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Complexes de transcription d'origines nucl6olaire et chromosomique d'ovocytes de Pleurodeles waltlii et P. poireti (Amphibiens, Urod61es) N. Angelier* et 3. C. Lacroix Universit6 Pierre et Marie Curie, Centre de Reeherehes d'Ivry, 67, rue iVfauriee Gunsbourg, 94200 Ivry. France Transcription Complexes with Nueleolar and ChromosomM Origins in Oocytes of Pleurodeles waltlii and P. poireti (Amphibia, Urodela) Abstract. The method of spreading transcription complexes has been applied to amphibian ooeytes of Pleurodeles genus. Complexes of nueleolar origin show a regular and homogeneous organization similar to that described in other materials. The observations add to the interpretation as an amplification of nucleolar DNA and a redundancy of ribosomal cistrons in the two species studied. - - On the other hand, complexes of chromosomal origin display a great diversity. Two main characteristics can be drawn: the existence of several transcription units in a chromosomal organization unit and the possibility to point out a speeiM architecture at the RNP fibril level. Applying a shadowing technique used for isolated molecules is an improvement compared with earlier methods based on PTA coloration.

Introduction Une m6thode d'6talement des structures nucl6Mres faisant apparaitre, en microscopie 61ectronique, des architectures correspondant s des g6nes en activit6, a 6t6 raise au point par Miller et B e a t t y (J969a). Cette m6thode constitue un m o y e n d'analyse de l'organisation fonctionnelle du mat6riel h6r6ditMre lors de la transcription. D6velopp6e initiMement sur les ovocytes de deux Amphibiens: Triturus viridescens et Xenopus laevis (Miller et Beatty, 1969a, b, c), cette technique a 6t6 6tendue aux ovocytes de plusieurs autres Amphibiens (Scheer et al., 1973) et de quelques Insectes (Derksen et al., 1973; Trendelenburg et al, 1973; Trendelenburg, 1974). Elle a 6t6 transpos6e, en outre, s d'autres organismes: cellules de la souche I I e L a (Miller et Bakken, 1972), spermatocytes de Drosophile (Itennig etcd., 1973; Meyer et Hennig, 1974), cellules embryonnMres de Drosophile, levures (I-IamkMo et al., 1973), bact6ries (Miller et al., 1970) et algues (Spring et al., 1974; Trendelenburg et al., 1974). Duns le prolongement de nos investigations r6Mis6es jusque 1s en microscopie photonique sur les chromosomes en 6couvillon des pleurod61es, nous avons entrepris d'utiliser ce m o y e n d'anMyse duns le but d'appr6hender l'6tude des complexes mol6culMres de transcription du n o y a u de l'ovocyte, en corr61ation avec des analyses biochimiques, autoradiographiques et architecturMes. * Attach6c de recherches C.N.R.S, Laboratoire de Biologie AnimMe, Orl6ans.

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N. Angelier et J. C. Lacroix

Les rTsultats exposTs ici ont t r a i t s des o b s e r v a t i o n s rTalisTes sur des 6talements c o n c e r n a n t aussi bien les nuclToles que les chromosomes. L ' e x a r n e n d u matTriel nuclTolaire a fourni des i n f o r m a t i o n s sur les esp@ces utilisTes, mais il a aussi 6t6 le m o y e n d'Tprouver l'efficaeit6 de la m@thode entre nos mains. Les u l t r a s t r u c t u r e s nuclTolaires c o n s t i t u e n t ainsi u n systTme de rTfTreuee p o u r l ' a n a l y s e des archit e c t u r e s chromosomiques.

Mat@riel et M~thode Organisme. Les individus utilisTs appartiennent soit ~ l'esp~ce Pleurodeles waltlii de provenance ibTrique, soit s l'esp~ee Pleurodeles poireti originaire d'Annaba (AIgbrie) (Lacroix, 1968). Les prTparations ont 6t6 rTalisTes & partir de femelles normales mais 6galement, dans le cas de Pleurodeles poireti, ~ partir d'ovocytes de m&les gTnTtiques transformTs en femelles la suite d'un traitement gynogTne au cours de la pTriode larvaire (Lacroix, 1970 ). Mdthodologie. L'Ttalement des architectures nuelTaires est fond6 sur la mTthodologie dTfinie par Miller et Bakken (1972). En ce qui eoneerne les colorations, lors de nos premieres investigations nous avons eraploy6 la coloration s l'aeide phosphotungstique utilisTe par ces auteurs; par la suite, nous avons fair appel & des techniques d'ombrages mTtalliques en raison du meilleur contraste qu'elles permettent d'obtenir. Dans ee eas nous avons le plus souvent utilis6 un ombrage rotatif au Platine sous un angle d'ineidence voisin de l0 degrTs.

