Blur, Band XIX, Seite 529-536 (1969)

Aus dem Institut fiir Hdmalologie der Gesellschaft fiir Strahlenforschung Assoziation raft E U R A T O M und der Abteilung fiir Hdmalologie an der I. Medizinischen Universild*sklinik, Miinchen (Vorstand." Prof. Dr. IF*. S*ich)

Eine neue Methode zur Bestimmung der DNS-Synthesegeschwindigkeit von Knochenmarkzellen in vitro * V o n W. B r i n k m a n n , P. D 6 r m e r u n d P. M u s c h a l i k E i n Verfahren z u r v e r g l e i c h e n d e n proliferationskinetischen U n t e r s u c h u n g menschlicher K n o c h e n m a r k z e l l e n mit Hilfe radioaktiver D N S - V o r s t u f e n sollte zwei V o r a u s s e t z u n g e n erftillen: 1. Es sollte in vitro an b i o p t i s c h e m Material d u r c h f i i h r b a r sein; d e n n die I n j e k t i o n tritiierter V e r b i n d u n g e n zu diesem Z w e c k ist n u t in A u s n a h m e f~illen b e i m M e n s c h e n vertretbar. 2. Es muB eine m o r p h o l o g i s c h e Klassifizierung der z u u n t e r s u e h e n d e n Zellen e r m 6 g ichen. Bis jetzt g i b t es aber keine M e t h o d e , die beide B e d i n g u n g e n erfiillt. D a h e r sind unsere K e n n t n i s s e proliferationskinetischer Parameter, die fiber den E i n bau radioaktiver Nukleins/iurevorstufen in die D N S m e n s c h l i c h e r K n o c h e n markzellen g e w o n n e n w o r d e n sind, fiir den klinischen B e d a r f n o c h liickenhaft [3-5,7-9J. M a n c h e r kl/irende G e d a n k e hinsichtlich W e s e n u n d T h e r a p i e verschiedener k r a n k h a f t e r V e r / i n d e r u n g e n des b l u t b i l d e n d e n Systems w~ire j e d o c h v o n daher zu erwarten. Diese A r b e i t u n t e r n i m m t daher a m Beispiel des R a t t e n k n o c h e n m a r k s den Versuch, die D N S - S y n t h e s e g e s c h w i n d i g k e i t in v i t r o mit einem n e u e n V e r fahren v e r g l e i c h e n d zu untersuchen. Methodik Die In-vilro-Inkubation: Ca. 350 g schwere m/innliche Sprague-Dawley-Ratten wurden in Xther get6tet, die Knochemnarkzellen mit Medium 199 der Firma Difco, USA, herausgespritzt. Nach Filtration durch ein Glasfilter der Porengr6Be 40-90 bt wurden die Zellen bei 0~ 10 Min. lang bei 52 g zentrifugiert und nach Absaugen des Oberstandes in frischem eisgekiihltem Medium 199 resuspendiert, sofem nicht anders angegeben. Die so gewonnene Suspension mit einer Zellkonzentration yon etwa 20000/ram a wurde noch einmal durch ein neues Glasfilter der o. a. Poremveite passiert und dann auf eine bestimmte Anzahl yon Inkubationsr6hrchen verteitt. Die Suspensionsproben von 0,95 und 1 ml - je nach Versuchsart wurden zusammen mit einem Luftvolumen yon 10 ml mit Glasstopfen wasser- und luftdicht verschlossen. Von der T6tung des Tieres an gerechnet vergingen bis dahin 40 Min. Nach einem zeitlich genau festgelegten Plan wurden die R6hrchen in ein 37~ warmes Wasserbad gestellt und mit einer Frequenz yon 250/Min. gesch/ittelt, um ein Sedimentieren der Zellen zu vermeiden. Beendet wurde die Inkubation dureh Eisktihlung, um einen weitereix Einbau radioaktiver DNS-Vorl~iufer zu verhindern. * Studie im Rahmen des Assoziations-Vertrages H~imatologie EURATOM-GSF Nr. 031-641 BIAD. Eingegangen am 20. Mfirz 1969.

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Markierte undunmarkierte Substanzen: Folgende radioaktiveVerbindungen wurden gebraucht : [2-14C]-Thymidin (spez. Akt. 58 mCi/mMol) u. [6-aH]-Desoxyuridin (spez. Akt. 9,45 Ci/mMol) der Firma Amersham, England; [8-aH]-Desoxyadenosin (spez. Akt. 3,09 Ci/mMol) der Firma Schwarz, USA. Das Inkubationsmedium enthielt zusiitzlich folgende nichtradioaktive Substanzen: 1,3 • 104Mol Amethopterin-Na/1, wenn nicht anders angegeben; 5 • 10-SMol Adenosin/1; 250 mg Glycin/1; 300 mg Serin/1; 10 -SMol Desoxycytidin/1; 10 -SMol Thymidin/1 (bis auf Versuche mit 14C-Thymidin und aH-Desoxyuridin). Amethopterin stellte die Firma Lederle, Miinchen, zur Verftigung; alle anderen Feinreagentien wurden yon der Firma Serva, Heidelberg, bezogen. Im allgemeinen enthielt das zur Resuspension benutzte eisgektihlte Inkubationsmedium bereits die erforderlichen Zus~itze an markierten und unmarkierten Verbindungen. Nur bei folgenden Versuchen wurden einzelne Substanzen nachtr~iglich in die Inkubationsr6hrchen pipettiert: Zur Prtifung der Hemmwirkung yon Amethopterin auf den aH-Desoxyuridineirtbau erhielten die Suspensionsproben vor der Inkubation Amethopterin in versehiedenen Konzentrationen. Zur Messung des aH-Desoxyuridineinbaus in Abh~ingigkeit vonder Einwirkzeit betrug die Amethopterinkonzentration 1,2 • 10-SMol/1 in der Suspension, 10 btCi aHDesoxyuridin in 0,05 ml physiologischer Kochsalzl6sung wurden zu je 0,95 ml Suspension entweder vor Inkubationsbeginn oder zu verschiedenen Zeiten danach hinzugefiigt. 8 Min. sp~iter wurden die R6hrchen dem Wasserbad entnommen und eisgekiihlt. Zur Kontrolle wurde der 3H-Desoxyuridineinbau in einer Suspensionsprobe ohne Amethopterin gemessen. Um den 14C-Thymidin- bzw. aH-Desoxyuridineinbau in den ersten 20 Min. der Inkubation bei steigertden Amethopterinkonzentrationen zu bestimmen, erhielteri die Suspensionsproben Amethopterin in unterschiedlichen Konzentrationen vor Inkubationsbeginn. Fliisdgkeitsszintillafion und Bestimmung des DNS-Gehaltes: Die weitere Aufarbeitung des Zellmaterials erfolgte in Anlehnung an die yon Schneider beschriebene Methode [10]. Die Zellen wurden in 2 ml dest. Wasser homogenisiert. Nach Zugabe von 4 ml eisgektihlter 10proz. Trichloressigs~iure wurde bei 0~ 10 Min. lang mit 510 g zentrifugiert und der l~berstand abgesaugt. Anschliel3end wurde das Sediment noch viermal mit eisgektihlter 5proz. Trichloressigs~ure gewascheri und mit Glasst~iben wiederholt zerrieben. Die Extraktion der Nukleins~iuren erfolgte in 15 Min. bei 90~ mit 2 ml 5proz. Trichloressigs~iure. Nach dem Zentrifugieren wurde der klare Oberstand abpipettiert, das Sediment verworfen. 0,5 ml des Extraktes wurden mit 6 ml Nthylenglycolmono~ithyliither und 10 ml Toluol, das 6 g PPO/1 enthielt, vermischt und auf den Radioaktivit~itsgehait in einem Fliissigkeitsszintillationszfihler der Firma Packard gepriift. Der DNS-Gehalt wurde mit Hilfe der Diphenylaminreaktion nach Dische [2] durch Extinktionsmessung bei 600 nm bestimmt. Als MaB der spezifischen Aktivit~it der DNS wurden die mittels externem Standard korrigierten Impulszahlen/Min. auf die Extinktion bezogen.

Ergebnisse A m e t h o p t e r i n h e m m t den a H - D e s o x y u r i d i n e i n b a u . Diese H e m m w i r k u n g n i m m t mit der A m e t h o p t e r i n k o n z e n t r a t i o n u n d der E i n w i r k z e i t zu (Abb. 1). D i e V e r m i n d e r u n g der D N S - S y n t h e s e g e s c h w i n d i g k e i t d u r c h T h y m i d i n p h o s p h a t m a n g e l blieb bei diesem V e r s u c h unberiicksichtigt. D e r E i n b a u z u w a c h s des 14C-Thymidins u n d des a H - D e s o x y a d e n o s i n s mit der I n k u b a t i o n s z e i t w u r d e mit u n d o h n e A m e t h o p t e r i n gemessen. D i e 14CT h y m i d i n k o n z e n t r a t i o n im I n k u b a t i o n s m e d i u m b e t r u g 10 -s o d e r 10-4Mol/1. Alle kalten u n d r a d i o a k t i v e n S u b s t a n z e n w a r e n in den eisgekiihlten Suspens i o n s p r o b e n bereits v o r d e m I n k u b a t i o n s b e g i n n enthalten. D i e I n k u b a t i o n w u r d e n a c h unterschiedlicher D a u e r beendet. D i e f o l g e n d e n E r g e b n i s s e sind der A b b . 2 zu e n t n e h m e n :

DNS-Synthesegeschwindigkeitin Knochenmarkzeilen

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. Der 14C-Thymidin-Einbauzuwachs/Zeit betritgt ohne Amethopterin be i 10-SMol Thymidin/1 70%, bei 10"4Mol Thymidin/1 83% des Einbauzuwachses/Zeit unter Amethopterin.

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60 Min.

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Abb. 1: Der EinfluB der Konzentration und der Einwirkzeit des Amethopterias auf den 3H-Desoxyuridineinbau. 2. Der llC-Thymidin- und aH-Desoxyadenosin-Einbauzuwachs/Zeit unter Amethopterin ist ffir 10-5Moi und 10-4Mol Thymidin/1 gleich groB. 3. Der aH-Desoxyadenosin-Einbauzuwachs/Zeit ist unter Amethopterin etwas gr6Ber als ohne Amethopterin. In einigen Suspensionsproben desselben Versuchs wurde der aH-Desoxyuridineinbau v o n d e r 12. bis zur 20. Inkubationsminute bei der Amethopterinkonzentration yon 1,3 • 10-4Mol/1 bestimmt. Er betrug 2,8% der Inkorporation ohne Amethopterin. Die dabei zu berficksichtigende Abnahme der DNSSynthesegeschwindigkeit infolge Thymidinphosphatmangels wurde grob fiber die verminderte aH-Desoxyadenosin-Inkorporation in Suspensionsproben, die Amethopterin, aber kein Thymidin enthielten, bestimmt. Auf eine ungest/Srte DNS-Synthese umgerechnet, betrug der aH-Desoxyuridineinbau dann unter Amethopterin etwa 5% der Kontrolle ohne Amethopterin. Der 14C-Thymidin-Einbauzuwachs bei 10-4Mol Thymid;n/1 wurde yon der 12. bis zur 25. Inkubationsminute in Medium 199 und inaktiviertem homolo-

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gem Serum bestimmt. Dabei ergab sich kein signifikanter Unterschied. Die Regressionen betrugen fiir Medium 199 = 23,17 • 0,88; fiir Serum = 23,89 _ 1,58.

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Abb. 2: Der Einbauzuwachs/Zeityon liC-Thymidin(-TdR) und aH-Desoxyadenosin(-AdR) mit und ohne Amethopterin. Die eisgekiihlten Zellsuspe•sionen in Medium 199 enthielten bei Inkubationsbeginn neben einigen nichtradioaktiven Verbindungen (s. Methodik) 10-5 bzw. 10 4Mo114C-Thymidin/1und 10 btCiaH-Desoxyadenosin.Nach unterschiedlichenZeiten wurde die Inkubation beendet. Abb. 3 zeigt den 14C-Thymidineinbau in den ersten 20 Min. der Inkubation bei steigenden Amethopterinkonzentrationen. Er bleibt fiber einen gr6Beren Konzentrationsbereich konstant. Der unter denselben Bedingungen in anderen Suspensionsproben bestimmte aH-Desoxyuridineinbau betr~gt - fiir eine ungest/Srte DNS-Synthese korrigiert - gleichbleibend etwa 5% der Inkorporation ohne Amethopterin. Diese 5%-Grenze lieg sich auch durch Amethopterinkonzentrationen nahe der L6slichkeitsgrenze nicht unterschreiten.

DNS-Synthesegeschwindigkeitin Knochenmarkzellen

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Arnethopterinkonzentrstion in 10 -4 Mol/l Abb. 3: Der EinfluB der Amethopterinkonzentration auf den 14C-Thymidineinbau. Bei Inkubationsbeginn enthielten die eisgekiihlten Zellsuspensionen in Medium 199 neben einigen nichtradioaktiven Substanzen 10 -SMol 14C-Thymidin/1.Die Inkubationszeit betrug 20 Min. Besprechung Der 14C-Thymidin-Einbauzuwachs/Zeit unter Amethopterin in Abb. 2 ist unter folgenden Bedingungen ein relatives MaB f/~r die DNS-SSmthesegeschwindigkeit: 1. Das Thymidinangebot aus dem Inkubationsmedium darf dieDNS-Synthesegeschwindigkeit nicht begrenzen. Diese M6glichkeit wurde ausgeschlossen durch den gleich groBen l~C-Thymidin- sowie aH-Desoxyadenosin-Einbauzuwachs/Zeit unter Amethopterin bei 10 -5 und 10-~Mol Thymidin/1 im lnkubationsmedium. Die durch Amethopterin bedingte Hemmung der Thymidylatbildung wird demnach tiber das angebotene Thymidin roll kompensiert. 2. Amethopterin darf die DNS-Synthese auch nicht auf andere Weise beeinflussen. Da der aH-Desoxyadenosin-Einbauzuwachs/Zeit unter Amethopterin etwas gr6Ber ist, wird seine Indikatorfunktion ftir die DNS-Synthesegeschwindigkeit unter diesen Bedingungen eingeschdtnkt. - Der gleichbleibende 14C-Thymidineinbau iiber einen gr6Beren Amethopterinkonzentrationsbereich (Abb. 3) l~Bt sich nur so erkl~iren: Entweder die DNSSynthese wird nicht gehemmt, oder zunehmende DNS-Synthesehemmung

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und wachsender Einbau von 14C-Thymidin halten sich gerade die Waage. Ein ansteigender *4C-Thymidineinbau mit der Amethopterinkonzentration kann aber nur durch eine zunehmende Hemmung der Desoxyuridylatmethylierung bedingt sein. Da die Hemmung der Methylgruppen-de-novoSynthese - gemessen durch den aH-Desoxyuridineinbau - w/ihrend des Plateaus unver~indert maximal ist, scheidet eine DNS-Synthesehemmung durch Amethopterin in diesem Konzentrationsbereich aus. 3. Thymidinphosphate, die vor der vollst~indigen Hemmung der Fols~iurereduktase gebildet wurden, mtissen den Thymidinphosphatpool vor der betrachteten Inkubationszeitspanne wieder verlassen haben. Als Indikator daftir diente der geradlinige Einbauzuwachs des l~C-Thymidins unter Amethopterin mit der Inkubationszeit. Solange sich der durch Methylierung gebildete Anteil des Thymidinphosphatpools verkleinert, mfiBte die spezifische Aktivit~it der Thymidinphosphate und damit die Steigung des 14C-Thymidin-Einbauzuwachses/Zeit wachsen. 4. Die Methylierung yon Desoxyuridylat muB vollst/indig blockiert sein. Die Methylierungshemmung wurde durch den aH-Desoxyuridineinbau unter Amethopterin gemessen. Verglichen mit der Kontrolle ohne Amethopterin betrug er unter 1,3 • 10-4Mol Amethopterin/1 5%. