Hautarzt 1997 · 48:175–180 © Springer-Verlag 1997

Originalien Michael Bock1 · Peter Nickel1 · Matthias Maiwald2 · Reinhard Kappe2 · Helmut Näher1 1 Hautklinik (Direktor:Prof.Dr.D.Petzoldt) der Ruprecht-Karls-Universität,Heidelberg 2Hygiene-Institut (Direktor:Prof.Dr.H.-G.Sonntag) der Ruprecht-Karls-Universität,Heidelberg

Diagnostik von Dermatomykosen mit der Polymerase-Kettenreaktion*

Zusammenfassung Ein Nachweissystem für Dermatophyten mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde entwickelt.Die Primer „TR1“ und „TR2“ flankieren eine 581 bp lange Sequenz innerhalb des Gens, das für die kleine ribosomale Untereinheit (18S rRNA) von Pilzen kodiert.Mittels PCR ließ sich die DNA von Isolaten der 7 häufigsten Dermatophyten amplifizieren, daneben die von einigen Hefe- und Schimmelpilzen.Durch Hybridisierung mit spezifischen Detektionsoligonukleotiden gelang die Identifizierung von Dermatophyten und Candida albicans. Die Restriktionsfragmentanalyse erlaubte die Abgrenzung der Dermatophyten gegenüber den Hefe- und Schimmelpilzen.Die Spezifität der PCR für Pilze wurde an menschlicher DNA aus 42 Dermisund Epidermisproben sowie an ausgesuchter tierischer und pflanzlicher DNA überprüft.Um die klinische Relevanz des Verfahrens zu evaluieren, wurden 69 routinemäßig gewonnene Haut- und Nagelproben mit der PCR und der Kultur untersucht.Mit der PCR wurden in 35 und mit der Kultur in 28 der insgesamt 38 positiv bewerteten Patientenproben Dermatophyten nachgewiesen.Die Sensitivität der PCR (92%) war höher als die der Kultur (73%).Das Ergebnis dieser Untersuchung zeigt, daß die PCR Vorteile gegenüber der Kultur beim Nachweis von Dermatophyten hat. Schlüsselwörter Dermatomykosen · Dermatophyten · Polymerase-Kettenreaktion · 18S rRNA

P

ilzinfektionen von Haut, Haaren und Nägeln zählen zu den häufigsten dermatologischen Krankheitsbildern. Die Diagnostik der Dermatomykosen stützt sich neben dem zum Teil sehr typischen klinischen Aspekt auf den Nachweis der Erreger, den Dermatophyten, Hefepilzen sowie in seltenen Fällen den Schimmelpilzen. Während der Nachweis von Hefepilzen und Schimmelpilzen mit der Kultur meist rasch und zuverlässig gelingt, ist der Nachweis von Dermatophyten häufig nicht zufriedenstellend. Das Ergebnis der mikroskopischen Untersuchung des Nativpräparats ist abhängig von der Erfahrung des Untersuchers und birgt gelegentlich Unsicherheit. Die kulturelle Anzüchtung von Dermatophyten ist mit dem Manko behaftet, daß sie sehr zeitaufwendig ist und bis zu 3 Wochen betragen kann [11, 13, 15]. Neue Maßstäbe im Hinblick auf die Sensitivität beim Nachweis von mikrobiellen Erregern hat die PolymeraseKettenreaktion (PCR) auf vielen Gebieten der Mikrobiologie gesetzt. Dadurch, daß das nachzuweisende mikrobielle DNA-Stück zunächst vielfach verdoppelt wird, bevor man es dann nachweist, besitzt dieses Verfahren eine außergewöhnlich hohe Sensitivität. Darüber hinaus ist das Verfahren innerhalb eines Tages durchzuführen und mittlerweile so standardisierbar, daß es auch in der Routinediagnostik eingesetzt werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurde ein PCR-System entwickelt, mit dem sich Dermatophyten, aber auch Hefeund Schimmelpilze nachweisen lassen.

Nachdem Sensitivität und Spezifität des Verfahrens sichergestellt worden waren, wurde es in einer Pilotstudie auf klinische Anwendbarkeit hin überprüft. Es ließ sich zeigen, daß dieses Verfahren Vorteile gegenüber dem Nachweis von Dermatophyten mittels Kultur besitzt.

Material und Methoden Kultur der Pilze auf SPS-Agar Die Anzüchtung der Dermatophyten, Hefeund Schimmelpilze wurde nach Standardmethoden auf Sabouraud-Glucose (4%)Agar (SPS) durchgeführt.

DNA-Extraktion Die DNA der Pilzisolate wurde nach einem modifizierten Phenol-Chloroform Verfahren extrahiert [4]. Zur Extraktion der DNA aus Haut- und Nagelproben wurde der QIAamp Tissue Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland) eingesetzt: 10–25 mg Hautschuppen oder Nagelmaterial wurden mit Proteinase K verdaut, das Hydrolysat auf QIAamp-Säulen aufgetragen und unter Zentrifugieren nach Protokoll gewaschen und eluiert.

Primerdesign Mit Hilfe des HUSAR (Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources)-Computersystems [18] und eines Multalignprogramms [7] wurden die 18S rRNA Sequenzen repräsentativer Pilze bzw. Kontrollorganismen verglichen und die pilzspezifischen Primer

* Herrn Prof.Dr.D.Petzoldt zum 60.Geburtstag gewidmet Priv.-Doz. Dr. H. Näher Universitäts-Hautklinik,Voßstraße 2, D-69115 Heidelberg& y d & : k c o l b n f / Der Hautarzt 3·97

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M.Bock · P.Nickel · M.Maiwald · R.Kappe H.Näher Detection of dermatophytes by polymerase chain reaction Summary A polymerase chain reaction (PCR) assay for the detection of dermatophytes was established.The primers “TR1”and “TR2”amplify a 581 bp fragment within the gene coding for the small ribosomal subunit (18S rRNA) of fungi.PCR allowed the detection of isolates of 7 common dermatophytes and in addition several yeasts and moulds.Hybridisation with specific oligonucleotides results in the identification of dermatophytes and Candida albicans. Restriction analysis of the PCR product allowed us to distinguish between dermatophytes and yeasts or moulds.The specifity of the PCR with respect to fungi was assessed by testing human DNA collected from 42 dermis and epidermis specimens as well as DNA from selected plants and animals.To evaluate the clinical relevance of the PCR assay, 69 routinely collected skin and nail specimens were examined by PCR and culture. PCR detected dermatophytes in 35 and culture in 28 of 38 specimens that were classified as positive.Sensitivity of PCR (92%) was higher than that of culture (73%).These results show that PCR has advantages over culture for the detection of dermatophytes. Key words Dermatomycoses · Dermatophytes · Polymerase chain reaction · 18S rRNA

Originalien „TR1“ (5´-GTTTCTAGGACCGCCGTA) und „TR2“ (5´-CTCAAACTTCCATCGACTTG) ausgewählt. Die Primer wurden im Auftrag synthetisiert (TIB Molbiol, Berlin).

Restriktionsanalyse PCR-Amplifikation Die PCR erfolgte unter Standardbedingungen [16] mit extrahierter DNA von Pilzen, Kontrollorganismen, Haut- und Nagelproben. Der PCR-Ansatz bestand jeweils aus: 2 µl der DNA-Lösung (25–75 ng/µl), 50 mM Primer „TR1“ und „TR2“, 10×PCR-Puffer (Perkin Elmer, Langen), 10 mM Desoxyribonukleosid-Triphosphate (dATP, dTTP, dCTP und dGTP), 2,5 U Taq Polymerase (Perkin Elmer) and Aqua destillata ad 50 µl. Es wurde ein GeneAmp PCR System 9600 Thermocycler (Perkin Elmer) benutzt. Zur Amplifikation wurde folgendes Reaktionsschema programmiert: Initiale Denaturierung bei 95° C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen mit Denaturierung bei 95° C für 1 min, Annealing bei 53° C für 1 min und Extension bei 72° C für 1 min.

Kapillar-Transfer von DNA auf eine Nitrozellulosemembran (Southern blot) Die DNA wurde nach der Elektrophorese vom Agarosegel auf eine positiv geladene Nylonmembran (GeneScreen Plus, NEN du Pont, Boston, MA, USA) transferiert [16, 19].

Sondendesign und radioaktive Markierung von Oligonukleotiden Mit Hilfe des HUSAR-Computersystems [18] und eines Multalignprogramms [7] wurden die 18S rRNA Sequenzen repräsentativer Pilze, bzw. Kontrollorganismen verglichen und die Sequenzen „TU“ (5´-GGGTTTCTTTTATGACC) und „CA“ (5´-TGTTGTTCTTTTATTGACGCA) als Gensonden ausgewählt. Die Gensonden wurden im Auftrag synthetisiert (TIB Molbiol, Berlin). Die Markierung erfolgte durch Einbau von 32P mit Hilfe des Enzyms T4 Polynukleotidkinase (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

Hybridisierung und Autoradiographie Prähybridisierung, Hybridisierung und Waschvorgänge erfolgten im Hybridisierungsofen (Mini Hybridisation Oven, Biometra, Göttingen). Die Blotmembran wurde in 100 ml Hybridisierungslösung (0,9 M NaCl, 6 mM EDTA, 90 mM Tris, 1% SDS, 100 mg/l t-RNA) für 2 Stunden bei 55° C mit „TU“ und bei 50° C für „CA“ prähybridisiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation mit 5–10 ml Hybridisierungslösung 2 µl des radioaktiv markierten Oliginukleotids enthaltend für mindestens zwei Stunden bei der entsprechenden Temperatur. Danach wurde die Blotmembran jeweils 10 min zunächst mit 100 ml Waschlösung 1 (2×SSC, 0,1% SDS) und anschließend mit 100 ml Waschlösung 2 (0,1×SSC, 0,1% SDS) bei der Hybridisierungstemperatur inkubiert. Die Exposition erfolgte mit einem Röntgenfilm bei −70°

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C für 6 Stunden bis zu 3 Tagen in Abhängigkeit von der Strahlungsintensität der Hybridisierungslösung.

In 0,5 ml Eppendorfgefäße wurden 17,5 µl der PCR-Produkte, 0,5 µl (5 U) des Restriktionsenzym Bsa HI (New England Biolabs, Beverly, USA) und 2 µl des zugehörigen 10×Puffers pipettiert. Anschließend wurde für 2–3 Stunde in einem 37° C warmen Wasserbad hydrolysiert und die Proben auf ein 1,2% Agarosegel aufgetragen.

Ergebnisse Amplifikation von Pilz-DNA aus Laborstämmen Unter Verwendung der Primer „TR1“ und „TR2“ wurden Isolate der sieben häufigsten in Mitteleuropa auftretenden Dermatophyten [12, 17] und repräsentative Vertreter der Hefepilze sowie einige Schimmelpilze mit der PCR untersucht. Abbildung 1 zeigt, daß sich aus den DNA-Extrakten der untersuchten Pilze Fragmente der gesuchten Länge von 581 bp amplifizieren ließen. Offensichtlich lassen sich mit dem gewählten Primerpaar die verschiedenen Pilzarten nachweisen.

Prüfung der Spezifität Da die PCR nicht nur zur Klassifizierung von Isolaten, sondern mit dem Ziel entwickelt wurde, Pilze im Patientenmaterial nachzuweisen, mußte ausgeschlossen werden, daß pilzfremde DNA amplifiziert wird. Das bedeutet, es mußte die Spezifität des Verfahrens für Pilze sichergestellt werden. Zu diesem Zweck wurde DNA, die aus 42 Dermisbzw. Epidermisproben verschiedener Individuen extrahiert worden war, mit der PCR untersucht. Zusätzlich wurde tierische DNA der Maus sowie DNA, die aus diversen Pflanzen gewonnen worden war, getestet. Um bei dem zu erwartenden negativen Ergebnis eine Inhibition der PCR ausschließen zu können, wurden die DNA-Proben im gleichen Ansatz mit einem weiteren Primersystem („18S“) [8] untersucht, das ebenfalls DNA aus dem 18S rDNA Gen von Pilzen amplifiziert, aber nicht pilzspezifisch ist und mit menschlicher DNA reagiert.Wie Abbildung 1 zeigt, ließ sich mit den Primern „TR1“ und „TR2“ weder menschliche noch tierische und auch nicht pflanzliche DNA amplifizieren. Im Gegensatz dazu kam es zum Nachweis entsprechender DNA-Frag-

mente, wenn das „18S“ Primersystem verwendet wurde. Dies legt nahe, daß „TR1/TR2“ tatsächlich keine pilzfremde DNA nachweist, vielmehr hochspezifisch für Pilz-DNA ist [1].

Nachweisgrenze der Pilz-PCR Um abschätzen zu können, wie empfindlich die etablierte PCR Pilze nachweist, wurde eine Verdünnungsreihe mit DNA von Saccharomyces cerevisiae hergestellt. Die Wahl fiel auf diesen Pilz, da Saccharomyces cerevisiae-DNA (SERVA, Heidelberg, Deutschland) in definierter Konzentration im Handel erhältlich war. Unter Standardbedingungen wurden die verschiedenen Verdünnungen mit der PCR untersucht. Es ließen sich noch 10 pg DNA nach Elektrophorese im Agarosegel nachweisen. Dies entspricht ungefähr 100 Kopien des Pilzgenoms.

Abb.1 m Amplifikationsprodukte der Primer „TR1“und „TR2“ und von universellen Primern für die 18S rRNA mit DNA von repräsentativen Pilzen und Pflanzen, sowie DNA von Maus und menschlicher Dermis und Epidermis. Spuren: 1, 100 bp Marker; 2, Trichophyton rubrum, TR Primer; 3, Trichophyton rubrum, 18S Primer; 4, Saccharomyces cerevisiae, TR Primer; 5, Saccharomyces cerevisiae, 18S Primer; 6, Candida albicans, TR Primer; 7, Candida albicans, 18S Primer; 8, Kohl, TR Primer; 9, Kohl, 18S Primer; 10, Rettich, TR Primer; 11, Rettich, 18S Primer; 12, 100 bp Marker; 13, Weizen, TR Primer; 14, Weizen, 18S Primer; 15, Gerbilmaus, TR Primer; 16, Gerbilmaus, 18S Primer; 17, Dermis (Mensch), TR Primer; 18 Dermis (Mensch), 18S Primer; 19: Epidermis (Mensch), TR Primer; 20, Epidermis (Mensch), 18S Primer; 21, Negativkontrolle

(„CA“) verwendet, die für Candida albicans spezifisch ist. Mit den PCR-Produkten der ausgewählten Dermatophyten, Hefe- und Schimmelpilze wurde ein SouthernBlot durchgeführt. Bei der nachfolgen-

den Inkubation mit dem 32P radioaktiv markierten Detektionsoligonukleotid „TU“ ließ sich die amplifizierte DNA aller sieben Dermatophyten, nicht jedoch der Hefe- und Schimmelpilze darstellen (Abb. 2b). In analoger Weise erfolgte die

Differenzierung in Dermatophyten, Hefe- und Schimmelpilze Um die amplifizierten PCR-Fragmente zu differenzieren, d.h. sie Dermatophyten, Hefe- oder Schimmelpilzen zuordnen zu können, wurden zwei verschiedene Verfahren getestet: zum einen die Hybridisierung mit Detektionsoligonukleotiden und zum anderen die Restriktionsfragmentanalyse. Bei beiden Verfahren macht man sich die Unterschiede der verschiedenen Pilzgattungen und -arten im variablen Bereich der amplifizierten Genfragmente zunutze. Zur Detektion von dermatophytenspezifischen Sequenzen wurde eine 20 Nukleotide lange Sequenz („TU“) ermittelt, die in erster Linie spezifisch für Trichophyton rubrum ist, aber auch mit den übrigen getesteten Dermatophyten kreuzhybridisiert. Zur Hybridisierung von Hefepilzen wurde die Nukleotidsequenz

a

b

c Abb.2 m a Amplifikation von Pilz DNA mit den Primern „TR1“ und „TR2“. b Hybridisierung mit der für Dermatophyten spezifischen Sonde „TU“. c Hybridisierung mit der für Candida albicans spezifischen Sonde „CA“. Dermatophyten: 1, Trichophyton rubrum; 2, Trichophyton mentagrophytes; 3, Trichophyton verrucosum, 4, Trichophyton terrestre; 5, Microsporum canis; 6, Microsporum gypseum; 7, Epidermophyton floccosum; 8, Mensch (keine Amplifikation mit TR Primern); Hefepilze: 9, Saccharomyces cerevisiae; 10, Candida albicans; 11, Candida glabrata; 12, Cryptococcus neoformans; Schimmelpilze: 13, Fusarium oxysporum; 14, Geotrichum candidum Der Hautarzt 3·97

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Abb.3 m Spezifischer Nachweis von Dermatophyten DNA durch Restriktionsanalyse unter Verwendung der Endonuklease Bsa HI. 1, 123-bp Marker; Dermatophyten: 2, Trichophyton rubrum; 3, Trichophyton mentagrophytes; 4, Trichophyton verrucosum; 5, Trichophyton terrestre; 6, Microsporum canis; 7, Microsporum gypseum; 8, Epidermophyton floccosum; Hefepilze: 9, Candida tropicalis; 10, Candida glabrata; 11, Candida albicans; 12, Cryptococcus neoformans; 13, Saccharomyces cerevisiae; Schimmel: 14, Geotrichum candidum

Hybridisierung mit 32P-markiertem Oligonukleotid „CA“ unter Verwendung der gleichen PCR-Produkte, wie sie für die Hybridisierung der Dermatophyten verwendet wurden. Wie unten in Abb. 2 zu sehen ist, ließen sich Candida albicans spezifisch nachweisen, nicht jedoch die übrigen untersuchten Hefepilze. Eine Hybridisierung des Detektionsoligonukleotids mit den aus Dermatophyten und Schimmelpilzen amplifizierten DNA-Fragmenten ließ sich nicht feststellen. Für die Restriktionsfragmentanalyse wurden die Spaltstellen diverser Endonukleasen im Bereich der amplifizierten Sequenzen ermittelt. Die Wahl fiel auf das Restriktionsenzym Bsa HI, welches das aus Dermatophyten amplifizierte 18S rDNA-Stück an Position 1317 [3] spaltet und das Fragment der Hefebzw. Schimmelpilze unversehrt läßt. Die PCR-Produkte der ausgewählten Dermatophyten, Hefe- und Schimmelpilze wurden einem Enzymverdau unterworfen und danach auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Aufgrund der Spaltung der Fragmente von Dermatophyten in ein 520 und ein 61 Nukleotide langes DNA-Stück wird eine Zuordnung zu Dermatophyten möglich (Abb. 3). Da kurze DNA-Stränge im Agarosegel nur schwer nachweisbar sind, ist das kleine Fragment nur andeutungsweise sichtbar. Eine sichere Differenzierung wird jedoch durch die Längenunterschiede des großen 520

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Nukleotide umfaßenden Fragments der Dermatophyten zum nicht geschnittenen, 581 Nukleotide langen PCR-Produkts der anderen Pilze möglich. Als Längenstandard und zur Kontrolle der Enzymwirkung wurde ein nicht mit Bsa HI verdautes PCR-Produkt der Dermatophyten auf den Agarosegelen aufgetragen.

Klinische Evaluierung des Verfahrens Um den Wert des etablierten PCR-Verfahrens für die Diagnostik von Pilzinfektionen in der Klinik zu evaluieren, wurden routinemäßig gewonnene Haut- und Nagelproben zum einen auf konventionelle Weise, d.h. mit Nativpräparat und Kultur auf SPS-Agar und

zum anderen mit der PCR untersucht. Dazu wurden die Hautschuppen und Nagelproben mit Proteinase-K hydrolisiert und anschließend die DNA mit Hilfe des QIAamp Tissue Kit isoliert. Abbildung 4 zeigt ein Agarosegel der aus Patientenproben mit der PCR amplifizierten DNA, darunter dasselbe Gel nach Southern Blot und Hybridisierung mit 32P-markierter Sonde „TU“. Dieses Ergebnis belegt, daß mit der PCR Dermatophyten im Patientenmaterial nachgewiesen werden können. Um einen Eindruck von der Leistungsfähigkeit des etablierten Verfahrens bei der Diagnostik von Dermatophyteninfektionen zu erhalten, wurden die mit der PCR erzielten Ergebnisse mit denen der konventionellen Nachweisverfahren verglichen. Von insgesamt 69 Asservaten (31 Hautproben in Form von Schuppen und 38 Nagelproben) waren mit der PCR 36 positiv, im Nativpräparat 37 und in der Kultur 29 (22×Trichophyton rubrum, 6×Trichophyton mentagrophytes, 1×Trichophyton terrestre). Bei der vergleichenden Bewertung von Kultur und PCR wurde ein Testergebnis als positiv angesehen, wenn mindestens zwei der drei Verfahren (1. Nativpräparat, 2. Kultur, 3. PCR) nach den jeweiligen Kriterien zum Nachweis von Pilzen geführt hatten. Unter dieser Voraussetzung waren 38 Proben positiv und 31 Proben negativ zu beurteilen.Von diesen positiven Proben waren 35 auch in der PCR positiv. Mit der Kultur konnte lediglich in 28 Fällen Dermatophyten nachgewiesen werden. Auf der Grundlage dieses Ergebnisses errechnet sich die Sensitivität

a

b Abb.4a, b m Amplifikation pilzspezifischer Gensequenzen in Patientenproben. a Agarosegel nach PCR mit den Primern „TR1“ und „TR2“. b dermatophytenspezifische Hybridisierung mit der Sonde „TU“. Spuren: 1–3, 6, 9, 12, 13, Nagelmaterial von Patienten; 4, 5, 7, 8, 10, 11, Hautschuppen von Patienten

der PCR mit 92% und die der Kultur mit 73%.

Besprechung Mit der vorliegenden Studie wurden drei Ziele verfolgt: Zum einen sollte untersucht werden, ob sich Dermatophyten selektiv, also ohne Kreuzreaktivität mit menschlicher DNA mittels PCR nachweisen lassen. Zum anderen sollte festgestellt werden, ob eine Differenzierung bis auf Gattungs- oder Stammebene möglich ist. Schließlich galt es zu ermitteln, ob sich das Verfahren für klinische Untersuchungen sinnvoll einsetzen läßt. Wie die Ergebnisse zeigen, konnten diese Ziele dem Prinzip nach erreicht werden. Zur Amplifikation mittels PCR sind diverse Primersysteme beschrieben worden. Diese Primersysteme wurden jedoch primär mit dem Ziel der Sequenzierung von definierten Pilzgenen und zu taxonomischen Zwecken entwickelt [10, 20]. Da bei diesen Untersuchungen von Laborstämmen oder einzelnen Isolaten ausgegangen wird, konnte bei der Auswahl der Primer eine mögliche Kreuzhybridisierung mit anderen Mikroorganismen oder menschlicher DNA unberücksichtigt bleiben. Tatsächlich zeigen die in der Literatur beschriebenen Primersysteme auch beträchtliche Homologien zu den entsprechenden Sequenzen anderer eukaryontischer Gene. Im Gegensatz dazu mußte bei der Auswahl von Primern für den Nachweis von Pilz-DNA im klinischen Material der übergeordnete Gesichtspunkt sein, eine Kreuzhybridisierung der Primer mit anderen Sequenzen von Eukaryonten, insbesondere mit menschlichen Genen, aber auch mit prokaryontischen Genen, zum Beispiel von Bakterien der Hautflora, auszuschließen [1, 5, 9]. Darüber hinaus wurde eine DNA-Sequenz gesucht, die einerseits relativ variable Bereiche umfaßt und andererseits von Sequenzen flankiert ist, die innerhalb der Pilze stark konserviert sind. Unter den Pilzgenen bot sich das 1750 bp lange Gen der kleinen ribosomalen Untereinheit (18S rRNA) an. Dieses war auch schon von anderen Autoren für die Amplifikation von Pilz-DNA ausgewählt worden [2, 6, 10]. Die Sequenz war zu Beginn der Untersuchungen nur von einem einzigen Dermatophyten (Trichophyton