Observations

Nucldoles On t r o u v e chez les d e u x esp~ces 6tudiTes les caractTristiques essentielles d u syst~me nucl6olaire des o v o c y t e s d ' A m p h i b i e n s , Les nuclToles, au n o m b r e de plusieurs centaines, o u t une s t r u c t u r e b i p a r t i t e . Chaque nucl6ole est constitu5 d ' u n e zone g r a n u l a i r e corticale associ4e ~ u n ou plusieurs nodules de t e x t u r e fibrillaire. L a d6sorganisation mTnag6e de l ' a r c h i t e c t u r e nucl4olaire lib~re les nodules de leur c o r t e x lequel est en g r a n d e p a r t i e 61imin6, et se p o u r s u i t p a r un d4ploiement des nodules fibrillaires. Ce d6ploiement d6bute & la p6riph6rie de chaque nodule et gagne p r o g r e s s i v e m e n t le centre. I1 se t r a d u i t p a r l'6mergence de boucles c o n s t i t u t e s d ' u n e fibre sur laquelle sont distribu6es p T r i o d i q u e m e n t les m a t r i c e s fibrillaires polaris6es (fig. 1); c'est ~ ce s t a d e que la d6sorganisation est arr@t6e. L ' a b s e n c e de solution de continuit6 au n i v e a u des fibres est u n a r g u m e n t qui p e r m e t de penser que chaque nodule est form@ p a r une ou t o u t au moins un p e t i t n o m b r e de fibres. L a faille de ces fibres et p a r suite le n o m b r e de m a t r i c e s qu'elles p o r t e n t sont e x t r T m e m e n t variables. Les nodules i m p o r t a n t s r e n f e r m e n t 200 ~ 300 m a t r i c e s voire plus, mais il n ' e s t pus r a r e d ' o b t e n i r des f o r m a t i o n s avec seulement quelques m a t r i c e s : il a 4t4 observ5 des fibres vectrices r e s p e c t i v e m e n t de 2, 6, 7, 8, 15, 16 et 30 matrices. Duns ces cas il a p p a r a i t c l a i r e m e n t que la fibre f o r m e u n a n n e a u (fig. 2 et 3). L a faille et la d i s t r i b u t i o n des s6quenees fibrillaires c o n s t i t u a n t les m a t r i c e s sont c o m p a r a b l e s p o u r les d e u x espTces et d a n s les d e u x sexes. Ces sTquences ont une longueur m o y e n n e de 2,1 ~m et c o m p r e n n e n t 80 & 115 fibrilles disposTes de p a r t et d ' a u t r e de l ' a x e de la fibre en u n g r a d i e n t de taille croissante, elles att e i g n e n t 0,5 ~m au m a x i m u m de leur longuem'.

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Fig. 1. Nodule fibrillaire d'un nucl6ole de PIeurodeles waltlii, en voie de d6sorganisation. Le d6ploiement de la fibre fondamentale d6bute ~ la p6riph6rie de la structure. Noter la distribution r6guli6re et la polarit6 des matrices sur la fibre. Coloration au PTA. (Echelle 10 ~m)

Chaque fibrille possgde ~ son extr6mit6 libre u n granule p a r t i e u l i g r e m e n t bien visible, t a n d i s qu'~ son p o i n t d ' i n s e r t i o n sur la fibre on observe 6galement u n g r a n u l e e o r r e s p o n d a n t ~ la p a r t i c u l e interpr6t6e p a r Miller et B e a t t y (1969a) c o m m a 6rant ta polym6rase de I ' A R N (fig. 4 et 6).

