Planta (Berl.) 75, 94--98 (1967)

Der DNS-Gehah yon Kotyledonen und Hypokotyl des Senfkeimlings (Sinapis alba L.) bei der phytochromgesteuerten Photomorphogenese MANFI~ED W~IDN~I~, Botanisches Institu~ der Universit~t Freiburg i.Br. Eingegangen am 11. M~rz 1967

The DNA Contents el Cotyledons and Hy19ocotyl el the Mustard Seedling (Sinapis alba L.) during Phytochrome-Mediated Photomorphogenesis ~ummary. DNA contents and accordingly cell numbers of cotyledons and hypocotyl of the mustard seedling were virtually constant during the experimental period (between 36--60 hours after sowing) in the dark as well as under the influence of P~30, the active phytochrome (Table). - - Therefore the phytochromemediated increase of the RNA and protein contents (WEIDNn~ et al., 1965) must be understood as an increase of RNA and protein per cell. This fact is in agreement with the conception of differential gene activation mediated by P~30(Morn% 1966). The virtually constant DNA contents during the period of time which is regularly used for experimentation on photomorphogenesis in our laboratory (36--60 hours after sowing; Memo, 1966) is an importan~ prerequisite for comparing biochemical data under the point of view of differential gene activation, e.g. in kinetical studies in the dark and under continuous far-red light. Einleitung a) Das aktive Phytoehrom (PTa0) steigert den RNS-Gehalt und die RNS-Synthese yon Senfkeimlmgen (WrID~r u. Mitarb., 1965; W~II)~, 1967; DITtOs, unverSffentlichte Daten). Wit fragen uns, wit diese Ver/~nderung des RNS-Gehaltes zus~ande kommt. ~ n d e r t sich unter dem EhlfluB yon P7~o der Aktivit~tszustand einer konstan~en Anzahl yon Genomen oder h/~ngt die Zunahme des RNS-Gehaltes damit zusammen, dab eine Vermehrung des genetischen Materials sta~tfindet, ohne dab sich dessen relative Aktivit/~t ver/~ndert. I m ersten Fall w/~re die phy~oehrombedingte Erh6hung des RNS-Gehaltes auf Genaktivierungen zuriiekzuffihren, d.h. P780 fibre eine Regulation auf dem Iqiveau der Transkription aus. Ein solehes Ergebnis w/s eine wiehtige Sttitze ftir die tiypothese einer ,,differen~iellen Genaktivierung" dureh Pv30 (z. B. MoI~g, 1966). Dieser tIypothese zufolge kommen die ,,positiven Photomorphosen" dadurch zustande, dab PTao ,,potentiell aktive" Gene aktiviert und demzufolge die RNS-Nettosynthese stimuliert. Wenn sieh hingegen die Erh6hung des RNS-Gehaltes und des Proteingehaltes (W~II)~Eg u. Mitarb., 1965; JAKOBS und ]V[oI~, 1966) als Folge einer Stimulierung der DNS-Replikation dureh P730 ergKbe, w/~re die ttypo-

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these der ,differentiellen Genak~ivierung" in Frage gestell~. Durch Untersuchung des DNS-Gehaltes kann nachgepr/if~ werden, welche dieser beiden MSglichkeiten in Frage kommt. b) DunkeP-Keimlinge und mit PTa0 versehene Keimlinge (z.B. Dunkelrotl-Kelmllnge), bzw. ihre Organe, kSrmen biochemisch im Hinblick auf differentielle Genaktivierung bzw. Genrepression nut dann korrek~ mi~einander verglichen werden, wenn die beiden Keimllngs~ypen w/~hrend der Experimentierzeit ihrea DNS-Gehal~ und ihre Zellzahl nicht verschiedenartig s Zeigt sich ferner, dab die D- und DR-Keimlinge w/~hrend tier Versuchszeit ihren DIqS-Gehalt fiberhaapt nicht wesentlich s so is~ die korrek~e Voraussetzung daffir geschaffen, dab man auch versckieden alte Keimlinge oder ihre Organe dArek~ vergleichen kann. I n diesem Fall kann m a r t dami~ reehnen, da$ auch Polyploidisierung und zunehmende Poly~/~nie keine Rolle spielen. F/Jr die kausale Analyse der yon PTs0 abh/~ngigen Photomorphogenese bedeutet es eine wesentliche Erleichterung, wenn die Probleme, die mit der Replika~ion yon DNS zasammenhs auBer Betrach~ bleiben kSnnen. Material und Methoaen

a) Material. Das verwende~e Samenmaterial is~ eine auf Homogenit~it tier Population gepriifte I~achzueht (Ernte 1963) des seit 1957 (MoHg, 1957) verwendeten Materials. b) Allgemeiner Versuchsansatz. Aussaat und Anzueht tier Keimlinge erfolgten nach den bei uns fibliehen Methoden (Mom~, 1966). Die Keimlinge wurden gem~ unserem Standard-Bestrahlungsprogramm ab 36 Std naeh Aussaat ~ 24 Std mit DR belichtet bzw. blieben als Kontrollen im D. Der DNS-Gehalt wurde naeh 36 Std D und am Ende der Belichtungszeit bestimm~. Ausgewertet wurden nut die Kotyledonen und alas I-Iypokotyl; die Radieula blieb wegen ihrer geringen Bedeu~ung fiir die vorliegenden Fragestellungen unberficksiehtigt. Eine Zunahme ihres DNS-Gehaltes mull a priori aufgrund der Gegebenheitea des Wurzelwaehstums erwartet werden. Die Verwendung yon DR ist aufgrund einer Hypothese yon I-IXRT~rA~ (1966) gerechtfertigt. Ihrzufolge ist die starke morphogenetische Wirkung yon DR darauf zurfickzuffikren, dal] durch diese Strahlung eine zwar geringe, aber praktiseh station~re Konzentration yon Pno fiber einen langen Zeitraum hinweg aufrechterhalten wird. Bei Bestrahlung mit DR ist auBerdem gew~hrleistet, dab eine Lichtwirkung fiber die Photosynthese ausgesehlossen bleibt (B~TSC~ und Mom~, 1965). Zum Zeitpunkt der Versuehsauswer~lmg wurden die Keimlinge in Kotyledonen, Hypokotyl und Radieula geteilt; letztere wurde verworfen. Die Kotyledonen wurden oberhalb der Pe~ioli abgetrenn% so dab diese zum Hypokotyl-Segment z~hlen. Die ffinf kleinsten Keimlinge aus jeder Keimdose wurden nicht verwendet. Der Inhalt yon jeweils vier Keimdosen wurde gemeinsam untersuch~, gedem Einzelwer~ liegen also 80 Segmente zugrunde. c) Bestrahlungsanlage. ])as verwende~e DR-Aggregat wtrrde bei W~,ID~R u. Mitarb. (1965) besehrieben. Die Intensit~t betrug 3600 erg/cm~-sec~ 10%. 1 Abkiirzungen: Dunkel D; Dunkelrot DR. Sinapis alba keimt aueh im D zu 100%.

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M. W~IDNER:

d) Ermittlung des DNS-Gehaltes. Das Pflanzenmaterial wurde sofort in absolutem Methanol bei ca. --700 C eingefroren, um den Stoffwechsel zu inaktivieren. Als Kiihlmittel diente ein Gemiseh aus J~.thanol und Troekeneis. Anschliel3end wurde mit dem Ger~t ,,Ultra-Turrax", Typ TP 18/2 (Janke & Kunkel, Staufen i.Br.) 3 min bei 20000 U/min unter Kfihlung homogenisiert. Eine Temperatur yon --10 ~ C wurde dabei nicht fiberschritten. Zur Eliminierung yon StSrsubstanzen bezfiglieh der DNS-(und RNS-)Bestimmung wurde das Itomogenat sukzessive mit folgenden Extraktionsmitteln behandelt (modifiziert nach SMmLI~und K~OTKOV, 1960): Methanol (abs.), 1~ C; Methanol 0,05 n an Ameisens~ure, 1~ C; 5% Trichloressigs~ure, 1~ C; 90% A_thanol, bei 1~ C gesi~ttigt an Natriumacetat, 1o C [zur restlosen Ent~ernung der Trichloressigs~iure (nach HOL])GATEund Goo])wI~, 1965)]; 95% A_thanol, 1~ C; 95% ~thanol/Di~thyl~ther (abs.) 3:1, 65 o C, 8 rain; Di~thyl~ther (abs.), 200 C. Zur Extraktion der Iqueleins~uren wurde der ~theffreie Rfiekstand 22 Std bei 370 C mit 1 n K 0 H behandelt (nach F~Tz und RSTTGER, 1963). Die DES wurde durch Ans~uern mit 70% Perchlors~ure auf pH 1 bei 1~ C aus dem Extrakt ausgef~llt. Um die F~llung zu erleiehtern, wurden zum anges~uerten Extrakt 2 Vol.-Teile 95 % J~.thanol (1~ C) zugesetzt. Die Hydrolyse der DNS effolgte durch 0,5 n Perchlors~ure bei 700 C (3 Extraktionen) (nach HOLDGATEund GooDwI~, 1965). Mit dem Itydrolysat wurde die Diphenylaminreaktion durchgefiihrt. Der colorimetrischen Bestimmung des DNS-Gehaltes liegt die Extinktionsdifferenz zwischen 540 und 600 nm zugrunde (naeh K v ~ A u. Mitarb., 1961). Die Berechnung effolgte mittels eines Analysenfaktors, der sich aus der Analyse eines jeweils mitbestimmten DNS-Standards ergab (DNS aus Lachssperma, hoehmolekular p. ~. ; yon Serw Entwicklungslabor, Heidelberg). Eine detailliertere Beschreibung der Methode effolgt bei WEIDWER (1967). e) Statistik. I n der Tabelle ist die Seh~tzung des einfachen mittleren Fehlers des arithmetischen Mittels angegeben (n ~ 8). Die Bestimmung erfolgte mit Hilfe der Wissenschaftliehen Tabellen Documenta Geigy (1960).

Experimentelle Daten Die Ergebnisse der E x p e r i m e n t e sind i n der Tabelle dargestellt. E i n e signffikante Z u n a h m e des D N S - G e h a l t e s finder weder i n den K o t y l e d o n e n noeh i m t t y p o k o t y l start. Dies grit sowohl i m D als auch u n t e r d e m Einflul~ VGn Pw0 i m D R . Die Menge a n genetischem Material, u n d d a m i t auch die Zellzahl, ist zwischen 36 u n d 60 Std n a e h A u s s a a t La beiden O r g a n e n des Senfkeimlings weitgehend k o n s t a n t u n d somit i n n e r h a l b dieses Z e i t r a u m s weitgehend unabh/~ngig v o m Alter des K e i m l i n g s u n d yore Z u s t a n d des Phy~ochromsystems. E i n e geringe Tabelle. Der DNS-Gehalt (#g) yon Kotyledonen und Hypokotyl des Sen]keimlings im Dunkel (1)) und im Dunkelrot (DR) wghrend des yon uns i~blicherweise verwendeten Experimentierzeitraums (36--60 Std nach Aussaat ). (Jeder Mittelwert beruht au/ 8 unabhdngigen Einzelwerten) Organ

36 S t d D

36 StdD~-24 Std D

Kotyledonenpaar Hypokotyl

1,884- 0,12 0,92 • 0,10

DR

2,01 4- 0,12 2,114- 0,14 1,02 • 0,10 0,90 • 0,06

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Tendenz zu einer Zunahme des DNS-Gehaltes in beiden Organen im D ist jedoch unverkennbar. Ferner scheint sich anzudeuten, dab Pv3~ in den Kotyledonen die DNS-Synthese fSrdert, im Hypokotyl hingegen hemmt. Diskussion

Die hier gewonnenen Daten stimmen gut mit his~ologischen Befunden iiberein. Das Wachstum sowohl des Itypokotyls (G~IsER, 1964) als aueh der Kotyledonen (ttXCKER, unverSffentlichte Daten) beruht in den] untersuchten Zeitabschnitt weitgehend auf Zellstreckung. Zellteflungen spielen nur eine unbedeutende Rolle. Genaue histologische Untersachungen zeigten jedoch, dab die Intensit/it der Zellteilung im Cortexbereich des Hypokoty]s bei Lactuca sativa L. und beim SenL keimling durch ]?Ts0herabgesetzt wird (HXcK~ u. Mitarb., 1964); die Intensitat der Zellteilung in den Kotyledonen des Senfkeimlings wird hingegen durch Licht gesteigert (KL~B~R und Morn% 1964). Die in der Tabelle angedeuteten Veri~nderungen des DNS-Gehaltes entsprechen genau den histo]ogischen Daten. Die Veranderung des D/qS-Gehaltes und der Zellzahl ist aber in dem yon uns verwendeten Experimentierzeitraum stets gering. Eine betri~chtliche Zunahme des RNS- und Proteingehaltes unter dem Einflul~ yon P~30 (W~IDNV~R U. Mitarb., 1965) laBt sich deshalb nut als Genaktivierung durch ]7730 verstehen, vorausgesetzt, da2 man eine ]?~a0-abh/~ngige Hemmung des RNS- und ]?roteinabbaus aul~er Betracht lal~t. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit ergibt sich ferner, dal~ bei den Kotyledonen und beim ttypokotyl des Senfkeimlings die Voraussetzungen fiir einen unmittelbaren Vergleich biochemischer Daten erfiillt sind. Dies gilt sowohl fiir Organe, die eine unterschiedliche Beliehtung erfahren haben, als auch ffir solche unterschiedlichen Altars (zwischen 36 und 60 Std nach Aussaat). Bei weitgehend konstanter Zellzahl repr/~sentieren die Absolutwerte an RNS, Protein, Ascorbinsi~ure etc. das Verhalten der Einzelzelle im Hypokotyl oder im Kotyledo. Natiirlieh sind die ,,Hypokor und die ,,Kotyledonenzelle" Fiktionen, da diese Organe aus verschiedenartigen Zellen aufgebaut sind. Die Bedeutung des Befundes, daI~ in beiden Organen Zellzahl und DNS-Gehalt sich w/ihrend des yon uns gewahlten Experimentierzeitraumes nicht wesentlich andern, wird dadurch jedoch nieht beeintr/iehtigt. Zusammenfassung Der DNS-Gehalt und somit auch die Zellzahl von Kotyledonen und Hypokotyl des Senfkeimlings sind zwischen 36 und 60 Std nach Aussaat sowohl im Dunkel als auch im Dunkelrot weitgehend konstant. Die dureh ]?hytochrom bewirkte Zunahme des RNS- und Proteingehaltes 7

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98 1VLW~,ID~,g: DNS-Gehalt und phytochromgesteuerte Photomorphogenese (W:EIDNER U. Mi/sarb., 1965) muB deshalb als eine R N S - bzw. P r o t e i n Z u n a h m e p r o Zello a u f g e f a 8 t werden. Dieser Beftmd stfitzt die Vorstellung einer differentiellen G e n a k t i v i e r u n g d u t c h PTs0 (z. B. MoH~, ]966). - - Die w e R g e h e n d k o n s t a n t e Zellzahl y o n H y p o k o t y l u n d K o t y l e d o n e n w/ihrend des y o n uns v e r w e n d e t e n E x p e r i m e n t i e r z e i t r a u m e s is~ eine wichtige Vorausse~zung ffir die V e r g l e i c h b a r k e i t biochemischer D a t e n , z . B . bei k i n e t i s c h e n S t u d i e n (vgl. MOHR, 1966). t t e r m Prof. Mom~ danke ieh f/ir seine groBz/igige Unterstfitzung. Die Arbeit wurde dutch S~chbeihilfen der Dentschen Forschungsgemeinschaft (an Prof. Mo~m) erm6glicht.

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