rubrum) bekannt, weshalb es sich nur auf emprisiche Weise feststellen ließ, ob diese Primer auch DNA anderer relevanter Dermatophyten amplifizierten. Wie gezeigt werden konnte, war dies der Fall: mit Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton terrestre, Trichophyton verrucosum, Microsporum canis, Microsporum gypseum und Epidermophyton floccosum werden neben Trichophyton rubrum die in Mitteleuropa häufigsten Dermatophyten erfaßt. Die Spezifität der Primer für Pilz-DNA wurde neben dem computergestützten Abgleich der Sequenzen durch die Untersuchung exemplarischer Tier- und Pflanzen-DNA und vor allem durch die Testung von Hautproben von 42 Individuen sichergestellt. Der die Spezifität belegende fehlende Nachweis amplifizierter DNA war weder die Folge einer zu geringen Menge untersuchter DNA noch einer Hemmung der PCR, da die Kontroll-PCR mit universellen eukaryontischen Primern zur Amplifikation des entsprechenden DNA-Segments führte. Zur Identifizierung gattungsspezifischer Sequenzen innerhalb des variablen Bereiches wurden zwei Wege beschritten: Die Hybridisierung mit Dektektionsoligonukleotiden (Gensonden) und die Restriktionsfragmentanalyse [14]. Bei der computergestützten Ermittlung der Detektionsoligonukleotidsequenz stand wiederum nur die 18S rRNA Sequenz von Trichophyton rubrum zur Verfügung. Die Auswahl der Sequenz konnte deshalb nur im Hinblick auf die Abgrenzung von Hefen und Schimmelpilzen getroffen werden, jedoch nicht im Hinblick auf die Unterscheidung verschiedener Dermatophytenstämme. Wie die Hybridisierung mit der Sonde „TU“ der verschiedenen Dermatophyten zeigte, war tatsächlich eine Dermatophytenspezifität festzustellen, es lassen sich also durch den Einsatz der Sonde „TU“ Dermatophyten von Hefe- und Schimmelpilzen abgrenzen. Unter dem diagnostischen und therapeutischen Gesichtspunkt dürfe eine solche Unterscheidung ausreichen: sie ermöglicht die Zuordnung zu den klinisch unterschiedlichen Entitäten Tinea und Candidose und damit eine gezielte Therapie. Die mittlerweile bekannten 18S rRNA Sequenzen der übrigen Dermatophyten weisen nur geringe Unterschie-