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N. Angelier et J. C. Lacroix

Fig. 2. Anneau nuel6otaire eompos6 de huit matrices. La fl6ehe Ioealise t'~xe intermatrieiel ayant subi un 6tirement m6canique entre les matrices 3 et 4. P. waltlii. Coloration au PTA. (Echelle 2 ~xm)

Fig. 3. Anneau nucl6olaire form6 de 16 matrices. P. waltlii. Coloration au PTA. (Eehelle 2 ~zm)

Les m a t r i c e s s e n t d ' u n e tr6s g r a n d e r6gutarit6 do longueur et poss6dent la m g m e polarit6 10 long d ' u n e m6me fibre. Les espaces i n t e r m a t r i c i e l s d6pourvus de fibrilles, e'est & dire non transerits, c o r r e s p o n d e n t an tiers de la longueur de la m a t r i c e . I n d 6 p e n d a m m e n t des r6gions

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Fig. 4a et b. Matrices correspondant s un cistron ribosomique chez les deux esp~ces de pleurodgles. P. poi~'eti (a) et P. waltlii (b). Noter l'analogie dans l'architeeture, le hombre et la taille des fibrilles de RNP. Coloration au PTA. (Echelle 1 Bin)

intermatricielles a y a n t subi un 6tirement au tours de l'6talement, terrains segments de la fibre sont totalement d6pourvus de matrices sur plusieurs dizaines de microns (fig. 5). Chromosomes

Dans les pr6parations, s c6t~ de ces structures nucl6olaires, figurent des complexes de transcription chromosomiques. Ces architectures ne peuvent ~tre observSes, bien souvent, que de fa~on Iragmentaire. E n effet, leur taille bien sulo6rieure ~ celle des unit6s de transcription d ' A R N ribosomique pose des problames lors de l'Stalement et augmente leur fragilit6. L'organisation fondamentale est comparable s celle observSe au niveau nucl6olaire: les fibrilles de R N P sont ins~r6es sur une fibre de D N P au niveau de granules (fig. 7). Cependant, ces complexes chromosomiques s'identifient par des caractgres propres. Des matrices a p p a r e m m e n t complgtes ont 6t6 observ6es sur des axes de D N P (fig. 8); leur taille est extr~mement variable: des longueurs de 3, 5, 6, 10, 25 et 30 Bm ont 6t6 relev6es, ces analyses pr61iminaires ne pr6jugeant en rien des dimensions extrgmes q u ' o n est susceptible de trouver chez ces espgees.

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Fig. 5. R6gion p6riph6rique d'un nodule nuel6olaire de P. poireti montrant un segment de l'axe de DNP non transcrit (flbehe). Coloration au PTA. (Echelle 2 Bin)

P a r ailleurs, la polarit6 des s6quences tibrillaires n'est pas toujours aussi marquee que dans le cas des nuel6oles (fig. 8b). D'autre part, le mgme axe peut 6tre vecteur de plusieurs matrices de tailles et de caract6ristiques dilf6rentes (fig. 8 a). Lots de l'examen de ees matrices multiples, nous avons 6t6 frapp6s par la fr6quence des s6quenees ~ polarit6s oppos~es (fig. 9). Enfin, la technique d'ombrage employ6e Iait apparaitre au niveau des fibrilles de R N P une diff6renciation se traduisant par l'aspeet granulaire de l'axe fibrillaire et la pr6sence de divertieules lat~raux aboutissant ~ des annelets (fig. 10 et 11).

Discussion Mdthodologie Si la proc6dure d'4talement des structures nucl4aires, mise au point par Miller et Beatty, est parfaitement appropri6e g la prgparation des structures nucl6olaires, cette mgme proe4dure ne permet d'isoler r6guligrement que des fragments de bouclcs de chromosomes; Miller et B e a t t y (1969c) ont signal6 cet aspect restrictif de la m6thode. Cependant, avant mgme de rechercher des modes d'gtalement mieux adapt6s aux chromosomes, il nous est apparu n6cessaire d'am61iorer le

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Fig. 6. Segments de fibres nucl@olairesde P. waltlii apr~s ombrage au Pt. Noter la disp~rition des granules axiaux s certains niveaux de l'axe intermatriciel (fl~che). (Echelle 1 ~m)

