurms (WINKLES, 1966, hier weitere Literatur). Die mehrfach herausgestellte Oricntierung der Cristac repri~sentiert unserer Meinung nach die Richtung eines Stoffstromes. Ausgepr/igte Ausrichtung bedeutet demnach kri~ftige Einsehaltung in die Verarbeitung der Substanzen durch korrespondierende Strukturen. c) Die Toxicit~t der verwandten Farbstoffe im Hinblick auf die Mitochondrien Wir haben verschiedentlich betont, dab das AusmaB der zellul~ren Ver~nderungen nicht parallel dem der mitochondrialen geht. Die deutliehsten Mitochondrienumformungen linden wir gerade in Zellen, in deren Cytoplasma elektronenmikroskopisch praktisch noch keine farbstofftypisehen Ver~nderungen nachzuweisen sind, in einem Stadium also, das nach SCHMIDT (1962) dem der diffusen Anf~rbung entsprechen kSnnte. Offenbar sind zu diesem Zeitpunkt die Anforderungen an die Mitochondrien am grSBten. Vermutlich kommt es in diesem Stadium zur unmittelbaren Auseinandersetzung zwischen den Vitalfarbstoffen und den Mitochondrien. Das vitale Auftreten licht- und elektronenmikroskopiseher Strukturen (Farbstoffvakuolen etc.) ist bereits ein Zeiehen daffir, dab sich die Zelle den an sie gestellten Anforderungen zumindest vorfibergehend gewachsen gezeigt hat. Andererseits soll nicht fibersehen werden, dab vor allem bei hSheren Farbstoffkonzentrationen absterbende Zellen zur Fixation gelangen. Wir vermuten dies ffir solche Zellen, die eine ungew5hnlich hohe mitochondriale Sch/~digungsrate als Ausdruek des Zusammenbruchs ihres Energiestoffwechsels offenbaren.

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R. WII~KLER Anatomischcs Institut 7800 Freiburg i. Br., AlbertstraBe 17