Arch. Toxikol. 24, 214--228 (1969)

Zum Mechanismus der Methanolvergiftung* T o x i s c h e s A g e n s u n d E i n f l u g des S i i u r e - B a s e n s t a t u s a u f die G i f t w i r k u n g W . HEIaKEN, N. RIETBtCOCK u n d D. HENS(~I~ILEI~ Institut fiir Toxikologie und Pharmakologie der Universit~i.t Wfirzburg Eingegangen am 2. Oktober 1968

On the Mechanism o] Methanol Poisoning The Toxic Agent and the Influence o/ the Acid-Base Balance Summary. Formic acid (FA) is the toxic metabolite of methanol which is responsible for the metabolic acidosis in methanol poisoning. I t accumulates in the organism because its detoxification through the one-carbon (C1) pathways is limited by the low folate pool. I t is shown in dogs with folie acid deficiency that in methanol intoxication the plasma FA-coneentration and the degree of metabolic acidosis correlate with respect to quantity and time. The amount of F A is equivalent to the negative base excess. The distribution of F A between blood and cerebrospinM fluid (CSF) is determined by the acid-base balance. Acidification (to p H 6.67 by intravenous infusion of NH~C1), which leads to reduced dissociation of FA, results in an increased coneentration of F A in the CSF and a decrease in blood; Mkalinization (to p i t 7.48 by infusion of NattCOa) causes the opposite effect. The changes in distribution of FA found experimentally in dogs with methanol poisoning correspond in tendency, yet not entirely in extent, with the expected theoretical values derived from the Hendcrson-HasselbMch equation. Such an evaluation is done by correlating the concentration ratio CSF/plasma to the blood pH. The distribution of methanol itself, on the other hand, does not change with variations of blood pH. The toxicity of F A is determined essentially by the pH. Hemolytic activity is used as a model of its cytotoxic effect. Hemolysis increases with falling pH, and thus runs parallel to the poi~ion of undis.socia:ted F A present. The portion of free acid increases 3~/e times by lowering the p H from 7.4 to 6.9. By acetic acid and lactic acid, hemolysis first occurs at much higher amounts of undissociated acid, which cannot be reached under in vivo conditions. Key-Words: Methanol ....... Formic acid - - Distribution - - Degree of dissociation - - Cellular toxicity of formic acid.

Zusammen/assung. Der toxische 1VIetabolit des Methanols, der die metabolisehe Acidose erzeugt, ist die Alneisens~ure (AS). Sic akkumuliert im Organismus, da ihre Entgiftung im C1-Stoffwechscl durch den geringen Folatbestand begrenzt ist. An methanolvergifteten l~unden im Folsguremangelzustand wird gezeigt, dab die AS-Konzentration im Plasma und das AusmaB der metabolischen Acidose quantitativ und zeitlich korrelieren. Die AS-Mange ist dem Basendefizit i~quivalent. Die Verteilung yon AS zwischen Blur und Liquor wird yore S~ure-Basenstatus bestimmt. S~uerung (bis p H = 6,67 durch Infusion yon NH4C1 ) bewirkt bei zuriickgedr~ngter Dissoziation der AS eine Zunahme yon deren Konzentration im Liquor * Herrn Prof. Dr. L v D ~

LE~DLE zum 70. Geburtstag gewidmeb.

Zum Mechanismus der Methanolvergiftung

215

und Abnahme im Blur; Alkalisierung (bis pH = 7,48 mit NaHC03) erzeugt gegensinnige Effekte. Die experimentell an methanolvergifteten Hunden gefundenen Verteilungs~nderungen entsprechen in der Tendenz - - jedoch nicht ganz im Ausmal~ - - der aus der Henderson-Hasselbalchschen Gleichung abgeleiteten theoretischen Erwartung; die Auswertung wird als Korrelierung des Konzentrationsquotienten Liquor/Plasma zum Blut-ptt durchgefiihrt. Die Verteilung yon Methanol ~ndert sich d~gegen bei V~ri~tion des Blut-pH nicht. Die Toxicit~t der AS wird durch das pH in wesentlichem AusmaB mitbestimmt. Als ~odell der cytotoxischen Wirkung wird die h~molytische Aktivit~t herangezogen. Die tI~molyse steigt mit sinkendem pH, geht also dem Anteil an undissoziierter AS parallel. Der Anteil an freier S~ure steigt bei Senkung des pH von 7,4 auf 6,9 auf das Dreieinhalbfache an. Bei Essigs~ure und Milchsi~ure tritt eine H~molyse erst bei erheblich hSheren Anteilen an undissoziierter S~ure ein, die unter in vivo-Bedingungen nicht erreicht werden. Schli~ssr Methanol - - Ameisens~ure - - Verteilung - - Dissoziationsgrad-Zelltoxicit~t yon Ameisens~ure.

Seit 1893 (Po~L) ist b e k a n n t , d a b n i c h t Methy]alkohol selbst, s o n d e r n einer seiner M e t a b o l i t e n die t y p i s c h e n I n t o x i k a t i o n s e r s e h e i n u n g e n aus15st. Bis heute a b e t ist n i c h t eindeutig gekl~rt, ob F o r m a ] d e h y d oder Ameisenss die StSrungen des Allgemeinstoffwechse]s, die schlie$1ich in die m e t a b o l i s c h e Acidose u n d die n e u r o t o x i s c h e n Schs einschlieiL lich der A m a u r o s e mfinden, verursacht. F t i r eine entscheidende Betefligung y o n F o r m a l d e h y d t r a t Kv, ESER (1931) ein, der dieses erste O x y d a t i o n s p r o d u k t des Methanols in vivo m i t chemischen M e t h o d e n nachgewiesen zu h a b e n glaubte. I n ]etzter Zeit sind wieder y o n K I w i u. Coorw~ (1962) Befunde b e i g e b r a c h t worden, die ffir F o r m a l d e h y d sprechen: Sie wiesen eine 50 % - H e m m u n g der a n a e r o b e n G l y k o l y s e u n d eine 27 % - I t e m m u n g der G l u k o s e o x y d a t i o n in Ochsenretina durch 0,5 mM F o r m a l d e h y d n a c h ; 1 m M u n t e r d r f i c k t e die P h o s p h o r y l i e r u n g vollst~ndig. Neuere Befunde y o n MALOR~Y U. Mitarb. (1965), I~IETB~OCK (1965) sowie KEWITZ u. SCHLEDE (1968) sprechen a b e t gegen eine ins G e w i c h t fallende Rolle von F o r m ~ l d e h y d als toxisches Agens bei der Methanolv e r g i f t u n g : Sie k o n n t e n zeigen, d a b d e r A l d e h y d i m Organismus verschiedener W a r m b l f i t e r aul~erordentlich rasch zu F o r m i a t u m g e s e t z t wird, bei p a r e n t e r a l e r Zufuhr ganz fiberwiegend schon in d e n E r y t h r o cyten. Die I t a l b w e r t s z e i t betri~gt n u r ca. 1 rain. Der Rolle der Ameisens~ure bei der M e t h a n o ] i n t o x i k a t i o n h a t m a n in den ]etzten J a h r e n wieder erh6hte B e a c h t u n g geschenkt. Klinische B e o b a c h t u n g e n , bei denen der Si~ure/Basenstatus m i t m o d e r n e n Mikrom e t h o d e n g e n a u k o n t r o l l i e r t werden konnte, e r g a b e n weitgehende Para]lelit~tt zwischen F o r m i a t k o n z e n t r a t i o n im P l a s m a u n d AusmaB der m e t a b o l i s c h e n Acidose (WIET~ U. BEI~TItELSEN, 1964; E~LA~SO~ u. Mitarb., 1965). Die vorliegende A r b e i t h a t sich die A u f g a b e gestellt, die

216

W. I'IEI~KEN, ~k~.I~IETBI~OOJK und D. ~-~EI~-SCI~LEI%:

Rolle d e r Ameisensiiure als toxisches Agens bei der M e t h a n o l v e r g i f t u n g in gezielten Versuchen a n geeigneten t i e r e x p e r i m e n t e l l e n Modellen q u a n t i t a t i v abzukliiren. F r i i h e r e p h a r m a k o ] o g i s c h - t o x i k o l o g i s c h e S t u d i e n fiber den Mechanisruns d e r M e t h a n o l v e r g i f t u n g ffihrten zu sehr unterschiedlichen Result a t e n . D e r G r u n d tiegt i n aut~erordenttichen Speeiesunterschieden beziiglich d e r F ~ h i g k e i t z u r E n t g i f t l m g y o n Ameisens/iure. N e u e r e U n t e r s u c h u n g e n h a b e n e r g e b e n (I~IETBI~OCK, 1968), d a ~ die G e s e h w i n d i g k e i t d e r A m e i s e n s g u r e e l i m i n a t i o n eine F u n k t i o n des F o l s ~ u r e b e s t a n d e s im O r g a n i s m u s ist. W ~ h r e n d die m e i s t e n T i e r a r t e n Ameisens~ure reJativ rasch ausschleusen k6nnen, weisen Mensch u n d I I u n d b e i d e m v e r g l e i c h s weise geringsten F o l a t b e s t a n d auch die liingsten H a l b w e r t s z e i t e n ffir F o r m i a t auf. Die folgenden U n t e r s u e h u n g e n sind d a h e r a n H u n d e n durchgeffihrt worden. A n dieser T i e r a r t gelingt es, d u t c h V o r b e h a n d t u n g m i t d e m Folsi~ureantagonisten A m e t h o p t e r i n eine m e t a b o l i s c h e Acidose d u t c h M e t h a n o l zu erzeugen, die in A b l a u f u n d Ausmal3 m i t d e r bei menschlieher V e r g i f t u n g b e o b a c h t e t e n w e i t g e h e n d f i b e r e i n s t i m m t .

Methodik Versuchstiere und Versuchsablau/ Ms Versuch~tieredienten I-Iunde und Batten. 15 Flunde wechselnder Provenienz, ~asse und beiderlei Geschlechts yon 6,5--35 kg erhielten standardisier~es Prel]futter ,,Altromin-H" und Wasser nach Belieben. W~Lhrend der Versuche wurden sie in S~offwechselk~figen gehalten. Zur Erzeugung eines Fols~uremangelzustandes erhielten sie am 3. Tage vor dem eigentlichen Versuch 0,75 mg/kg Amethopterin (Methotrexat| einmalig per os. Methanol wurde 30% ig in Ringer-LOsung intraven6s verabfolgt. In bestimmten Zeitintervallen wurde dann Btut aus einer Beinvene entnommen zur Bestimmung der Methanol- und Formiatkonzentrationen im Plasma sowie der S~ure-Basen-Xquivalente. Zur Bestimmung der Methanol- und Formiatspiegel im Liquor wurden die Tiere mit 25 mg/kg Pentobarbital narkotisier~, intubiert und der Liquor aus der Cis~erna magaa durch Punktion ent.nommen. Zur Variation des Btut-ptt wurden 4% ige LSsungen yon I~HaCI bzw. NattCO a solange iniundiert, bis die gewtinsehte pH-J~nderung erreicht war. Zur Priifung der hiimotytischen Wirkung yon Ameisensiiure erhielten l ~ t t e n steigende Dosen yon 0,2 M-L6sungen von Ameisen~si~ure (0,047--3,0 mMol/kg), Milehsiiure (0,188-3,0mMol/kg) oder Salzsaure (0,3--3,0ml~[ol/kg) intraven6s. 15 rain sp~iter wurden die Tiere in ~thernarkose aus der A. carotis entblutet und der Hamoglobingehalt im Vollblut und Plasma bestimmt. Analogversuche in vitro wuI'den am frischem Hundeblut durehgefiihrt, das zu gleiehen Teilen mit isotonem (0,15 M) Na-Formiat-, Na-Aeetat- und Na-Lactat-Puffer (pH variiert yon 4,0 bis 6,5) 15 min bei Zimmertemperatur inkubiert wurde. Be~timmung yon Methanol uncl Formiat in Plasma und Liquor cerebrospinalis. Methylat]cohol wurde nach Abdestillation aus Plasma- bzw. Liquorproben durch phosphorsaures Kaliuml0ermanganat reduziert und als Farbkomplex mit Chromotropsaure bestimmt~ ( B ~ . a ~ s , 1949). Formiat wurde aus Plasma- bzw. Liquorproben sauer abdesti]liert, danach mit metallischem Magnesium reduziert und als

Zum Meehanismus der Methanolvergiftung

217

FormMdehyd ebenfalls mit Chromotrops~ure bestimmt (Einzelheiten bei ]~IETBROCKU. H~N~IC~IS,1964). S~iure-Basen-Aquivalente und pit bestimmten wir mit dem Mikroverfahren nach SIGGARD-ANDERSENU. Mitarb. (1960) im Astrup-pH-Meter 22 (Radiometer AME-1, Kopenhagen). Dazu wurde Blut unter Luftabschlug aus einer nichtgestauten Vene unmittelbar in die heparinisierten Glaskapillaren (Typ D 551) entnommen. Liquor cerebrospinalis wurde unter strengem Luftabsehlug aus der in der Cisterna magna liegenden Punktionskaniile abgenommen. HdimogIobinbestimmungen im Vollblut wurden nach der Cyan-Met-Hb-Methode yon BETKE U. SAVELSBEICG(1950) vorgenommen. Im Plasma wurde Hamoglobin als Hb02 - - verdiinnt oder unverdfinnt - - bei 414 nm gemessen. Zur Bestimmung der Bindung von Formiat an Plasmaeiwei[3k6rper wurde friseh gewonnenes Hundeplasma mit gleichen Teilen Natriumformiat (20 raM) 30 rain bei Zimmertemperatur inkubiert und ansehlieBend fiber 5 Std gegen Aqua bidest. dialysiert bei stiindlicher Erneuerung des Dialysierwassers. Im Plasma wurde die Formiatkonzentration am Beginn und zum Ende des Dialysiervorganges, im Dialysierwasser dagegen stiindlich bestimmt.

Ergebnisse 1. Formiatkonzentration im Plasma und metabolische Acidose A n F o l s ~ u r e m a n g e l - H u n d e n ( A m e t h o p t e r i n - V o r b e h a n d l u n g ) gelingt es, m i t 2 g/kg Methanol eine metabolische Acidose zu erzeugen. Die R e s u l t a t e a n 5 H u n d e n s]nd in Tabelle 1 zusammengestellt. W/ihrend der Methanolspiegel y o n urspriinglich 82,6 mMol/1 best/~ndig abf~llt, steigt die Ameisens/s a n u n d erreicht n a c h 48 u n d 72 Std m i t 11,3 bzw. 10,1 m~q/1 ihr M a x i m u m . Gleichlaufend m i t der F o r m i a t a k k u m u l a t i o n steigt das Basendefizit an, pC02 u n d p H sinken ~b. Bei allen g e n a n n t e n Gr6gen besteht n i c h t n u r hinsichtlich der Geschwindigkeit des Anstiegs u n d der A u s b i l d u n g des Maximums, sondern auch i n bezug auf die Rtickkehr zu n o r m a l e n W e r t e n Parallelit/it. Das Basendefizit, eine die metabolische Aeidose k e n n z e i e h n e n d e MeBgr6ge, wurde in seinem Verhalten zur Ameisens/iurekonzentratio detaillierter u n t e r s u e h t . Die K o r r e l a t i o n der beiden GrSgen ist als Tabelle 1. Siiure-Basenhaushalt sowie Methanol- und Formiatkonzentration im Plasma yon 5 mit 2 g/IcgMethanol vergi/teten Hunden (Durchschnittswerte). Vorbehandlung mit Amethopterin (0,75 mg/kg 3 Tage vor Methanolgabe) (2 i sz) Std nach Methanolzufuhr

pH

0,25 24 48 72 96

7,36 :j- 0,01 7,31 ~ 0,02 7,27 ~ 0,03 7,28 • 0,04 7,33 ~- 0,02

pCO2 (mm Hg) 37,7 :j_ 1,6 33,9 • 0,6 32,6 :J=2,3 35,1 ~: 3,2 38,1 • 2,6

Basendefizit Formiat (ms

(mAq/l)

4,0 -E 0,9 8,4 • 1,4 ll,1 • 9,6 :~ 1,9 5,5 ~ 1,8

0,5 :J- 0,0 7,9 • 0,4 11,3-t=1,5 10,1 • 7,2 :~ 2,4

Methanol (mMol/l) 82,6 ~: 3,5 66,2 ~: 5,2 44,3 i 7 , 2 25,0:j: 7,1 6,0 :~ 5,0

218

W. I-IERKEN,N. ]~IETBROCKund D. tt~NSOt~ER:

Diagramm aus s/~mtliehen Einzelbestimmungen in Abb. 1 aufgezeiehnet. Dana.eh besteht zwisehen Basendefizit a n d Formiatkonzentration eine enge Korrelation. Die Gleiehung der (vermittelnden) Regressionsgeraden wurde mit y = 2 , 1 6 @ 0,831 x erreehnet. Sie schneider die Ordinate beim normaten Basendefizit yon 2,16 m~q/1. Die Steigung dieser Geraden ist allerdings von 1 signifikant verschieden (0,01 > p > 0,005). Es kann also 12