Fig. 7. Segmenf d'un complexe de transcription d'origine chromosomique et fibre de DNP non transerite. Ombrage au Pt. P. waltlii, (Eehelle 2 vm)

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Fig. 8. (a) Fragment d'une boucle chromosomique vecteur de deux complexes de transcription. (b) Complexe de transcription isol6 susceptible de correspondre ~ une unit~ de transcription. P. poireti. Ombrage au Pt. (Echelle 10 ~m) contraste des pr@arations dans le but notamment de rep~rer los produits d'une d6sagrggation plus pouss6e des complexes de transcription eux-m~mes. C'est pourquoi nous avons fair appel ~ des techniques utilis6es pour le rep6rage des

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Fig. 9. Segment d'ane boucle pr~sentant des matrices s polarit6s oppos6es; l'une des deux matrices est reparable duns la pr@aration sur pr+s de 10 tzm et l'autre sur pros de 30 ~zm. P. poireti. Ombrage ~u earbone-plutine. (Eehelle 2 ~m)

mol6cnles isol6es. L'ombrage au platine est la technique qui, jusqu's prgsent, nous a donn6 les meilleurs r6sultats. Elle am61iore la r6solution de l'arehitecture des complexes mol~eulaires fibrillaires et permet ainsi de distinguer, sur des crit6res d'organisation, toute une gamme de fibres ou de fibrilles dont le diamgtre oseille entre 3 et 30 nm. Nuctdole~

La pr6senee de nombreux nucl6oles duns la v6sicule germinative des ovocy~es de pleurod+les (Lacroix, 1968) implique l'existence d'une amplification de I'ADN nucl6olaire. Les observations, expos6es pr~c~demment, viennent 6tayer cette interpr6tation en m6me temps qu'elles fournissent la preuve de la redondanee des cistrons ribosomiques, au niveau de ehaque anneau d'ADN, chez les denx esp~ees 6tudi~es. I1 faut noter qu'il n'a pus 6t6 observ6, jusqu's pr6sent, de matrices polarit6s oppos~es ou de tailles anormMes eomme eela a ~t6 signM6 pour les structures nuclgolaires d'autres esp~ees (Miller et Beatty, 1969e; Spring et al., 1974). Chromosomes

A l'inverse du mat6riel nucl6olaire dont l'organisation est relativement simple et homog~ne, l'arehiteeture chromosomique apparalt comme 6taut beaueoup plus eomplexe. Pour les chromosomes en activit6 de transcription et ehez lesquels une organisation ehromom6rique est 6tablie, les observations tendent g acer6diter l'id6e que chaque ehromomgre et la structure fibrillaire en forme de boucle qui en d6rive constituent une unit6 d'organisation. Cette conception d'unit6 d'organisation fonctionnelle, d6velopp6e plus partieuli~rement duns le cas des chromosomes polyt6niques (Beermann, 1972), s'applique 6galement aux chromosomes en geouvillon (Callan, 1963) en d@it d'ineertitudes qui subsistent encore sur les relations entre boueles et ehromom~res (Mott et Callan, 1975).

Fig. 10. Fragments de boucles carac$6ris6es par l'abondance des annelebs reli6s aux fibrilles de RNP. ( b e t c) D6tails. P. poireti. Coloration au PTA. (Echelle 10 ~tm)

C o m p l e x e s de t r a n s c r i p t i o n d ' o v o e y t e s de Pleurodeles

