(Aus der I. Medizinischen Universit/ttsklinik Wien [Prof. Dr. Hans Eppinger].)

Uber ein neues Fluorochromierungsverfahren u n d seine Anwendung. Fluorescenzmikroskopiseher

Beitrag

zm' Eiwei[l- und Permeabilitiitspathologie. Von

Max l|aiting(% Wien und Paul Geiser, Basel. Mit 4 Textabbildungen, darunter 3 fi~rbigen.

(Eiugegangen am 12. April 194,?.) I. Allgemeine und spezielle F l u o r o e h r o m i e r u n g s t e c h n i k . Von

M. tlaiting'er. 1. Die Fhtorescenzmikroskol)ie und das Fhtorochromierungsverfahren. Die Fluorescerlzmikroskopie hat dutch ~chaffung eines lichtstarken F[uorescenzmikroskopes (1931) und dutch die Einfflhrung des Fluoroehromierungsverfahrens (1933) schorl zu beachtlichen Erfo|gen geftihrt, ~uch auf dem Gebiete der Biologie und ~[edizin. Zu pathologischen Untersuchungen ist sie noch wenig herangezogen ~vorden. Lediglich der N~(:hweis des EiweiBes bei serSsen Entziindungen (Haitinger 15) und (lie Untersuctmng einer multiplen Sklerose (Exner 1~ sind bekannt. Es sei daher einIeitetld ~uf (tie Grundlagen dieser neuen 5'[etho(ie verwiesen. Sie beruht auf der Beobachtung der Fluorescenzerseheinungen, die durch Einwirkung des u.v. Lichtes* ~uf cl~s zu beobachtende Objekt entstehen. Dieses mul~ yon einer Liehtquelle beleuchtet werden, (lie reich ~n u.v. Str~hlen ist; dabei k o m m t es nicht ~uI die Gesamthelligkeit dieser Lichtquelle ~n, sondern auf ihre Fl/ichenbelligkeit und Leuchtdiehte. Denn nut jenes U.v., das das Pr~parat trifft, erregt in (liesem Fluorescenz. Dabei muB ~lles sichtbare Licht, d~s jede derartige Lichtquelle ausstrahlt, yore Pr/ip~rat abgehalten werden, well dieses die Fluorescenzliehter iiberstrahlen wfirde. Dies wird dureh eine Filterkombination yon einem Schw~rzglasfilter und einer mit einer 20%igen wgsserigen KupfersulfatlSsung geftillten Kiivette erreicht. Dieses /iltrierla u.v. Licht oder Woodlicht geht fiber c[etl Spiegel dureh den Kondensot' des Mikroskops zum Prgl)ar~t, in we[chem es die fluorescenzfghigen Teilchen zum leuchten bringt. Alles iibrige U.v. muB vom Auge abgehalten werden, d~ es die Augenmedien irritiert, indem es Linse n~d P~etimt zum Fluorescieren bringe~t wfirde. Dies geschieht durch ein Sperrfil~er ~t~s gelbem Glas, d~s ~uf d~s ()kul~w ~ufgesetzt wird. Sonst ist am * u.v. = ultraviolett.

1Jber ein neucs Fluoroehromierungsverfahren und seine Anwendung.

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5Iikro.skop nichts zu/~ndern, jedes bessere In~trument k~mn aueh fiir die Fluorescenzmikroskopie verwendet warden. Die prinzipielle Einrichtlmg eines Fluoreseenzmikroskopes zeigt Abb. 1. Was m a n beobachtet, sind nieht Sehattenrisse des Preps,rates, die dutch eine fremde Liehtquelle entstehen, wie bei des Tt~gesliehtmikro,skopie, sondern Selbstleuchter, die im Pr/~parat, selbs~ liegen. Sic sind aul3erordentlieh klein (man denke nur an Zellkerne, Nueteoli, BakterieI~

AI,b. 1. Prinzip ~les Fhlorcszcnzmikl'oskol~CS. L Lichtquelle, t ' K o l l e k i o r , F~ lqupfcrvitri~lkiivctte, F.. Schwarzglasfiltcr, Ir Spcrrfilter a.m Okula.r.

usw.) und daher, so leuchtend sie sich dem Auge darbieten, sehr liehiisehwaeh. Deshalb erfordern mikrophotographisehe Aufnahmen viel lgngere Expositionszeigen als bei der Tagesliehtmikroskopie. Diese begragen je naeh der Vergr6f3erung 1--30 ~in. l)abei ist zu beaehten, dab das u.v. Lieht viel stS,rker bleiehend wirkt als das-Tageslieht, was sieh namentlieh bei Farbaufnahmen sehr unangenehm tmswirkt. Die Expositionszeit ktmn nut dutch Versuehe ermittelt werden, doeh gelingt es bei einiger'CTbung bMd, dab man unter 3 Aufnahmen mit versehiedenen Beliehtungszeigen ein brauehbares Bild erh~lt. Fiir die Aufnahme selbst, w/ihle man m6gliehst kleine Format'e, am besten eine Kleinbildkamera und ver~6Bere das erhaltene Bild. Als ;kufnahmematerial kann jede. orghoehromatisehe Platte verwendeg werden, nut wenn Objekte aufgenommen werden sollen, die rot oder orange fluoreszieren, ist pan-

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Max Haitinger und Paul Geiser:

ehromatisches M0~terial notwendig. Ftir Farbaufnahmen sind, weft man es mit sichtbarem Licht zu tun hat, Tages]ichtfilme zu verwenden. Der energiereichste U.v.-Strahler ist ein Lichtbogen, der zwischen Elektroden aus metallischem Eisen tibergeht (Haitinger:2). Er versagt aber bei Wechselstrom und bedarf einer sorgsamen Wartung. Er ist daher heute dureh die Quecksilberhochdrucklampe ersetzt, welche diese Nac.hteile nicht hat. Diese ist zwar im U.v. etwas lichtschwgeher als die Eisenbogenlampe, ein }Iangel, der durch die auBerordentlich ]iehtstarke F/irbung nach dem hier beschriebenen Fluorochromierungsverfahren, vollkommen ausgeglichen ist*. Sehon an nativen, also vollkommen unbehandelten Objekten, kann man ;Fluoreseenzerseheinungen beobachten, die wir als primiire oder Eigenfluorescenz bezeiehnen. Ws an pflanzliehert Objekten sehr intensiv leuehtende Eigenfluoreseenzen beobaehten kann, erseheinen die meisten Gewebselemente des tierisehen Organismus immer in versehiedenen Nfiar~een yon Blau, Blaugrau oder WeiBliebtblau, also ~ehr wenig differenziert. Nut die Lipofuscine fluoreseieren gelb und das Porphyrin leuehtend rot (vgl. die-grundlegende Arbeit, von Hamper1:7, der alle mensehliehen Organe mit Ausnahme des Auges untersuchte, das yon B6clc4 studiert wurde), l~[an kann abet dureh Behandlung soleher PrSparate mit L6sungen fluoreseierender Substanzen eine sekundiire Fluorescenz hervorrufen, dutch u'elehe die einzelnen Gewebselemente in versehiedenen distinkten Farben aufleuehten (Haitlnger und Hc~mperl:~). Solehe Stoffe heigen Fluorochrome und das ganze Verfahren Fluorochromierungsver/ahren. Dureh entspreehende Wahl der Fluoroehrome kann man dann gerade jene Gewebselemente farbig darstellen, die man untersuehen will. Diese Methode hat den Vorteil, dab nut sehr verdiinnte L6sungen zur Vemvendur~g kommen, die Einwirkungszeiten sehr kurz sind und dal3 man stets polyehrome Bilder erhs a ueh wenn m a n nut ein Fluoroehrom verwendet. :Die Ursaehe dieser Vielfarbigkeit h a t versehiedene Grfinde: Einmal ist es der Umstand, dab einzelne Gewebselemente die Farbe des Fluoroehroms annehmen, andere wieder nieht und ihre Eigenfluoreseenz beibehalten. Daneben spielt natfirlieh aueh die ehemisehe Affinit~t der Fluoroehrome zu den einzelnen Geweben eine Rolle, ebenso wie der Verdiinnungs~ad der verwendeten Stoffe und die Wasserstoffionenkonzentration der einzelnen Gewebeslemente. Viele fluoreseierende Substanzen ~zeigen n/imlieh gerade in den p~-Bereiehen die Itir die Zelle in Frage kommen, im u.v. Lieht so auff~llige Farbumsehlage, dab sic als fluoreseierende Indikatoren verwendet werden kSnnen. :~Ian kann also unter Umst~nden mit entspreehend gepufferten L6sungen zu neuen Farbuntersehieden kommen. * Wir verwendeten fiir unsere Untersuehungen die unter der Bezeiehnung Lux UV yon den optischen Werken C. Reiehert in den Handel gebraeh~e Fluorescenzeinrichtung.

{J'ber ein neues Fluorochromierungsverfahren und seine Auwcndtmg.