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Abb. 1. Korrelation zwischen Ameisensgurekonzentration im Plasma und Basendefizit bei mit 2 g/kg Methanol vergifteten Hunden im Fols~uremangelzustand

das Basendefizit bei niedrigen Formiatkonzentrationen (1--4 m•q/1) nur zum Tell dutch die vermehrte Ameisens/~urekonzentration verursaeht sein. Ab 5 mAq/1 entspricht dagegen das Basendefizit 80--90% der Ameisensgurekonzentration. Daraus ist abzuleiten, da6 die metabolisehe Aeidose bei Methanolvergfftung zumindest in ihrer sts Ausbildung fast aussehlieBlieh dutch die aus Methanol gebildete nnd im Orga.nismus akkumulierte Ameisens~ure bedingt ist.

2. Ein/lufi des Blut-pH a,u[ Dissoziation und Verteilung der Ameisensiiure Wie vorgehend ausgeffihrt, kann eine deutIiche metabo]isehe Acidose bei Methanolvergiftung des Hundes dam1 ausgelSst werden, wenn die Tiere mit Amethopterin vorbehandelt worden shld. ~Vcitere Versuche

Zum Mechanismus der lgethanolvergiftung

219

haben ergeben, dab diese Vorbehandlung, die noeh mit vielerlei anderen, im einzelnen nieht immer zu fibersehenden Nebenwirkungen verbunden ist, umgangen werden kann, wenn man die Methanoldosis erhSht. I m allgemeinen werden yon gesunden Hunden 4 g/kg Methanol - - einzeitig verabfolgt - - fiberlebt. Dieses Behandlungssehema haben wit ffir die im folgenden beschriebenen Versuehe gew~hlt. Insgesamt 10 Itunde erhielten 4 g/kg Methylalkohol i.v. Naeh 48 Std, da die Ameisens/~nrespiegel den maximalen Stand erreieht haben und fiber ca. 24 Std nahezu konstant bleiben, sind bei den Tieren in Pentobarbital-Narkose bei Spontanatmung naeh Intubation die Versuehe zur Ermittlung der Ameisens~ureverteilung durehge~fihrt worden. Da der Ss allein dureh die l~arkose gewisse Ver~tnderungen erleidet, haben wit zun~chst 3 narkotisierte, dureh Methanol vergfftete Tiere ohne weitere Behandlung als Kontrollen fiber 6 Std untersucht. Bei 4 weiteren Tieren wurde eine S~uerung dureh Infusion einer 4%igen NH~C1-L6sung (Infusionsdauer: weehselnd yon 35--180 rain) vorgenommen, bei 3 anderen Itunden eine Alkalisierung durch Infusion einer 4 % igen NaHCO3-L6sung (Infusionsdauer: 70--150 rain). Stfindlieh wurden Methanol und Formiat in Plasma und Liquor, der Ss status (pH, pC02, Standardbicarbonat und Basenfibersehul]) in Blur und Liquor zum Tefl in kfirzeren Zeitabst~tnden je naeh Erfordernis bestimmt. Aus den ffir jeden Entnahmezeitpunkt gewonnenen Formiatwerten wurde der Quotient der Konzentrationen im Liquor und im Plasma erreehnet. Eine Summenauswertung der einzelnen Parameter innerhalb der drei Versuchsgruppen erweist sich als unvorteilhaft, da die Ausgangswerte - - vor allem bezfiglich der Formiatspiegel - - nicht unerheblich differieren. Auch stellt sich heraus, dab die Anderungen des p i t zu verschiedenen Zeiten nach Beginn der Behandlung eintre~en. Wir haben daher zuns den Verlauf bei je einem Tier unter NHr und NaHCOaBehandlung in Abb. 2 anfgezeichnet. Sofort nach Beginn der Ammoniumchlorid-Infusion steigt das pH im Liquor an; dieser Effekt ist schon fffiher beschrieben worden ( W ~ T ] ~ S T E ~ U. G6KHAlV, 1952). Es h~lt sich dann aber fiber mehrere Stunden praktisch unver~Lndert. I m Blur sinkt das p H erst naeh einer halben Stunde ab, die fallende Tendenz h~lt bis zum Ende der Infusion an, danach steigt der Wert des p i t sehr z6gernd wieder an und erreicht selbst naeh 6 Std noeh nicht die Ausgangsh6he. Der Plasmaformiatspiegel f/tilt so,oft merklich ab und bleibt dann anf der geringeren tI6he praktiseh konstant. Die Konzentration im Liquor steigt bis zum Infusionsende yon 2,4 auf 2,7 mMol/1 an, danaeh kehrt sie relativ raseh zum Ausgangswert zurfick. Die Quotienten aus den Konzentrationen in Liquor und Plasma, anf dem unteren Tell der 15

Arch. Toxikol., Bd. 24

220

W. I-IERKEN, ~ . RIETBROOK u n d D. lzIE~TSOHLER:

Abb. 2 aufgetragen, sfeigen dementsprechend am Anfang st/~rker, sp/iter weniger deutlich an und halten sich bis zum Versuchsende etwa auf der gleichen HShe. Unter der Bicarbonat-Infusion/indert sich das Liquor-pH weniger stark, abet noch deutlich, das Blut-pIt steigt w~hrend der gesamten Infusionszeit bis auf 7,48 an. Die Formiatspiegel verhalten sich in IAquor NHz,Ct 4%408ml V////////////A