de auf und schränken daher die Möglichkeit ein, mittels Detektionsoligonukleotiden oder Restriktionsfragmentanalyse eine Differenzierung nach Dermatophytenspezies vornehmen zu können. Die durch Abgleich mit den Hefeund Schimmelpilzsequenzen ermittelte Endonukleasespaltstelle ermöglichte zwar die deutliche Unterscheidung von Dermatophyten auf der einen und Hefe- bzw. Schimmelpilzen auf der anderen Seite, nicht jedoch die speziesspezifische Differenzierung. Die klinische Relevanz des PCRgestützten Dermatophytennachweises wird durch die Pilotstudie belegt. Die aufgrund der hohen Sensitivität des Verfahrens und des ubiquitären Vorkommens von Pilzen gehegte Befürchtung, die PCR würde bereits bei einer passageren Pilzbesiedlung der Haut ohne Krankheitswert oder bei einer Kontamination des Untersuchungsmaterials mit „Anflugpilzen“ zu positiven Ergebnissen führen, erwies sich als unbegründet. Nur in einem einzigen Fall war die PCR bei negativer Kultur und negativem Nativpräparat positiv. Diese hohe Spezifität wurde jedoch nicht auf Kosten einer niedrigen Sensitivität erreicht. Vielmehr betrug diese 92% gegenüber 73% der Kultur. Offensichtlich ist die PCR wie bei der Diagnostik anderer mikrobieller Erreger der Kultur beim Nachweis von Dermatophyten überlegen. Als weiterer Vorteil der PCR kommt bei der Dermatophytendiagnostik die gemessen an der Kultur geringe Zeitdauer hinzu, bis das Ergebnis vorliegt. Trotz der Erkenntnis, daß die PCR die Dermatophytendiagnostik entscheidend verbessern kann, sollte nicht übersehen werden, daß das vorliegende Verfahren noch verbesserungswürdig ist. Da die Sequenzunterschiede der einzelnen Dermatophyten untereinander innerhalb der 18S rDNA nur sehr gering sind, könnte sich deren Differenzierung mit dem gewählten Primersystem als nicht möglich erweisen. Dies würde bedeuten, daß eine Unterscheidung zwischen pathogenen und apathogenen sowie zwischen anthropophilen, geophilen und zoophilen Dermatophyten nur eingeschränkt möglich ist. Durch die Wahl anderer Primer, die ein längeres Segment der 18S rDNA flankieren oder durch Verwendung eines anderen Gens, müßte es jedoch mögDer Hautarzt 3·97

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Buchbesprechung lich sein, durch dann zu ermittelnde Gensonden oder Restriktionsenzymspaltstellen zum einen eine klare Unterteilung in Dermatophyten, Hefe- und Schimmelpilze zu erhalten und zum anderen eine Unterscheidung bis auf Speziesebene zu erreichen. Erst dann wären alle sich in der vorliegenden Arbeit abzeichnenden Vorteile des Verfahrens realisiert.

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&ingegangen am 30. April 1996 E : c s i m Angenommen am 2. Oktober 1996

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S. Karl, H. Bruckbauer

Derma pocket Börm Bruckmeier Verlag „Derma pocket“ Dermatologie für schnelle Leser, so könnte man das neue in sehr übersichtlicher Form dargestellte Vademecum für die Kitteltasche als klinischen Begleiter und Repetitorium bezeichnen. Dieses in sehr handlicher Form konzipierte Nachschlagewerk mit 337 farbigen Abbildungen auf insgesamt 450 Seiten, das zum Wiederholen hervorragend geeignet ist, soll nicht nur den in der Ausbildung befindlichen Arzt, sondern auch den Praktiker, ja sogar andere Kollegen ansprechen, für die die Dermatologie aus klinischer Sicht Bedeutung gewinnt. Die Autoren der Münchner Dermatologischen Klinik der Technischen Universität München haben unter Verwendung eines reichhaltigen Bildmaterials Fakten und Krankheitsbilder in einer klaren Konzeption nach Pathogenese, Hautbefund, Differentialdiagnose, klinischer Symptomatologie und der therapeutischen Maßnahmen mit wichtigen Grundbausteinen der Rezeptur beleuchtet. Die junge nachrückende Generation gibt ein Beispiel, das Schule machen sollte, wie man konkret ohne lange Vorreden auf das Thema zustoßen kann. „Derma pocket“ ist daher für den klinischen Alltag nicht nur ein Nachschlagewerk für die Kitteltasche, sondern auch ein Repetitorium. H.W. Kreysel (Bonn)