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Audererseits gndert sieh (lie Fluorescenzfarbe mit zunehmet~der Verdiinnung oft in einem sehr weiten Spektralgebiet uml zw~r in der Rege[ gegen kfirzere Wellenlgngen. Besonders auffallend ist dicse F~rbton5nderung bei den Acridinfarbstoffen, dic in L6sungmt yon der Konzentration l:1000 orangerot bis gelb, ;~ber schon bei 1:500o bis 1:10t)00 leuehtend gelbgrfirt bis griin fluorescieren, was ~m 20 Farbstoffen dieser Gruppe beobaehtet werden konnte. Eine Ausnahme bilden die reirt bb~u und rein gelb fluoreseierendet) Stoffe, die ihren F~trbton beibeh~dten und nur den Sgttigungsgrad /~ndern. Dies hat seinen Grund darin, da6 dk; le~z~genannten nur eine Absorptionsbande besitzen, die iibrigen abet mindestens deren zwei, (lie sich bei der Verdiinmmg quantitt~t, iv veritndern (Haitinffer TM ~) * 2. Das mute E i w e i l ] i l u o r o c h r o m T h i a z i n r o t R.

Auf der Suche nach einem Fluorescenzfarbstoff, der es uns erm6glichcn sollte, ins (-;e~x::be ~msgetretenes Pl~smaeiwei[3 histologisch zur Darstellung zu brinuen, sind wit auf das Thia.zinrot gestoi3cn, a)ieser ThiazolS~rbstofI yon din-Formel CI4a

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i1~ bisher aIs Flllorocilrolll ill act Histologie noeh keine Verwcndung gefunden. Erst nachdem wir unsere histologischen Untersuchungen iiber diesen Fluoreseenzfarbstoff schon weitgehend abgesch]ossen h~tten, h~ben wir zufgilig gesehen, dai3 das Thiazinrot schon ill der T~geslichthistologie zur Verwendung gelangt ist. Bei Romeis ~ linden wir die Angabe, dM3 Thiazinrot in Verbindung mit Pikrins~ture zur Bindegewebsdarstellung, in Kombination m i t Thionin zur F~trbung yon Z, 5'[, T und h der quergestreiften .~[uskulatur sowie der Seh~dtstiicke des Kerzmuskels gebnmcht, werden kann. Das diirften die beiden einzigen bisherigerl Verwemhmgsarten dieses Farbstoffes in der Histologie sein. Das Thiazinrot ~ wit verwendeten ein unter der Bezeichnung Thiazinrot R in den Handel gebrachtes Prgparat der I.G. Farben A.G. - - ist ein feinpulverisierter F~rbstoff, der in Wasser gel6st bei T~geslicht eine rubinrote Farbe zeigt. Bestgubt man einen Objekttr~iger g~mz rein mit dem Fluorochrom und betrachtet die Farbstoffprobe unter denl Fluores* Weitere Aufschliisse fiber die hier kurz ~ngedeutetc 5[ethodik finden sicll in der 3[onogr~phie tiber Fluorescenzmikroskopie yon ~]i. Haitinger 1~.

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Max Haitinger und Paul Geiser:

cenzmikroskop, so kann man erkennen, dab er mls zwei verschieden fluorescierenden Komponenten besteht. Man findet P a r t i k e l c h e n yon heller vergiBmeinnichtblauer Fluorescenz, we]che an Zahl nicht stark vertreten sind, aber durcb ihre Leuchtkraft auffallen. Weitaus starker beteiligt sind carminrotfluorescierende Bestandteile, deren Lichtst/~rke jedoch wesentlich geringer ist. Die einpromillige Thiazinrotl6sung zeigt unter der Analysenquarzlampe eine" schwach blauviolette Fluorescenz. Bei dieser Farbkonzentration dringt das ultraviolette Licht n u r in die 5uBerste Schicht der F~rblSsung ein. Bei 10facher Verd/innung tritt eine veilchenblaue bis violette Fluorescenz yon ziemlicher Intensit&t auf. I n der Konzentration yon l:100000 ist die Farbe rein blau, die Farbintensit/~t ist gegeniiber der L6sung 1 : 10000 eher etwas geringer. Sowohl im Auf- als auch im Durchlicht erhalten (vir dieselben Resultate. Wie also der Verdfinnungsversuch lehrt, wech~,zelt die Farbe mit A b n a h m e der Konzentration yon violett gegen blau. I n 70% Alkohol gel6st (l:10000) erhalten wit eine intensive Lilafluorescenz. Das T h i a z i n r o t zeigt welter eine ausgesprochene ,,pu-Unempfindlichkeit". W i r haben das Verhalten im pu-Bereich yon 3,5--8 gepriift und keine :~_nderung der Fluore~ecnz gegen jene der w/~sserigen L6sung wahrnehmen k6nnen. Es scheint einzig ira stark saaren Gebiet die Fluorescenz eine Spur schws zu werden. Wir erws nur nebenbei, dab schon die L6sung ] : 1000 mo!ekulardispers ist (ira Gegensatz z. B. zu Kongorot). :Bei Zusatz zu Serum haben wit nun ein ganz auff/~lliges Verhalten feststellen kSnnen, welches unseres Wissens bis jetzt noch bei keinem Fluorochrom bekannt gewor(len ist. Wenn wit uns eine Serumverdtinnung y o n 1:100 herstellen, so fluoresciert diese blaBbl/~ulich, setzt man dem verdfinnten Serum ,':o viel Thiazim'ot zu, dag dieses darin in einer Konzentration yon 1:100000 geI6st i.-:t, so tritt im ultravioletten Licht ein Farbumsehlag auf: Die L6sung f[uoresciert jetzt intensiv hellrot.- Ein Vergleich der Serum- und Thiazinrotfluoreseenz ergibt, dab dieser Farbumschlag niereals auf einer ~[ischung yon zwei Fluoreseenzfarbt6nen allein beruhen kann. D~ enteiu~eil3tes Serum nach Thiazinrotzusatz diesen Umsehiag vcrmissen l'/il?t, so dfirfen wir daraus folgern, dab diese metachromatisc~ Fluorochromierung in vitro fiir (tie Serumeiweigk6rper spezifisch i~t. Die 9Entscheidung, an welchen Eiweigk6rper das Thiazinrot gebunden wird, ist dagegen schon sehr sehwer zu treffen. Versuche an reinen Albumin-, Euglobulin- und Pseudoglobulinl6sungen* ergaben keinc vollst/indig eindeutigen Resultate. Immerhin kann so viel gesagt werden, dal3 die Albuminl6sun.g die seh6nste Netaehromasie gibt, die Euglobulinl6sung die schws N a n darf dabei aber nicht vergessen, d a b die Priifung an denaturiertem EiweiB vorgenommen vfllrde, ein bindender Schlul~ ist deshalb nicht gestattei. 516glicherweise wird diese Frage mit der you * Ftir die Ilerstellung dieser L6sungen sind wir Herrn Dr. Schmidt zu Dank verpflichtet.

' ~Tber ein neues Fluoroehromierungsverfahren und seine Anwendung.

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B e n n h o I d 3 ausgearbeiteten Entmischung dureh Kataphorese zu kls sein. Diesbezfigliche Versuche haben wir nicht unternommen. Wenn wir versuchen wollen, den Farbumschlag des Thiazinrots nach Serumzusatz zu erkls so kSnnen wit uns dazu eines von B e n n h o l d 3 angegebenen Modellversuehs bedieneI~: Wasser, dem man 0,75 mg-% griinfluorescierendes Laktoflavin und ] m S- % rotfluoresci.erendes Photodyn zusetzt, zeigt eine Griinfluorescenz, gibt man die gleichen Konzentrationen beider Substanzen nicht zu Wasser, sondern zu Serum, so resultiert eine reine Rotfluorescenz. Eine Erkls finder dieses Phs nach Bennhold a darin, dab Lactoflavin durch das Euglobulin, Photodyn durch das Albumin gebunden wird. Folgt man der Ann,~hme, da2 die Albuminteilchen einen Globulinkern umschliel~en, so kann nur die Fluoreseenz der ans Albumin ~tdsorbierten Fluorochrome in Erseheinur~g treten. M6glicherweise silt diese Erkl~Lrung auch ffir das Thiazinrot, dem j a eine Blau- und Rotkomponente zukomnlt. Wir miil3ten also annehmen, dab die in ws L6sung vollsts zuriicktretende Rotkomponente, im Serum dutch Adsorption1 ans Albumin gebunden, die au den Globulinkern adsorbierte Blaukomponente - - um einen Ausdruck yon B e n n h o l d '~ zu gebrauehen - - vSllig abschirmt. Dies ist um so wahrscheinlieher, als eine EuglobulinlSsung mit Thiazinrot versetzt, nur eine ganz geringe ~[etachrom~sie erkennen l~Ll~t (fehlende Abschirmung durch die Albuminteilchen ?). Immerhin kann dieser Erkl~rungsversueh nieht roll befriedigen, da auch eine reine Albuminl6sung nach Tbiazinrotzusatz eine sehr sch6ne Rotfluorescenz zeigt. Wir sehen uns deshalb zur Annahme gezwungen, dal3 die Rotkomponente des Thiazinrots dutch dell Vorgang der Adsorption an das Albumin bezfiglieh ihrer Fluorescenz eine Intensit~tssteigerung erfhhrt, so dab die in ws L6sung sonst sts Blaukomponente vollsts zurfiekgedrs wird. Es sind jetzt sehon zahlreiehe Eiweil3fluoroehrome bei der intravitalen Fluore~cenzmikroskopie zur Untersuehung gelangt. Naeh P [ a / [ und Herold 37 werden folgende Fluoreseenzfarbstoffe an die Albumine gebunden: Le 71, Fluorescin, Fluoreseein, Photodyn, Fluoresceinsulfos~ure, Umbelliferrons~ure, Primulin und Tetrajodfluoresein. Wenn also auch dem Thiazinrot eine Albuminbindung zukommt, so stellt das wohl nichts Besonderes dar. Erst dadurch, dab sieh dieses Haftverm6gen aueh am histologi.~chen Sehnitt yon fixiertem und eingebettetem Gewebe naehwei,~en l~13t, wie wit noeh weiter unten seben werd~n, k o m m t dem Thiazinrot eine Sonderstellung zu. Ob es sieh auch ftir Zwecke der Intravitalmikroskopie als geeignet erweist, mu6 erst die Zukunft lehren. Wir konnten feststellen, dai~ es sowohl beim Kaninchen als aueh beim ~ensehen vollst'~ndig ungiftig ist. 20 ccm der l%igen ],6sung k6nnen beim ~'[enschen ohne Bedenken intraven6s verabreicht werden. I n vi~o seheint die Bindung an die Serumeiweil~k6rper eine sehr ]ockere zu s~in, schon Imch 3 Stunden ist der Farbstoff aus dem Serum verschwunden.