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Abb. 2. Eirrflul~ yon NtIaC1 (linke Seite) und NaHCO3 (rechte Seite) auf den pItWer$ in Blur und Liquor cerebrospinalis, auf Formiatkonzentrationen in Plasma und Liquor cerebrospinalis sowie auf die experimentell gefundenen und nach G1. (II) berechneten Formiat-Konzentrationsgradienten bei zwei mit 4 g/kg Methanol vergiftefen Hunden (Beginn der Ntt4C1- bzw. hTaHCOa-Infusion48 Std nach 1VIethanolzufuhr) und Plasma etwa gleiehsienig: nach initialem Ansteigen tritt zur Mitre der Infusionszeit hie eie deutlicher Abfall eie, der sich beim Liquor weiter verst/~rkt, beim Plasma wieder abschwacht, so dab dort am Ende der Infusion wieder der Ausgangsspiegel erreieht ist. Die KonzentrationsQuotienten sieken dementsprechend wghrend der gesamten Versuchsdauer fortlaufend ab, und zwar yon 0,63 auf 0,37. Aus den vorstehend beschriebenen Versuchen ist abzulesen, dab die Permeation yon ~ormiat aus dem Blur in den Liquor stark vom p i t und damit yon der Dissoziation abh/~ngig ist. Das Verteflungsverh/fltnis

Zum Mechanismus der Methanolvergifmng

221

l~Bt sieh aus der Henderson-Hasselbalehsehen Beziehung pH = p K d-log 1--a

(I)

ableiten, Es ergibt sich daraus fiir die Verteflung zwisehen Liquor (CLi)und Plasma (Cp1) die folgende Beziehung: CLI 1-4-10(pI~u--pK) (II) CpI -- 1+10 (pI~pl--pK) " _

~'aeh dieser Gleichung erhs man bei Einsetzen der gemessenen pH-Werte in Liquor und Plasma sowie des pK-Wertes der Ameisenss yon 3,75 das theoretiseh zu erwartende Verteilungsverhiiltnis, wobei vorausgesetzt wird, dab der Verteflungskoeffizient bei gleiehen pHWerten in beiden Kompartimenten gleieh 1 ist. Da das nicht der Fall ist, mul3 die ungleiehe Verteflung beriicksiehtigt werden. Die ungleiche Verteilung zwischen Plasma und Liquor kSnnte u.a. dutch Bindung yon Formiat an PlasmaeiweiBkSrper bedingt sein. Wir haben daher die Proteinbindung yon Ameisenss wie oben beschrieben bestimmt. Die Versuche weisen aus, dab iiberhaupt keine Proteinbindung besteht, die ungleiche Verteilung also andere Ursachen haben m u l l

Wit haben daher die Resultate jewefls mit dem Quotienten, der aus den Werten vor Beginn der pH-Verschiebung gewonnen wurde, multipliziert. Die so erhaltenen Zahlen sind neben die Quotienten aus den gemessenen Spiegeln in Abb. 2 (unterer Tail) eingezeichnet. Man sieht eine Ubereinstimmung der Xnderungstendenz, bei dem mit Natriumbicarbonat behandelten Hund gehen die beiden Kurven parallel. Bei dem mit INH~C1 behandelten Tier dissoziieren die Kurven zum Ende der Infusion hin, ohne dab sich an der Grundtendenz Wesentliches s Wie oben bereits vermerkt, ist eine Summenauswertung innerhalb der 3 Versuchsgruppen nicht zweckms da die Ausgangswerte stark schwanken. Zur Formulierung des prinzipiellen Verteilungsverhaltens haben wir daher den Versueh unternommen, aus allen Bestimmungen in s~mtlichen Versuchen die gemessenen Verteilungskoeffizienten mit dem gleiehzeitig bestimmten Blur-pit zu korrelieren, und zwar ohne Beriieksiehtigung der Art der Vorbehandlung zur Xnderung des ptt. Die Resultate sind in Abb. 3 aufgezeichnet. In dieser Graphik ist zugleieh der Verteflungsgradien~ der nach G1. (I) erreehneten undissozfierten Ameisensaureanteile aufgetragen. Ffir diese Berechnung ist ein Mittelweft des Liquor-pH yon 7,31 zugrunde gelegt, da diese 1V[el3grSl3e weder bei der S/~uerung noeh bei der Alkalisierung sich wesentlieh/~nderte. Das Blut-pH sehwankt zwisehen den Extremen 7,48 and 6,67. Mit sinkendem Blu~-pH nimmt der undissoziierte Saurean~eil im Plasma zu. Im Liquor bleibt dagegen der undissoziierte S/iureanteil bei unver~ndertem p i t erwartungsgemiil3 konstant. Der errechnete Gradient aus 15"

222

W. HEI~KEN, •. RIETBROCKund D. HENSO]~LER:

undissozfiertem S&ureantefl im Plasma und undissozfiertem S~ureantefl im Liquor steigt yon 0,65 (Blut-pH 7,48) auf 4,45 (Blut-pH 6,67) an. Mit dem Anstieg dieses Gradienten erhSht sieh gleichzeitig das Konzentrationsverhiiltnis Liquorformiat/Plasmaformiat (0,46 bei piE[ 7,48; 0,99 bei p H 6,67). Die Regressionsgerade ist mit y =0,6369 x-~0,5032 bereehnet. Der Xorrelationskoeffizient r betriigt -~ 0,581. Demgegeniiber ]i~l~t eine pI{-Xnderung die Verteilung yon Methanol (Abb. 3, oberer Tell) unbeeinflul~t. Die Regressionsgerade verlgnft mit y ~ 1,0681 parallel zur Abszisse. ~ 16f