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Fig. 11. D6tails de la fig. 8. Architecture des fibrilles de RNP. Noter la structure discontinue des fibrilles et la pr4sence de diverticules et d'annelets (fl~ches). Ombrage au Pt. (Echelle 0,5 ~m) Dgs lors, se pose le probl~me de savoir si cette unit6 fonctionnelle correspond s une ou plusieurs unit6s de transcription au sens molgculaire du terme. Les seules informations sur les complexes de transcription des chromosomes des ovocytes nous ont 6t6 apport6es par le groupe de Miller (Miller et al., 1970). Cependant, ces auteurs n ' o n t pus d6crit d'unit6s de transcription completes de sorte que le problgme de ]a taille effective de ces unit6s et celui de leur n o m b r e restent entiers. Des observations relutges duns ce travail, r6alis6es sur des matrices apparemm e n t complStes sur ]a fibre de DNP, on peut retirer un certain n o m b r e d'61~ments sur ces deux questions. Les unit6s de transcription different par leurs tailles respectives et leurs dimensions sont inf6rieures s la ]ongueur m o y e n n e des boucles. L'existence de deux ou plusieurs matrices distributes sur le mgme axe et s~par~es par des segments intermutriciels importants plaide en faveur d ' u n e multiplicitg, t o u t au moins relative, des unit6s de transcription duns l'unit6 d'organisation. Duns ces cas, les matrices successives n ' o n t pas les m6mes caract6ristiques : il ne s'agit done pus de structures r6p6titives r6guli~res comparables s celles correspondant anx cistrons ribosomiques. P a r ailleurs, la pr6sence de matrices s polarit6s oppos4es implique l'existence d ' a u moins deux sites d'initiation; nous avons signal6 que ces formations g polurit6s oppos~es ne sont pus rares, de sorte qu'il n'est pus exclu qu'elles puissent correspondre g u n e architecture normale de certaines unit6s chromosomiques. 24 Chromosoma (Berl.), Bd. 51

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N. Angelier et J. C. Laeroix

En d'autres termes, se fair jour l'id@e de l'existenee, au sein m6me des boucles, de segments non transerits importants qui avaient 6ehapp6 aux investigations en microscopie photonique. La signification des annelets reli6s aux fibrilles de R N P reste & 61ucider; cos formations m6ritent eependant une attention particuli~re duns la mesure off elles seraient en relation avec une structure seeondaire de I ' A R N contenn duns ces fibrilles. Des autenrs (Spring et al., 1974) ont 6mis des doutes sur l'origine chromosomique dos images pr6sent@es par Miller et son groupe. Nons ne pouvons partager cetto conception. Si la d6termination de l'origine topographique pr6cise des complexes de transcription pr6sente des diffionlt6s pour les raisons m6thodologiques 6voqu6es plus haut, l'existence de complexes d'origine chromosomiqne ne peut 6tre remise en cause. En effet, d'une part le contr61e des 6tapes de la technique d'6talement en microscopic photoniqne montre que des fragments de chromosomes sont effectivement d6pos6s duns les ehambres de eentrifugation, d'autre part, lorsque lu d6sagr6gation m6nag6e des architectures est arr6t6e de fagon relativement pr6coce, formations nucl6olaires et formations chromosomiqnes sont alors identifiables, au microscope 61eetroniqne, et il est possible d'6tablir nne relation entre leurs structures et les architectures plus d@loy@es d~crites duns ee travail. Au demeurant les informations pr@liminaires recueillies sur les deux types de matrices font appraitre des dill@fences assez notables duns leur organisation respective. Parmi les complexes fibrillaires obtenus dans ies pr@parations seuls cenx correspondant & des figures de transcription ont @t6 d@erits, l'analyse des autres complexes n6cessitant la d6finition de leur origine topographique.

Conclusions L~ m6thode d'6talement des complexes de transcription a 6t6 appliqu6e an mat@riel nncl6aire d'ovocytos d'Amphibiens du genre Pleurodeles. Les complexes d'origine nucl6olaire ont nne organisation r@guligre et homog~ne comparable & eelle d6crite duns d'autres mat6riels. Les observations r6alis6es viennont 6tayer l'interpr@tation d'une amplification de I'ADN nucl6olaire et d'une redondance des eistrons ribosomiques ohez les deux exp~ces 6tudi6es. Par contre les complexes d'origine ehromosomique laissent apparaitre une grande diversit6. Deux caract6ristiques essentielles so d6gagent de eette 6tudc pr61iminaire: l'existence de plusieurs unit6s de transcription par nnitg d'organisation chromosomique et la mise en 6videnee d'une architecture particuligre an niveau des fibrilles de RNP. L'application d'une technique d'ombrage employ@e pour los mol@cules isol6es constitue une amglioration duns la m6thodologie initiale bas@e sur une coloration au PTA. Remereiements. Nous remercions le Docteur E. Delain pour sa collaboration duns la raise au point des techniques d'ombrages m@tMliques.

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