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Max HMtinger und Paul Geiser:

Wit aus einem Versuch am Kaninehen hsrvorgehL erfolgt (lie Ausseheidung sehr raseh durch Leber und Nieren: 45 5fin. nach intrt~ven6ser ] nj ektion von-20 ecru einer 1% igen Thiazinrotl6snng ist d er g,q,nze Diinndarminhalt veto Farbstoff vollst, gndig durchtrS, nkt, das Gallen- m i d Harnblasenpunktat lggt ebenfalls reiehlieh Thiazinrot nachweisen. Zusammenfassend lggt sieh also sagen, dab das Thiazinrot, ein Azofa.rbstoff aus Thiazolbasen, aus einer Blau- und Rotkomponente bestehl,. I n wgsseriger L6sung fiberwiegt die Blaufluoreseenz, bei Zust~tz yon Albumin oder Serum tritt sin Umschlag in Rot auf. Dieser b e r u h t attf einer Adsorption der Rotkomponente wohl vorwiegend an das Albumin, was sine Intensitgtssteigerung ihrer Fluorescenz zur Folge hat. JT)iese in vitro nachweisbare Adsorption ist in r i v e ziemlich locker, 0,2 g beim 3[ensehen intraven6s gespritzt, sind schon nach 3 Stunden vollstgndig aus dem Plasma versehwunden. Die Ausseheidung erfolgt din'oh Leber und Nieren. 3. l)ie Euchrysin-Thiazinrotfhlorescenzfiirbung zur I)arstellung yon Eiweil] im Gewebe.

Es seien cinige allgemeinc Bemerkungen zur Fluoroehronlierungstechnik von Paraffinschnitten vorausgeschickt. Die Entparaffinierung erfolgt in (ler iiblichen Art und Weise. Nebenbei sei hier erwghnt, d~13 man schon den nichtentparaffinierten 8ehnitt fiir eine orientierende Beobaehtung im Flnorescenz, licht verwenden kann, welche dureh die Eigenfluorescenz der Gewebe zur Organdiagnose meist, ens geniigt. Die schwach blaue Fluoreseenz des Paraffins st6rt dabei nur wsnig. Atff j e d e n Fall ist es zu empfehlen, vor der Fgrbung das entparaffinierte P r g p a r a t naeh kurzer Wgsserung unters Fluorescenzmikroskop zu legen zur Beurteilung tier Eigenfluorescenz, um sich so vor spgteren Tgusehungen zu sohiitzen (z. B. die gelbbraune Fluoi'eseenz des Lipofuseins) und auch bei Verwendung mehrerer Fluoroehrome, um die einzelnen Phasen der F g r b u n g einwandfrei verfolgen zu k6nnen. Die Fluorochromierung selbst~ bietet gegeniiber den Fgrbungen der Tageslichtmikroskopie keine Besonderheiten. 8oll ein Fluorochrom zur Verwendung gelangen, welches bisher fiir histologisehe Zweeke noch nicht angewendet wurde, no empfehlen wit folgendes Vorgehen: 1. Es wird der Farbstdff auf seine geinheit gei)riift, indem ein Objekttr/iger mit einer Probe des zu untersuehenden Fluoroehrom:s leieht bestgubt und unter dem Fluorescenzmikroskop betraehtet wird. 1Dies ist mn so notwendiger, als die msistsn Fluoreseenzfarbstoffe Gemisohs darstellen. 2. Man stellt im Verdfinnungsversue h der w/isserigen LSsung (tie Abhgngigkeit der Fluorescenzfarbe yon der Konzentration lest. 3.31an priift die Fluoreseenz bei Anwendung versehiedener L/Ssungsmittel (Alkohol, Chloroform, Toluol usw.).

(~ber ein neues Fluorochronfierungsverfahren und seine Anwendung.

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4. Es ist notwendig, ~meh die Fluorescenz bei verschiedenem p~ zu untersuehen zur Feststellung, ob eine pH-Empfindlichkeit besteht und wenn ja welches PH als optimal zu verwenden ist. Erst nach Beantwortung dieser Fragen gehen wit zu Fluorochromierungsversuchen ~n Schnittcn tiber., Dabei hat sich uns a.uBer dem yon Haitinger und Hamperl ~6 flit diese Zwecke verwendeten G~umensegel als Testpr~ip~r~t aueh die Niere als ein sehr geeignetes Objekt erwiesen, welches bei Verwendung anderer Fluorochrome bisher keine brauchbare Diffcrenzierung ergeben hat. Zur Errnittlung der F~rbedauer verwendet man am besten eine stark verdiinnte LSsung und entsprechend lange Fs Fiir die definitive F/irbung kann man dann wieder unter Abkfirzung des Fluorochromierungsverfahrens zu etwas konzentrierteren L6sungen iibergehen. Fiir die Ws des gefs Prs kann m~rt als Regel geben, daIt nur so lange in fliel~endem Leitungsw~sser gew~ssert werden soll, bis der Objekttr~ger in der Umgebung des Prs vollst/indig fluorescenzfrei ist. Um Dauerprs zu erhalten, trocknet man den Objekttrs vorsichtig mit einem harten Filtrierpapier* (zur Vermeidung yon fluorescierenden Cellulosefi~sern) und schliel]t das Pr~parat in fluoreseenzfreies Immersions61 ein. Zuletzt ist das Deekgla,~ noch zu umranden, um die Austrocknung des EinschlieBungsmittels zu verhindern. Wir haben dazu versuchsweiae eine dtinne Celloidinl6sun:_, verwendet, der Abschtul~ wa.r jedoch nicht immer ein vo}lst~ndiger, auch ist es bei einzelnen Prs zu e-iner Vermi.sehung des Celloidins mit dem Immersions61 gekommen, wodureh die F/~rbung unbr~uchbar wird. Zur Umrandung dfirfte die unter dem N~mlen ,,G~fl" yon den Optischen Werken C. Reichert, Wien, gelieferte Fltissigkeit ~m geeignetsten sein. Unter Beriicksichtigung dieser allgemeinen Arbeitsregeln haben wit es unternommen, eine F/irbung auszuarbeit~n, welehe es erm6glichen soll, aus den Gef~,l~en ausgetretenes Eiwei~ darzustellen oder den Bluteiweil~gehalt der Ge~vebe zu sch~,tzen. Wie wir im vorherigen Abschnitt gesehen haben, ist d~s Thiazinrot ein Fluoroehrom, welches zu den Eiweil~k6rpern des Blutpl,~sm,~s eine Affinit~it besitzt und an diese gebunden im Ultraviolettlieht eine ~[et~ehromasic aufweist. Es ist desha]b 'ein s Verhalten aucl~ ,~rn histologischen Schnitt zu erwarten. Um aber Pr/~parate zu erh~lten, welche eine Benrteih'mg gestatten, ist eine orientierende Kernf~rbung unumg~nglich. Daffir hat sich uns d~.~ als Kernfarbstoff bisher noch wenig verwendete Euchrysin 2 GNX (ein ])imethyldi~minoakridinfarbstoff) als sehr brauehbar erwiesen, besonder,~ auch deshalb, well das Euchrysin in jenem Bereieh, der fiir uns in Frage k o m m t , pH-unempfindlich ist, auf eine Pufferung also verzichtet werden kann. Dieses Fluorochrom besteht ebenfalls aus zwei Komponenten: Die Objekttr~igerprobe ergibt leuchtend gelbgrtine Partikelchen und weir zahlreichere, dafiir aber sehw~cher fluorcscierende braunrote Teilchen. * Schleicher und Schitll B 575 hart.