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8[ut pH

Abb. 3. Gradien#en der Konzentr~tionen yon Methanol (oberer Teil) und gesam~em Formiat (unterer Teil) zwischen Liquor und Plasma in Abh~ngigkeit yore Blut-pH. Dazu (im unteren Teil) die Gradienten ffir die nach G1. (I) berechneten undissoziierten Ameisens~ureanteile

3. Ein/lu/3 des p H a u / die Toxicitiit tier Ameisensgure Nachdem durch die oben beschriebenen Versuche ausgewiesen ist, daS die Penetration der Ameisenss ins Zentralnervensystem nnd wohl auch an die anderen Wirkungsorte stark yore aktuellen pH bestimmt wird, gilt es zu zeigen, dal~ die Giftwirkung tatsiichlich auf dem freien, undissoziierten Anteil der Ameisens~ure in den Geweben beruht. Ffir diese Untersuchung haben wir eine Wirkung der Ameisens~ure herangezogen, die zwar nach dem derzeitigen Stand der Kenntnis beider MethanolvergEtung nicht merklich ins Spiel kommt, die aber yon akuten Vergiftungen durch Ameisens~ure selbst, aueh durch Essigs~ure, gut bekannt ist: die F~higkeit zur H~molyse. Die intravitale Hi~molyse kann sowohl bei Ameisens~ure (HOLZE~, 1952/54) als auch bei Essigs~ure

Zum Mechanismus der Methanolvergiftung

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(KI~ECK~3u. Mitarb., 1962; PAAI~u. Mitarb., 1968) das Bild und den Ablauf der Vergiftung wesentlich bestimmen. Wir haben uns zun/~chst fiberzeugt, dab Ilgmolyse durch ~4maes auch im Tierversuch reproduzierbar erzie]t werden kann. Ratten erhielten in Gruppen zu je 3 Tieren L6sungen yon 0,2 M Ameisens/~ure in steigender Dosierung mit gleichf6rmiger Geschwindigkeit intraven6s. G]eiehe Ko]lektive wurden mit s Dosen yon Milchs/~ure (0,2M) oder Salzs/iure (0,2M) entspreehend behandelt.

AmeisensSure (0,2 M)

:

x i ! I !

pk 3,90

2 m Mol/kg lEG

3

Abb. 4. tI~moly~ischeWirkung yon gquimolaren (0,2 M) L6sungen yon Ameisens~ure, Milehs~ure und SMzsgurebet Ratten 15 rain nach Ende der Infusion warden die Tiere in J~thernarkose entbhltet und der tIamolysegrad als Quotient Plasma-Hb/Gesamt-Hb gemessen. Abb. 4 bringt die Ergebnisse. Danach verm5gen bereits 3mMol/kg Ameisens/iure den Hb-Spiegel im Plasma auf 4,1% zu erhShen, Milchs/~ure ist deutlieh weniger wirksam, SMzs~ure bewirkV iiberh~upt keine mef3bare tI~molyse. Ftir den Nachweis, dab die undissozfierge A:meisenss fiir die eigentlichen Gfftwirkungen verantwortlieh ist, ist das experimentelle Modell des Vollbluts in vitro leichter zu hantieren; die Verh/iltnisse b/eiben bier fibersichtlich. ~rir haben mit Htmde-Vollblut gearbeitet. ])as Blut wurde stets mit gleichen Volumina yon 0,15 M Pnffern (isoton) versegzt, und zwar Ameisensgure/Formiat, Essigs/~ttre/Ace~at sowie Milchs~ure/Lactat; die Endkonzentration im Ansatz betrug dann jewefls 0,075 M. Auf dieseWeise warden in jeder Reihe das pi t in verschiedenen Stufen varfiert und der tI~molysegrad gemessen. Aus dem naeh Zusatz der Puffer gemessenen pI-I, dem bekarmten pK und der bekarmten Konzentration wurden naeh der Henderson-HasselbMchschen Gleichung die

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W. HERKElV, ~ . RIETBROCK u n d D. HEN$OHLER:

Dissoziationsgrade erreehnet und zu den H/imolyse-Indices in Beziehung gesetzt. Die Ergebnisse sind in Abb. 5 aufgezeiehnet. Darin sind an der ffir jeden Puffer gewonnenen Kurve die aktuellen pH-Wer~e angemerkt. Da gezeigt werden sollte, dab die Wirkung veto undissoziierten S/iureantefl getragen wird, sind die H~molyse-Indiees fiber den errechneten freien S/~ureanteflen (1--~) aufgetragen. Man erkennt, dab bei allen 3 S/~uren die h~molytische Aktivit~t mit steigendem undissoziiertem Siiureanteil zunimmt. Bei Ameisens~ure ist die Tendenz am ausge8

o

' pH=pk*I~ 1-~ I Ameisens~iure/For miet {015M ) pk 3175 5'4i

6

o

"

Essigs~.ure/Acetat ( 0,15B4)

/

s,s

pk~,%

Ichsaure/Lac~a~(015M1

o

O~l" ~ 0 , 1 - ' T ~ . 0,001

~',2 0,01

I-~

~.--~ --~-" 0,I

1,0

Abb. 5. Abh~ingigkeit der h~molytischen Wirksamkeit vom Dissoziationsgrad der Ameisens~ure, Essigs~ure u n d Milehs~ure bei Inkubationsversuchen m i t Hundeblut. Die Zahlenwerte a n den K u r v e n stellen die jewefls nach I n k u b a t i o n gemessenen p t t - W e r t e dar

pr~gtesten. Hier beg~nnt der Anstieg des H~molyse-Index bereits bei einem p it von 6,8 (entsprechend 1~ undissoziiertem Antefl), in einem Bereieh also, der bei einer metabolischen Aeidose im Zuge der Methanolvergiftung durchaus erreicht werden kann. Bei pH 6,2 ist schon mehr als 1% ffeies H/~moglobin vorhanden, bei pH 5,4 sind es nahezu 7%. Bei Essigs/~ure liegen die Verhiiltnisse deutlieh anders, hier beginnt zwar die tts eberffalls bei etwa pH 7,0, der undissoziierte Anteil bel/iuft sieh dabei aber auf etwa das Zehnfaehe des bei Ameisensiiure bestimmten Wertes. Der Anstieg der Kurve ist aueh im Anfangsteil deutlieh flaeher. In der Endphase werden bei dieser S~iure dann wiederum iihnliche H/imolysegrade bei entspreehenden pH-Werten gefunden wie bei Ameisens~ure. DaB nun nicht der pH-Wert an sieh, sondern tats/iehlieh der undissoziierte Anteil Ifir die hEmolytisohe Wirkung verantwortlich ist~ zeigt die Versuehsreihe mit Laetat-Puffer. Hier beginnt die H/~molyse

Zum Mechanismus der Methanolvergiftung

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erst bei p H 4,6, dann steigt die K u r v e aber stefi an, u m b e i p i t 4,5 bereits ca. 3% Itiimoglobin zu erbringen. Dabei ist der undissoziierte S~ureanteil zweifach hSher als bei Essigsi~ure und ca. 20faeh hSher als bei Ameisensi~ure. Die Beziehungen zwischen H~molyseaktivit~t und undissoziiertem S&ureantefl sind zur besseren Vergleiehbarkeit noehmals in Tabelle 2 anfgeffihrt. Dabei ist in der letzten Spalte die ffir die einzelnen S~uren errechnete Relation angegeben. Tabelle 2. Abhiingigkeit des H~imolysegrades yore undissoziierten Siiureanteil dreier organischer Siiuren

Plasma-Hb/ Gesamt-tIb • 100

Undissoziierter S~ureanteil Ameisens~ure

Essigs~ure

Milchs~ure

Verh~Itnis

1,1 2,9 5,5

0,004 0,011 0,020

0,040 0,096 0,150

0,180 0,200 --

1 : 10: 45 1 : 9:18 1: 8

Aus diesen Befunden kann geschlossen werden, dal~ die Giftwirkung yon Ameisensi~ure, hier am Modell der ttiimolyse gezeigt, v o m undissoziierten Si~ureanteil getragen wird, der seinerseits wieder yon der aktue]len Reaktion bestimmt wird. J e sti~rker die Aeidose, u m so hSher der undissoziierte S~ureantefl und damit um so starker die Giftwirkung.

Diskussion Die Frage nach dem eigentlich toxischen Agens bei der Methanolvergiftung schein~ nun endgfiltig dahingehend beantwortet, dab das Kardinalsymptom, die metabolische Acidose, allein durch die Ameisens~ure verursacht wird. Die hier vorgelegten quantitativen Untersuchungen haben eine eindeutige Korrelation zwischen der Ameisens~urekonzentration im Blur und dem Ausma~ der metabolischen Acidose ergeben. Formaldehyd scheidet als Tr~ger der Giftwirkung aus, da er nach frtiheren Untersnchungen (MAnol~r u. Mitarb., 1965; RI~Tm~ocx, 1965) auBerordentlich rasch und komplett im Organismus zu Ameisensgure oxydiert wird. Ferner kann durch Infusion entsprechender Ameisensauremengen eine metabolisehe Acidose erzeugt werden, die der durch Methanol herbeigefiihrten gleicht. Die vorgelegten Untersuehungen haben zwei neue Gesichtspunkte zur Wirkungsweise der Ameisens~ure erbracht. Am Beispiel der h~molytischen Aktivit~t ist gezeigt worden, dab die membransch~digende Wirkung der Ameisensgure nur yore undissoziierten Antefl getragen

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W. HEI%KEN,N. ~IETBROCKund D. HENSCHLER:

wird. Gleichartiges Verhalten ist auch bei den Wirkungen am ZNS zu erwarten. Ober das biochemische Substrat der H/imolyse und der Zellsch~digung allgemein durch Ameisens/~ure kann aber z.Z. noch keine Deutung gebracht werden. Hingegen gibt es Anhaltspunkte ffir den Angriffsort der h/~molytischen Wirkung. Bekanntlieh durehdringen organische S/~uren und Basen die Erythroeytenmembran in Abhs yon ihrer LipoidlSslichkeit. Hierbei diffundieren stark dissozfierte, sehwaeh lipoid15sliche organisehe Basen langsamer als stark dissozfierte, schwaeh lipoidlSsliehe organisehe S/~uren ( S c ~ A ~ I ~ u. NA~PI~OTIS, 1960). Dies wird darauf zurfiekgeffihrt, dab die Erythroeytenmembran positiv geladene Poren verschiedenen Durchmessers aufweist, die die S/~ureAnionen leiehter als die basisehen Kationen passieren lassen (ScHA~]~I~, 1962). Die Ameisenss sollte bei physiologischem p i t und fast vollst/~ndiger Dissoziation ganz fiberwiegend durch die Poren diffundieren. In der Tat befindet sieh bereits 5 rain naeh intravenSser Infusion von Natriumformiat 50% der Blutkonzentration in den Erythroeyten ( W ~ I D ~ , 1966). Bei Senkung des pH, d.h. bei ErhShung des undissozfierten Anteils, kann die Permeation yon Ameisens/~ure fiber die Lipoidphase der Membran st/~rker ins Spiel treten. Dies deutet - - im Gegensatz zu den meisten typisehen H/imolysegiften - - auf einen Angrfff der Ameisens/~ure innerhalb der Blutzelle. Die weiteren Resultate fiber das Verteilungsverhalten yon Ameisens/~ure in Abh/~ngigkeit yore S/~ure-Basenstatus bringen eine Erkl/irung ffir die LokaHsation einiger Giftwirkungen am Zentralnervensystem. Mit zunehmender S/~uerung steigt der Anteil der in den Liquor eerebrospinaIis fibergetretenen Ameisens/~ure. Dieses Verteflungsverhalten wird aus den allgemeinen Gesetzen fiber die Penetration organiseher Molekfile in den Liquor verst/indlich. Die Stoffe penetrieren biologisehe Membranen vorwiegend in ihrer undissozfierten, lipoidl6slichen Form. Ffir den Ubertritt yon Substanzen aus dem Blur in den Liquor cerebrospinalis sind zwei physikalische Eigensehaften maBgeblich: die Dissoziationskonstante und die LipoidlSslichkeit. Damit wird das pHGef/~lle vom Blur zum Liquor zum bestimmenden Faktor ffir die Diffusion (RALL U. Mitarb., 1959; BnoDI~ u. Mitarb., 1960; SCHA~K~, 1962) und das AusmaB der Giftwirkung der Ameisens/~ure. Die Ameisens/~ure mit einem p K yon 3,75 liegt bei physiologisehem Blut-ptI yon 7,42 nur zu 0,02% in der undissoziierten Form vor und ist daher nur in sehr begrenztem Umfang in der Lage, die Blut/Liquorsehranke zu permeieren. Bei einer Erniedrigung des Blut-pH auf 6,87, einen "Wert, der bei starker metaboliseher Aeidose erreicht werden kann, erhSht sich der undissoziierte Anteil der Ameisens/iure bereits auf 0,07%. Dementsprechend wird bei saurem p i t ein deutlieh hSherer Anteil im Liquor

Zum Meehanismus der Methanolvergiftung

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gefunden. Das Verteilungsverhalten ist in unseren Versuchen fiber den gesamten Bereich y o n p i t 6,67--7,48 aufgezeigt worden. Die gefundene Abh/ingigkeit folgt aber nur in der Tendenz, nieht streng im AusmaB dem nach der ttenderson-Hasselbalchschen Gleiehung bereehneten Verteilungsverh/~ltnis. Eine solehe Diskrepanz ist auch y o n RALL u. Mitarb. (1959) a m Beispiel y o n Sulfadiazin sowie y o n BRODIE U. Mitarb. (1960) f fir Barbital gezeigt worden. Der Grund daffir k a n n darin gesehen werden, dal~ einmal im Zeitpunkt der p I t - B e s t i m m u n g e n in Blur u n d Liquor noch kein Verteilungsgleichgewieht eingetreten ist; ferner kSnnen in anderen K o m p a r t i m e n t e n die p H - G r a d i e n t e n u n d d a m i t aueh die Verteilungsverh/~ltnisse y o n denen des Liquors verschieden sein. Aus diesen Befunden u n d Uberlegungen resultiert die Erwartung, dab eine Behebung der metabolischen Acidose bei Methanolvergiftung nicht nur eine Abdiffusion der die toxischen Effekte vermittelnden Ameisenss aus dem ZentrMnervensystem zur Folge hat, sondern aueh eine Absehw/~chung der GfftvArkung durch Z u n a h m e der Dissoziation u n d damit Verminderung der toxischen Form, der undissoziierten Ameisens/~ure, innerhalb der Zelle. Es mfil]te fernerhin eine untersehiedliehe Wirksamkeit alkalisierender Stoffe resultieren, je n a c h d e m ob sie mehr oder weniger in der Lage sind, die Acidose innerhalb der Ze]le zu beheben. Diese F r a g e n sollen in einer weiteren Arbeit (I~IET]3~OCK, HERKEN U. HE~SCHLE~, 1969) gekl/~rt werden. Den med.-techn. Assistentinnen Fraulein J. A~ME~ und Fraulein G. SCHUSTER sind wir fiir die wertvolle Mitarbeit bei der Durchffihrung der Versuche zu besonderem Dank verpflichtet.

Diskussion BETKE,K., u. W. SAVELSBERG: Stufenphotometrische Hamoglobinbestimmung mittels Cyanhamiglobin. Biochem. Z. ]~O, 431 (1950). BR~A~IS, E. : Die photometrische Bestimmung des Formaldehyds mit Chromotropsaure. Z. anal. Chem. 180, 44 (]9~9). B~OOIE, B. B., H. Ku~z, and L. S. SCHANKER: The importance of dissociation constant and lipid-solubility in influencing the passage of drugs into the cerebrospinal fluid. J. Pharmacol. exp. Ther. 180, 20 (1960). Et~LANSON,P., H. FI~ITZ, K. E. HAGSTAM, B. LInJE~BE~G, N. T~YDI~G, and G. VoIGT: Severe methanol intoxication. Acta reed. Scand. 177, 393 (1965). ttOLZER, F. J. : TSdliche Vergiftung durch konzentrische Ameisens~iure (Amosil). Samml. Vergiftungsf., Arch. Toxikol. 14, 17 (1952/54). KErsEy, E. : Atiologie und therapeutische BeeinfluBbarkeit der spezifischen toxischen Wirkungen des Methylalkohols. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmak. exp. Path. 169, 687 (1931). KEWYrz, H., u. E. S(IHLEDE: Ausseheidung und Verteilung yon Hexamethylentetramin nnd Formaldehyd. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmak. exp. Path. 2~9, 211 (1968). K ~ M. M., and J. R. CooPEn: Biochemistry of methanol poisoning. Biochem. J. 82, 164 (1962).

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