Max Haitinger und P~ul Geiser:

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Der Verdtinnungsversueh zeigt sowohl im Auf- als im Durehlieht bei ] :1000 eine sehmutzig gelbe Fluoreseenz, die L6sung 1:101)00 fluoreseiert (wie alle untersuehten AkridinIarbst0ffe) intensiv gelbgriin, eine weitere 10faehe Verdtinnung weist eine etwas sehw/~chere rein grtine F ~ r b e auf. Wir haben die F/~rbung als Sueeedanf~rbung ausgearbeitet, ~veil ein Euehrysin-Thiazinrotfarbgemiseh nut wenige Stunden h~ltbar ist. Prinzipiell ist aber ~meh die Simultanf/irbung mSglieh, dabei ist allerdings zu beaehten, dab die konzentrierten Farbl6sungen sieh nieht ~niseheu lassen. Die Sueeedanf/irbung gestaltet sich wie folgt: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Absptilen des entparaffinierten Schnittes in Leitungsw~sser Euehrysin 2 GNX )1 : 10000 . . . . . . . . . . . 2'/~ Min. Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Min. Thiazinrot I~ 1:10000 . . . . . . . . . . . . . 30 Sek. Leitungswesser . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Min. Ges/~ttigte, w/i,sscrige Aiuminiumsulfatl6sung . . . 2 Min. Leitungsw~sser . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Min.

Um einwandfreie gesultate mit dieser F'grbung zu erhalten, sind folgende Punkte zu beriicksiehtigen. Die Fixation der Gewebsstiieke ist nieht gleiehgiiltig. Die iibliehe Formolfixation erweist sieh als ungeeignet. Deshalb liefert die Fgrbung an Gefriersehnittert keine b r a u e h b a r e n gesultare. Die Carnoysehe Fixierungsfliissigkeit hat sieh uns am besten bewghrt. Bei der Einbettung kann die ~[ethylbenzoateelloidinnlethode Ver~vendung linden. Die bl/iuliehe Fluoreseenz des Celloidins. w i r k t sieh dabei am Sehnitt nieht nlehr aus. Gegen das Aldkleben der ~ehnitte mit EiweiBglyeerin hatten wir anfgnglieh Bedenken. Wir h a b e n uns aber davon iiberzeugen k6nnen, dab in der geringen Sehiehtdieke, welehe dabei Verwendung finder,, die F/J,rbung des Sehnittes in keiner Weise beeintrgehtigt wird. Die Farbl6sungen stellell wit uns jeweils a u s einer einpromilligen Stamml6sung her, die in dunkler Flasehe lange hMtbar ist. Die fertigen Farbl6sungen ! :10000 sind bei ts Oebrauch mindestens 14 Tage in der F/i.rbesehale verwendbar. Die unter 6. aufgefiihrte ges~.ttigte Aluminiumsulfatl6sung ist sehr wiehtig. W i t haben anffLnglieh darauf verziehtet, mul~ten aber bald sehen, dab ohne diese Behandlung (tie l~rgparate sehon naeh wenigen Tagen dutch Abblassen unbrauehbar geworden waren. Die Behandlung mit Aluminiumsulfat bewirkt eine Farblaekbildung, so dal3 ~mf diese Weise die F a r b t 6 n e fixiert werden und in ihren urspriingliehen Farben monatelang haltbar bleiben. Dies ist abet nieht der einzige Vorteil der absehliegenden Beizung in Aluminiumsulfat. Wit haben versehiedentlieh beobaehten k6nnen, dal.} naeh der Beizung FarbtSne auftraten, welehe vorher fehlten. Die wgs'cerige gesgttigte Aluminiumsulfatl6sung bildet also aueh einen integrierenden Bestandteil der Fgrbung. Es ist notwendig, die Beize jeweils friseh herzustellen, da siell sehon naeh wenigen Tagen SehimnleIpilze

L~ber ein neues Fluoroehromierungsverfahren und seine Anwendung.

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darin ansctzen k6nncn, besonders wenn die L6sung nieht luftdieht ~J)gesehlossen wird. Bei Einhaltung dieser teehnisehen Vorsehriften erhalten wir an 3--5 tt dieken Paraffinschnitten folgendes FSrberesultt~t : Die I(erne, insbesondere Kernrnemb,'an und Nueleolus, fgrben sieh gelbgrfin, das Protoplasm~ blaf3grfinlieh. Das Bindegewebe weist eine verschiedene Differertzierung auf. Wghrend sieh dt~s loekere interstitielle Bindegewebe, ebenso wie die (!apillarwgnde und (tie Erythroeytenmembranen, blal3braun fgrbt, ['s das gefleeht~rtige sowie das fibr6se Bindegewebe eine hellblaue, hie und da atteh ins Violette spielende Farbe erkennen (z. B. bei }[arkfibrose der Niere). Die ~r fgrben sieh liehtblau bi~ blaugrfin. Eine Querstreifung ist, weder am Skelet- noeh am I-[erzmuskel naehweisb~r, h t normalen C~'ganen zeigt das Thi,~zinrot in der angegebenen Fgrbedauer nltr eine ganz unbedeutende Affinit'gt zur ~'[uskelfaser. Unter pathblogisehen Bedingungen kann sich das jedoeh, wie wir noeh welter unten sehen werden, grundlegend&ndern. Die elastisehen Fasern, besonders die Elastiea interna und externa der Gefgl~e, welehe sieh ja sehon dureh die Eigenfluoreseenz von (lea iibrigen Gewebsbestandteilen abheben, sin([ atteh im fiuoroehromierten Prgpar~tt leuehtend blauweiB dargestellt, hie und da, besonders in der Aorta, haben wir aueh einen leieht r6t|iehen Farbton gesehen, eine starke Rotbraunfgrbung der Elas~iea ist jedoct, nieht mehr als normal anzuspreehen. Das in den Gefgl31iehtungen liegende PlasmaeiweiB weist eine intensiv braune Farbe auf. Weshalb sich aueh die Erythroeytenmembranen in einer ghnlieh braunen Farbe f/irben, verm6gen wit nieht mit Sieherheit anzugeben. Wir haben nieht den Eindruek, dtfl3 es sich dabei einfaoh um die Darstellung des Plasmtmetzes handelt, in (lessen Liieken die wegen ihres Eisengehaltes niehtfluoreseierenden Erythroeyten liegen. Vielleieht erm6glieht die den Erythroeyten sieher anhaftende zarte Eiweil3hiille die Fluoroehromierung. Dieses Verhalten beeintrgehtigt jedoeh den Wert der F/irbung als EiweiBfgrbung keineswegs. Wit bemerken hier gleich, d~B sich unsere Koffnung, eine spezifische Albuminfgrbung zu erhalten, nicht erfiillt hat. Auch wenrt wir eine gewaschene Fibrinflocke einbetten und nach un~erer 5[ethode fgrben, erhalten wir eine Braunfgrbung. Die Euchrysin-Thiazinrot. fgrbung gibg uns eine Differenzierungsm6gliehkeit zwischen zelleigenem ProtoplasmaeiweiB und den Plasmaeiweif~k6rpern des Blutes in die H~nd. AuI das: sehr auffgllige fitrberisch differente Verhalten yon lockerem in.terstitiellem und dem fibr6sen,und gefleeht.artigen Bindegewebe werden wir weiter untml noch zurfiekkommen. , Was die Beurteilung yon f[uorochromierten Prgparaten anbehmgt, so siIld es verschiedene Dinge, die dem nicht geiibten Beobaehter Schwierigkeiten bereiten. Schon die vollstgndig anderen, oft sehr leuehtkrgftigen Farben, vergndern d~s Bild so grundlegend, dal~ es ffir den Anfgnger notwendig erseheint, die Tagesliehtmikroskopie vergleiehend zu I-Iikfe

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Max Haitinger und P~ul Geiser:

zu ziehen. Vor allem ist es auch der dunkle Untergrund, der einem die Fluorescenzbilder fremdartig erscheinen l~Bt. Dem Neuling fallen deshalb gew6hnlich beim ersten Blick ins Fluocescenzmikroskop die Gewebsliicken durch ihre schw,~rze Farbe am meisten auf. Es ist auBerdem der N/iancenreichtum der Fluorescenzfi~rbung ein v611ig ungewohnter, wobei die zahlreich vertretenen Farben h'gufig noch flieBende l~'bergs erkennen lassen, die yon der Tageslichtmikroskopie her bekannte scharfe Kont'rastierung fehlt oft. Auch die strukturelle Differenzierung des Gewebes ]gBt ni(,ht selten letzt~ Feinheiten vermissen, so haben wir in der ~[uskulatur nie eine Querstreifung erkennen k6mmn. Dies alles ist jedoch kein Nachteil der Fluorescenzmikroskopie, die ja nicht einen komplizierten und attBerdem unn6tigen Ers~tz der gebrituchlichen ~[ethodelt darstellen, sondern Probleme 16sen soil, die uns das TageslicRtmikroskop bisher nut unvollkommen zu entr~tseln vermochte. Wit sehen deshalb (lie Zukunft der Fluorochrommethoden weniger in der ErschlieBung feinster struktureller Einzelheiten als viehnehr in der M6glichkeit, die:e 5~[etho(le zu mikrochemischen Untersuchungen heranzuziehen. ist schon die Beurteihmg yon Fluoroehrompr'gparaten mit einige~l Schwierigkeiten verbunden, (lie aber lnit wenig l~bung leicht zu fiberwinden sind, so ist das fiir die Reproduktion des Gesehenen noch fit bedeutend vermehrtem ~[aBe der Fall, besonders dann, wenn wie bei der Euchrysin-Thiazinrotmethode die Fgrbung gegen die Belichtung mig ultravioletten Strahlen nicht unempfindlich ist. l~Ian mache es sich desh~db zur Regel, die Prgparate nicht unn6tig lange unter dem eingeschalteten Fluorescenzmikroskop liegen zu lassen. Bei unserer F&rbung bleicht ein Gesichtsfeld schon nach halbstiindiger Belichtung deutlich aus, was wohl ffir die visuelle Beobachtung gleichgfiltig ist, da solche Beobachtungszeiten k a u m in Frage kommen, dagegen wirkt sich dieser U m s t a n d fiir "die Rel~roduktion , sei es durch Farbphoto oder Farbzeichnung, s'ehr unangenehm aus, so dab die farbige Reproduktion niemals imstande ist, die, Leuchtkraft der Farben und ihre feinsten N~ancen wiederzugeben. ~[an m6ge sich deshalb bei der Betrachtung der Abbildungen dariiber klar sein, dab sie nut einen sehr unvollkommenen Eindruck dessen vermitteln, was in Wirklichkeit zu sehen ist. II. Die A n w e n d u n g s m S g l i c h k e i t e n des neuen F l u o r o c h r o m i e r u n g s v e r f a h r e n s in der P a t h o l o g i e . Von P. Geiser. In I-Iistologie und Pathologie sind (lie bisher gebriiuchlichen und tausendfach bew~thrten F~rbemeVhoden mit ihren vielen ~ o d i f i k a t i o n e n derart zahlreich, dab die Befiirwortung einer vSilig neuen F'grbung wohl auf allergr6Bte Skepsis sto[~en muB und nm' d~nn Bereehtigung h a t , wenn

Ober ein neues Fluoroehromierungsverfahren t(nd seine Anwendung. 127 es mit dicser Methode gelingt, Dinge zur Darstelhmg zu bringen, die geeignet sind, unsere Erkenntnisse fiber das k r a n k h a f t e Geschehen im Organismus, sei es in rein morphologischer oder aueh in physiologischchemischer H i n s i c h t zu vertiefen. Es ist deshalb der Zweek der folgenden Darstelhmg, in einem k u r z e n Streifzug durch verschiedene Gebiete der Pathologie, die aber nile einen i n n e r e n Z u s a m m e n h a n g aufweisen, die praktische B r a u e h b a r k e i t der n e u e n Fluoreseenzf~rbung zu erhg'rten. Es k a n n sich dabei nattirlich nicht d a r u m handeln, das ganze riesige (~ebiet der Eiweil3pathologie zu bearbeiten, sondern es soil a n Beispielen, die wir i h m g a h m e n des uns zur Verfiigung s t e h e n d e n Materials herausgreifen, versucht werden, unsere K e n n t n i s s e auf diesem Gebiet mittels des Fluorescenzmikroskopes zu f6rdern. W e n n wir zu diesem Zwecke m i t einem der klassischen Beispiele der Eiweigpathologie beginnen, der A m j / l o h t o s e , so n u r deshalb, well wir hier den Eiweigk6rper in konzentrierter, morphologisch leieht fafabarer F o r m vor uns haben, also e l l Schulbeispiet, u m unsere F g r b u n g ztt prfifen. Fs m6ge zunSehst eine kurze l~bersieht fiber die Histoehemie des Amyloids in ihrer historischea E n t w i c k h m g Platz finden, nicht aus gesehichtlichem Interesse, sondern well wir daraus wichtige K o n s e q u e n z e n a b l e i t e n k 6 n n e n , welehe im Z u s a m m e n h a n g mit u n s e r e n R e s u l t a t e n yon Bed e u t u n g sind. Naehdem Virchow ~4 im Jahre 1S53 an den Corpora amylaeea die Jod- und JodsehwefdsSurereaktion entdeekt und diese Gebilde deshalb als Cellulosek6rperehen angesproehen hatte, konnten Friedreich und Kdkulg n sehon wenige Jahre spiiter die Eiweiflnatur des Amyloids dureh ehenfisehe Analyse sicherstellen. Ffir die Eiweignatur ffihrten sie aul~erdem die positive Jodreaktion yon altem Fibrin ins Feld. Die ehenfisehe Analyse ergab zudem betr~tehtliehe Mengen yon Cholesterin. Von Mo&'ze#wski aa stammt die erste brauehbare Methode zur Isolierung des Amyloids dureh Verdauung mit salzsaurer Pepsinl6sung. Das Amyloid wurde, wenn aueh nieht nativ, so doeh in einem yon Gewebsbestandteilen freien Zustand erhalten. In den .a,bbauprodukten des so gereinigten Amyloids liegen sieh Tyrosin und Leuein naehweisen. Die Chondroitinsehwefels/iure spielt seit den Untersuehungen yon Oddi a6 und spgter yon K r a w k o w 22 in der Histoehemie und Genese des Amyloids eine grote Rolle. K r a w k o w fiihrt in seinen Untersuehungen an, dub die Jodreaktion yon der physikalisehen Besehaffenheit abh/ingt, wghrend die Metaehronmsie mit 5[ethylviolett chemischer Natur sein soll. Seit K r a w k o w wird das Amyloid als ein Eiweil3ehondroitinschwefelsgureester angesehen. Neuberg a~ reehnet auf Grund seiner ehemischen Analysen das Amyloid zu den basisehen EiweiBk6rpern. Er bezeichnet das Amyloid als elnen in Metamorphose befindliehen EiweiSk6rper. Ein ,,Protaminkern" nimmt nach seinen Untersuehungen einen fiberwiegendon Anteil im Amyloidmolekfil. Dutch Hanssen is ist die Untersuehungsmethodik des Amyloids einen wesentlichen Schritt welter gebracht worden. Er isolierte aus Sagomilzen die Sagok6rnehen meehanisch dureh Sehtitteln und Auswaschen. Dieses Amyloid enthielt keine Chondroitinsehwefelss Die Methylviolettreaktion soll nach Hanssen dem Eiweigsubstrat zukommen, die Jodreaktion dagegen einer unbekannten ver/inderlich beigemengten Substanz. Die Untersuchungen von Maye~la aa stehen in krassem Gegensatz zu denen yon Neuberg: Das Amyloid enth/tlt Histidin, die Menge des Arginins und Lysins ist bedeutend geringer als belm I-Iiston, das Amyloid ist frei yon Chondroits/ture, der Hexonbasengehalt ist gegentiber

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normalen Organen nicht vermehrt. Die ausgedehntesten Untersuchungen tibet' dig Mikrochemie des Amyloids an Hand des farberischen Verhaltens verdankerL wir wohl Leupold 3~ Das Amyloid wird hier bereits als tin Komplex yon EiweiBk6rpern bezeichnet. Did typischen Amyloidreaktlonen sind nicht an die ELveiflgrundsubstanz gebunden. Schmiedeberg 4o spricht wenige Jahre sparer bereits y o n 8 verschiedenen Amyloidarten, je nachdem die Farbrcaktionen ausfallen. Eppinge.r s konnte in einem besonders gtinstigen Fall eine chemische Analyse durchftihren: Es handelte sich dabei um ein tumorf6rmiges Amyloid des linken Leberlappens, das keinem mechanischen oder chemischen ReinigungsprozeB unterzogcn werden muBte. So gelangte erstmalig natives unver~ndertes Amyloid zur Analyse. Dieses erwies sieh als phosphor- und schwefelfrei, enthielt reichlich Tyrosin, es fehlten Cystin und Histidin. Das Verhi~ltnis yon C: N war dasselbe wie in anderen Proteinen. Karczag, Pau~z und zV~meth ~ befai3ten sich mit einer rein physikalischen Eigenschaft des Amyloids, n~tmlich der elektrostatischen Ladung. Diese besitzt eine st~trkere Negativitat als die des Bindegewebes. hie chemischen Untersuchungen y o n A~ult" und Doerken 6 stelltn lediglieh die ~bereinstimmung des Leberamyloids von Serumpferden mit dem menschlichen Amyloid lest. In einem yon JBiiriimcekci 5 mitgeteilten Fall yon Paraamyloidose konnte Hinsberg den Gehalt der einzelnen Organe an Chondroitinschwefels~ture bestimmen (435--2172 rag-%). Auch Joha.t~ssen und Wahlgren ''~ halten a n dem Chondroitinschwefels~uregehalt des Amyloids fest auf Grund der ~[etachromasie mit Toluidinblau, welche fiir Sehwefelsi~ureester mit hohem Molekulargewicht charakteristisch sein soll. Sehr interessant sind die Untersuchungen von Hass und Schulz 1~, welche eine neue Methode zur Isolierung des Amyloids von anderen Gewebselementen ausgearbeitet haben. Das Amyloid wurde aus Gefrierschnitten yon Amyloidlebern in einer Phosphatpufferl6sung yon P~I: 1 l isoliert. Es liel3en sich je 3 verschiedene Amyloidarten trennen: Gew6hnliches Amyloid, doppeltbrechendes und tin in alkalischer Fltissigkeit schwer 16sliches, das sich mit Kongorot farbt. Es werden ferner zwei Proteinfraktionen unterschieden: Die erste bleibt bei Neutralisierung des L6sungsmittels in L6sung, fitllt bei Halbs~ttigung mit Ammonsulfat, bei S~turezusatz oder bei Dialyse gegen Wasser aus. Die zweite ist 16slich in verdtinnter S/kure und destilliertem Wasser. Sie f/illt bei Halbs~ttigung mit Ammonsulfat ebenfalls aus. Aus dieser Z u s a m m e n s t e l l u n g mit itlren zahlreichen u n l 6 s b a r e n Gegenss k a n n n u r eine Schlui~folgerung gezogen werden. L e u p o l d $1 h a t es wohl als einer der ersten schon lange klar a u s g e s p r o e h e n : ,,Es sind die Widersprfiche, welche die ehemischen U n t e r s u c h u n g e n gezeitigt hahen, nicht anders zu erkls als dal~ das. A m y l o i d v e r s c h i e d e n e r H e r k u n f i n i c h t immer gleich gebaut ist, da[~ also das , , A m y l o i d p r o t e i n " kein u n a b ~ n d e r l i c h e r K6rper y o n immer gleicher Z u s a m m e n s e t z u n g ist." Dies~r im J a h r e 1924 gepriigte Satz h a t zwar durch die zuletzt e r w s U n t e r s u e h u n g e n yon H a s s u n d Schulz seine klare B e s t ~ t i g u n g g e f u n d e n , dagegen fehlte in der histologischen F s bis j e t z t n o c h ein richtiges Analogon dazu. Wohl k e n n t m a n sehor~ lange den a t y p i s c h e n Ausfall der ,,typischen" A m y l o i d r e a k t i o n e n , m a n h a t auch e t w a s vage y o n der , , L a u n e n h a f t i g k e i t " der Amyloidfs gesprochen ( L e n g h ~ % I m m e r h i n war es mSglich, durch Ausfiihrung verschiedener F ~ r b u n g e n Unterschiede feststeller~ zu kSnnen. So sind naeh A p i t z ~ die P a r a p r o t e i n e alle durch K o n g o r o t fiirbbar, unterscheiden sich aber u n t e r e i n a n d e r noeh im Ausfall der M a s s o n . u n d Weigert-F~rbung. Solche U n t e r s c h e i d u n g e n

Uber ein neues Fluorochromierungsverfahren und seine Anwendung.

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kSnnen wir nun auch mit einer einzigen teehnisch sehr einfaehen }[ethode, der Euchrvsin-Thiazinrotf/trbung. am Amyloid durchfiihren. Unseren Untersuchungen liegt folgendes Material zugrunde : 3 Amyloidosen verschiedenen Grades der ~iilz, 3 der Niere, 1 der Leber, 1 Paraamyloidose des Herzmuskels, 1 Bence-Jones-Nephrose, ferner 1 Leberamyloid eines Serumpferdes und 6 experimentelle Nguseamyloidosen, die wir uns nach dem Verfahre.n_ von Kuczinsl:y 0-3, ',4, ~ hergeste]lt haben. ])as Resultat soll an H a n d einiger Beispiele besprochen und teilweise mit Abbildungen belegt werden. Wir sind mit unserer Jfluoroehromierung in einer Niere erstmalig auf Amyloid gestoften und haben gesehen, daft die in den Glomerulis abgelagerte amyloide Substanz dutch das Euchrysin stark griin gef/irbt wird. Es ~iel uns jedoch schon bei diesem Pr/~parat auf, daft man nicht selten das griine Anlyloid yon einem braunen Saum umgeben sieht. Wit glaubtert zun~ichst das so erkl/~ren zu kSnnen, daft man am Rande des grtmen Amyloids noeh Reste yon braungefS, rbtem noeh nieht in Amyloid umgewandelten Serumeiweift findet. Beim zweiten Pr/~parat, einem Leberamyloid yore Serumpferd stellten wir entts fest, daft bier die amyloiden die Capillaren erdriiekendea St,rs sich in ihrer J?/irbung vom Serumeiweift k a u m unterscheiden lassen, erst das dritte Pr/tparat., eine ausgedehnte Paraanlyloidose des Herzmuskels, brachte K15rung. Bei schwaeher Ver~6fterung fallen hier sofort leuchtend griin gef~rbte KnStchert und Areale auf, welche in ein iVL~schen- und Netzwerk braune: StrSnge eingelassen sind, die wiederum die blau bis blauviolett hervortretenden 5[uskelfasern umschliel3en. Dies ist besonders dort deutlich zu erkennen, wo die ~r quer getroffen sind. Der Eindruck der U m m a u e r u n g der ~[uskelfasern durch dieses Netzwerk amyloider Substanz wird durch die zahlreiehen schwarzen Gewebslficken etwas verwischt, ist jedoch an den Ste]len, an welehen die fixierungsbedingte Schrumpfung nicht so stark in Erscheinung tritt, klar zu erkennen. Zah/reiehe kleinere und gr6ftere Gef/tfte treten durch Ablagerung ]euchtend griiaen Amyloids sehr auff~llig hervor. Bei mittlerer VergrSfterung erkennt man die teils v611ige teils herd- oder auch sektorenfSrmige amyloide Umwandlung ihrer Wandung. Eine Kernfs fehlt in diesem Pr/~parat offenbar deshalb, weil der Kernfarbstoff zu einem Teil des abgelagerten Amyloids eine besondere .kffinit/~t aufweist. Es lassen sieh nieht selten flieftende Uberggnge des braunert in das grfine Amyloid erkennert. Hier tritt klar zu Tage, dab dieser tterzmuskel zwei Amyloide yon versehiedenem fgrberisehen Verhalten enthglt. gs sei an dieser SteRe erwghnt, dab es prinzipiell m6glieh ist, mig dem Thiazinrot aueh eine brauehbare Tageslichtamyloidf/irbung zu erhalten (etwa 15 ~Iin. Fgrbedauer mit der 1%igen L6sung). Das erhaltene Bild ghnelt dem der Kongorotf/irbung. Aul]erdem ist es aber noeh mSglieh, dasselbe Pr/iparat unters Fluoreseenzmikroskop zu legen und ebenfalls wieder als Amyloidf/irbung zu verwenden, allerdings ist dann alles Amyloid gleiehmiigig rot gefgrbt. Eine Differenzierung Virchows A r e h i v . t~d. 312. 9

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Max Haitinger und Paul Geiser:

verschiedener Amyloide finder natiirlich nicht statt, da die verwendete L6sung fiir das Thiazinrot als Fluorochrom zu konzentriert und die Fiirbedauer viel zu lunge ist. Wir glauben aber, dab dieser M6glichkeit, Tageslicht. und Fluorescenz/drbung im gleichen Prgparat zu vereinigen, groBe Bedeutung zukommt. Die Abb. 2 liil3t eine weitere Niiancierung der Amyloidf~irbung erkennen. Es handelt sich u m eine ~Sflere interstitielle Amyloidablagerung in der Niere. Die Tubuli sind teilweise noch erhalteu und e r k e n n b a r .

=kbb. 2. A m y l o i d o s e d c r N i e r c .

Optik: Fluorescenzmika'oskop Lux UV. der Firma ~teichert. O b j . 30 • ; Ok. 5 •

Das A m y l o i d zeigt hier eine Differenzierung vom zarten Gelbgriin im Z e n t r u m des Gesichtsfeldes bis z u m tiefsten Rotbraun, das sieh wesentlieh yore d u m p f e n R o t b r a u n des Herzmuskels unterscheidet. Es diirfte aber dieser Farbunterschied nicht y o n prinzipieller Bedeutung sein. W i r mSchten uns mit der Feststellung begnfigen, dab es ein serum~ihnliches A m y l o i d gibt und eines, das in seinem fs Verhalter~ scharf yore Serum zu trennen ist. Ob sich beim serums A m y l o i d noch weitere Dffferenzierungen treffen lassen, wie w i r e s auf Grund einiger anderer Beobachtungen v e r m u t e n mSchten, wird erst noch die Untersuehung an einem groi~en Material zeigen mfissen*. * Wir hatten urspriinglich die Abslcht, auch unsere weiteren Ausftihrungen durch farbige Bilder zu belegen. Denn nur solche geben einen halbwegs richtigen Eindruck yon der Vielfarbigkeit und dem Kontrastreichtum der fluorochromierten

~ber ein neues Fluorochromierungsverfahren und seine Anwendung. 131 I n der Milz (Abb. 3) haberl wir in 3 F/iilen alle bisher beschriebenen Ntiancen der Farbt6ne angetroffen und glauben dariiber hinaus derart flieftende ~'berg/inge yon einwandfrei griinem Amyloid zu blauem ,,Hyalin" gesehen zu haben, daft wir die in der Pathologie fibliche scharfe Trennung zwischer~ Amyloid und Hyalin fiir nicht ganz berechtigt, halten. I n den zwei untersuchten Amyloidlebern haben wir nur das braune serum~hnliche Amyloid gefunden.

A b b . 3. A m y l o i d o s c d e r Milz. O p t i k w i e A b b . 2.

Auch der einzige Fall yon Bence-Jones-Nephrose,den wir mit unserer Fs zu untersuchea Gelegenheit hatten, fiihrt uns die verschiedenen Eiwei6kSrper sehr instruktiv vor Augen. Die zahlreichen Zylinder spielea hier in allen Farben, yore typischen Blauweift des hyalinen Zylinders ins Griine und auch ins Braune und Braunrote. Krystallinische EiweiftkSrper, wie sie bei dea Paraproteinosen hier und da vorkommen, waren in unserem Prs leider keine vorhanden. Wenn wir unsere Ergebnisse der F~trbung bei der Amyloidose zusammenfassen, so kommen wir etwa zu Folgendem: Es lassen sich mit der Euchrysin-Thiazinrotf~rbung zwei Gruppen yon Amyloideiwei6 Pr~parate; aber auch ihnen fehlt der Glanz, den mar~ bei visueller Betrachtung derselben wahrnimmL Aus technischen Griinden muBten wit die Zahl derselben auf drei reduzieren. 9*

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trennen, von denen die eine dureh ihre F/~rbung noeh eine weitgehende Verwandtsehaft mit den Serumeiweil3k6rpern anzeigt, w~hrend die andere sehon bedeutende Vers physikaliseh-chemiseher N a t u r erfahren hat. Dies stellt nut eine rein histologisehe Bests der neuesten ehemisehen Untersuehungen von Hass und Schulz TM dar, die j a zwei versehiedene Eiweigfraktionen isolieren konnten. Wit glauben weiter sagen zu dfirfen, dab das braune Amyloid das jtingere ist, das grfine dureh )[etamorphose aus dem braunen entsteht. Daffir k6nrten wit aueh unsere experimentellen l~esultate bei 1K'~usen anffihren: in 4 FS,11en yon mittelstarker Amyloidose der ~[ilz und in 2 Fs yon begir~nender haben wir immer nur das braune Amyloid angetroffen; da dieses A m y l o i d wohl h6ehstens 14 Tage alt sein konnte, so bildet das ftir unsere obige Annahme eine wesentliehe Stiitze. Wir haltert deshalb aueh die ~reubergsehe Formulierung ftir die beste, welehe das Amyloid als einen i n 3[etamorphose befindliehen Eiweil3kSrper bezeiehnet. Aueh fiir die Genese des Amyloids k6nnen wit aus diesen dureh die Fluoroehromierung gewonnenen Tatsaehen einigen Nutzen ziehen. Sehon die versehiedensten 3[Sgliehkeiten sind ffir die Amyloidentstehung erwogen worden: ~t/. B. Schmidt a9 sieht das Wesen in einem fermentativen Gerinnungsprozel3; ein im Blur kreisender Eiweigk6rper, gepaarte SehwefelsSuren u n d eine Insuffizienz des Gewebes diese Sehwefels/turen zu eliminieren, i s t naeh Le~lpold a~ das Wesentliehe. Erste Bedingung ist, so glaubt D o m a g k ~, das Vorhandensein yon eiweil~abbauenden Zellen und F e r m e n t e n , er m iB t deshalb dem Retikuloendothel eine grot3e Bedeumng bei. Letterer 27,.~s sprieht als prim/ire Grundlage eine vermehrte Abgabe yon Globulinen aus der Zelle naeh dem Gewebssaft und dem Blute an. Von Loeschke a2 ist erstmalig sowohl ffir Hyalin, als aueh fiir Amyloid die b e k a n n t e Theorie der Amyloidbildung als Antigen-Antik6rperreaktion ausgesproehen worden. Aueh Letterer 29 hat sieh in diesem Sinne ge~uBert: Die Amyloidose soil bei grogem Antigengehatt des Blutes und kleinem Pr~tzipitinogengehal~ der Gewebss~fte auftreten. Volland 42 weist auf die Beziehungen zwisehen Amyloid- und Fibrinoidbildung bin. D a s Unverm6gen des Bindegewebes zur v611igen Vernarbung wird ftir die Amyloidbildung als typiseh angesehen. Wit glauben, dal3 gerade das Kernproblem der ganzen Amyloidose darin liegt, was der Organismus rnit den aus den Capillaren ausgetretenen Plasmaeiweil~k6rpern anfs Wird das EiweiB restlos aufgesaugt oder bleibt es liegen? I m zweiten Fall bestehen prinzipiell zwei ~I6gliehkeiten der Metamorphosierung: Entweder es k o m m t zur Fibrillenbildung, das ist wohl das GewShnliche, oder diese bleibt aus und der Eiweigk6rper verf~llt den Gesetzen des Alterns und entfernt sieh damit fiber verschiedene Zwischenstufen von seiner ursprfingliehen chemischen und f/irberischen P l a s m a v e r w a n d t sehaft. Die Amyloidose ist also gekennzeichnet dureh eine Insuifizienz des mesenchymalen Apparates oder, wie Volland 4~-. es ausdrfickt, der reparatorischen Kr~ifte.

Uber ein neues Fluoroehromierungsverfahren und seine Anwendung.

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Aus all diesen Erwggungen mag hervorgehen, dal~ wir den Wert der Euehrysin-Thiazinrotfgrbung weniger in einer Yerbesserun~ der histologisehen Amyloiddiagnose erblieken, wir halten im Gegenteil die altbewghrten 3[ethoden fiir diesen Zweek geeigneter, dagegen seheint sic uns Einblieke in die Chemie des Alnyloids zu erm6gliehen. Wenden wir uns nun mit unserer F/~rbung dem grol~en Gebiet der ser6sen Entziindung zu, wie es vor allem durch Eppinger 9 und seine Sehule gesehaffen worden ist. Es liegt uns dabei vollstgndig ferne, fiber alle die klassischen Beispiele der ser6sen Entztindung zu beriehten, welche wit mit der Fluoroehrommethode untersueht haben und die ja einer Best~ttigung mit dieser Methode gar nieht bedflrfen. Wir wollen viehnehr zwei weniger bekannte Beispiele herausgreifen, an denen mit der gew6hnliehen histologisehen Teehnik der Eiweil3naehweis im Gewebe ziemlich sehwer fgllt. So konnten wir an einem I-[erznmskel eines ]Tjghrigen Patienten, tier an einer sehweren Diphtherie starb, folgendes beobachten. Der histologisehe Sehnitt zeigt ein Bild, wie es fiir die a kute diphtherische Myokarditis typiseh ist : Zahlreiche in seh olligem Zerfifll begriffene 3][uskelfasern (toxische ~[yo[yse), daneben nicht selten auch hyaline und waehsartige Veriinderungen der Fasern. Das Interstitium ist 6demat6s und an vielen Stellen zellig durehsetzt. Die Wandungen der Capillaren und Pr/ieapillaren erseheinen nieht selten dutch Quellung verdiekt. Dieser Sebnitt lgI3t nun in der ]~'luoroehromfgrbung einen ~mgeheuer grofJen Plasmaeiweil3gehalt erkennen, der sieh nicht nur auf das loekere stark 6demat6s durc:htrgnkte, zum Tell sehon in Neubildung begriffene Bindegewebe besehr/inkt, die N[uskelfasern selbst weisen als Ausdruck stgrkster ser6ser Entziindung (frfiher als trtibe Sehwellutlg bezeiehnet) eine intensiv braune ]~'arbe auf, ~mch an zah]reiehen .4xteriolen und PrSeapillaren tritt die verquollene braunrot gefgrbte Wandung sehr deutlieh hervor. 5[an hat den Eindruek, als sei der ~[uskel in der ser6sen Exsudatiort geradezu ertrunken. Diesen f/irberisehen Ausdruek der trfibeI1 Sehwelhmg haben wit auch in zahlreiehen anderen Fgllen gesehen, so z. B. in einem I-Ierzmuskel bei ]cterus infeetiosus Weil oder in den parenehymat6sen Organen bei Sepsis. Wir glauben deshalb, dal~ es m6glieh ist, mit unserer F/irbung den Grad der trfiben Sehwellung zu sehgtzen und damit gleichzeitig einen ~{al3stab der Permeabilitgtsst6rung nieht nur der Capillaren, sondern aueh der Zellmembranen zu finden. Wohl die interLsivste Eiweil3durehtrgn.kung des Gewebes haben wir bei der akuten Leberatrophie gesehen. .A_ls zweites ]3eispiel haben wir die Aorta eines I-Iundes gewghlt, der im anaphylaktisehen Sehoek get6tet wurde. DaB es hier in der I n t i m a und Media zu einer ser6sen Entziindung komrat, ist mit den gew6hnliehen histologisehen M]ethoden nur sehwer zu erkennen, wohl kanlt man Lficken mit feinfgdig geronnenen 3[assen finden, die Entseheidung, ob es sich bier um ausgefglltes Serumeiweif] handelt oder

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Max Haitinger und Paul Geiser:

nicht, ist jedoeh sehwer. Ganz fiberrasehend wird das Bild m i t der Fluorochrombehandlung. Nicht nur, dab sieh hier in den Liicken geradezu Seen yon SerumeiweiB erkennen lassen, es scheint sich das A l b u m i n auch an die elastischen Fasern anzulagern und diese zu durehdringen. In der normalen Aorta ist das elastische Gewebe blauweiB gefs hier und da mit einem ganz leicht bri~unlichen Unterton. I n unserenl Falle ist dagegen die Elastica kaum mehr zu erkennen. Dieses Verhalten haben wir, wenn auch nicht ganz so sch6n wie gerade hier, in der Aorta bei Verbrenmmg oder beim ttistaminschoek gesehen. Die Beteiligung der Gefs an der ser6sen Entziindung lieB sich ferner sehr schSn zeigen am Schnitt durch eine Art. brachialis bei einem an Pneumonie gestorbenen Patienten. Hier hat man den Eindruek, dab es nicht so sehr die Permeabilit~tsst6rung der Intima als vielmehr die der Vasa va~sorum ist, welche zu einer ser6sen Entziindung vor allem der Gefii.Bmedia und Adventitia fiihrt. Die vorwiegende Beteiligung der Intima w a r am schSnsten in Nierenarteriolen bei Sepsis feststel]bar. Weiter haben wit nun unsere F/irbung dazu benutzt, die F r a g e auL zuklhren, ob ins Gewebe ausgetretenes EiweiB in die Bindegewebsfasern einzndringen vermag oder nicht. Ist dies tats~tchlich der Fall, s o muB z. B. das derbfaserige geflechtartige Bindegewebe der Cutis, das norlnalerweise bei unserer Fs blau fluoresciert, nicht -nur am R a n d e der Fa.sern, sondern auch im Innern eine Braunfs aufweisen. Sowohl beim Arthusphs wie bei der durch Schlangengift erzeugten Verquellung der kollagenen Fasern haben wir diesen Farbumschlag ein.wandfrei feststellen k6nnen. Auch die Injektion yon Serum in die nicht sensibilisierte Kaninchenhaut mit nachfolgender Excision in verschiedenen Zeitabsts zeigte uns, dab das Eindringen der EiweiBkSrper in die kollagenen Biindel in der Zeit zwischen S und 24 S t u n d e n nach der lnjektion erfolgt. An einem Schnitt durch ein t{autsttickchen eines A]lergikers, welcher eine stark positive Cutanprobe auf HfihnereiweiB aufwies, konnten wir "~hnliches beobachten. 15 Min. nach der intracutanen Injektion von 0,l ccm des Antigens in der Verdfinnung 1:1000 wurde die Quaddel gestanzt. Die durch das entziindliche ()dem auseinandergedr~,ngten kollagenen Bfindel erscheinen gr6Btenteils blamweiB bis blaugriin, sie werden aber hs yon braunroten Streifen u m s s oder auch das etwas aufgetriebene Ende f~i.rbt sich intensiv r o t . Die Deutung dieses Befundes ist nicht ]eicht und kaum mit Sicherheit zu geben. ~[6glicherweise handelt es sich dabei um einen fi~rberischen Ausdruck einer Antigen-AntikSrperreaktion. Wie wir schon weiter oben erw/~hnt haben, zeigt das lockere interstitielle Bindegewebe nicht dieselbe Farbe wie das derbfaserige, gefleehtartige. Wir glauben, dieses Verhalten so deuten zu k6nnen, d a b die junge Bindegewebsfibrille ihre urspriingliche Verwandtschaft m i t den

~J'ber ein neues Fluorochromierungsverfahren und seine Anwendung. 135 PlasmaeiweiBk6rpern bus denen sie ja entsteht, such f~rberisch dokumentiert, d,~s derbe kollagene .Faserbtindel dagegen l~[tt diese Verwandtschaft bereits vermissen. Ein ~hnliches Verhalten sahen wir such beim Vergleich der Aehillessehne eines wenige Woehen alien Embryos mit derjenigen eines 15j~hrigen Mensehen. W~ihrend beim letzteren eine hellblaue Fluorochromierung zustande kommt, ist die Achillessehne beim Embryo noch fast durchwegs braun gefs also auch hier ein Hinweis auf d~s Altern der EiweiBk6rper!

A b b . ~. N e k r o s c i n d e r L e b e r n a e h A l l y l f o r m i a t .

O p t i k w i c A b b . 2.

Durch eine geringfiigige Modifikation unseres F/~rbeverfahrens ist es uns gelungen, die Euchrysin-Thiazinrotfluorochromierung noch fiir einen weiteren Zweck brauchbar zu machen, n/~mlich zur Darstellung von Hyalin und vor allem von hyalinen Nekrosen. Wit m6chten darfiber nut ganz kurz berichten. Durch Kombination mit dem yon Haitinger angegebenen Verfahren der Aufhellung gelingt es, hyaline Nekrosen elektiv metachromatiseh zur Darstellung zu bringen. Wir verfahren dabei nach folgendem F~rberezept: 1. Absptilen in Leitungswasser 2. Thioflavin S* 1:10000 . . . . . . . . . . . 1 Min. 3. Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . 2 Min. * Thioflavin S ist ein saure~' Thiazolfarbstoff.

~[~x H~itinger und P~ul Geiser:

136 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Euchrysin 2 GNX 1:10000 . . . . . . . . . 8--9 Min. Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . 2 ~Min. Thiazinrot lZ 1:10000 . . . . . . ". . . . . . 1~/4 Min. Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . 2 Min. Gesiittigte w~sserige A1uminiumsulfatlSsung . . 2 :V[in. Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . 2 M_in.

Die A b b . 4 zeigt einen nach diesem Verf~hreI1 gef~irbten S c h n i t t , welcher eine R.~ttenleber m i t schweren, meist acinusperilcherisch g e ] e g e n e n hy~linen Nekrosen darstellt. D~s nekrotische P a r e n e h y m ist l e l a c h t e n d b l a u g e f a r b t w~hrend die n o r m a l e Leberzelle gelb~oTtin e r s c h e i n t . Die F'arbung ist s pr'azise u n d k o n t r a s t r e i c h u n d (htdurch s i c h e r auch ffir d i d a k t i s c h e Zwecke geeignet. W i r h a b e n z. B. eine einzige n e k r o t i s c h e Leberzelle, welche allseits y o n n o r m a l e m Cewebe u m g e b e n w a r , schon bei schw~cher VergrSi3erung m i t L e i e h t i g k e i t e r k e n n e n k S n n e n . Die Br~uchb~rkeit dieser nlodifizierten ) [ e t h o d e h a b e n ~vir erh~irtet ~tn diphtherischen, ekh~mptischen u n d S t a u u n g s n e k r o s e n der L e b e r , f e r n e r ~m der n e k r o t i s i e r e n d e n Sublima.tnePhrose u n d an den h y a l i n e n I-[erzm u s k e l n e k r o s e n bei Diphtherie. I n einzelnen ]7allen h a b e n w i r diese F~irbung ~uch b e i m A m y l o i d a n g e w a n d t , wenn es sich d ~ r u m hz~ndel~e, fiir p h o t o g r a p h i s c h e Zwecke die L e u c h t k r a f t der F ~ r b e n zu e r h S h e n . W i r hoffen, m i t dieser D ~ r s t e l h m g fiber die A n w e n d u n g s m S g l i e h k e i t e u der E u c h r y s i n - T h i a z i n r o t f l u o r o c h r o m m e t h o d e in der P a t h o l o g i e ihre B r a u c b b a r k e i t erwiesen zu h a b e n u n d glauben, d a b d ~ m i t auch die F l u o r o c h r o m i e r u n g s m e t h o d e n in die t~igliche histologisehe O~'echnik E i n g a n g finden sollten. Zusammenfassung. Es wird fiber ein neues Eiweil3fluoroehrom T h i a z i n r o t b e r i c h t e t , welches, d e m Serum zugesetzt, diesem eine m e t a c h r o m a t i s c h e ]~otfluorescenz verleiht. I n V e r b i n d u n g m i t E u c h r y s i n li~i3t es s i c h zur F l u o r o c h r o m i e r u n g y o n P a r a f f i n s c h n i t t e n verwenden. Die neue E u c h r y sin-Thiuzinrotfluorescenzf~irbung ermSglicht die D a r s t e l l u n g der A l n y l o i d e in v e r s c h i e d e n e n F a r b e n , b r i n g t den BluteL~ei~gehalt der G e w e b e z u m A u s d r u c k u n d gibt uns die ~[Sglichkeit in die H~md, das S c h i c k s a l des aus d e n Gefs a u s g e t r e t e n e n Eiweii3es zu verfolgen. I n e i n e m m o d i fizierten Verfahren k a n a sie zur e l e k t i v e n m e t a c h r o m a t i s c h e n ]~'~rbung h y a l i n e r N e k r o s e n V e r w e n d u n g linden.

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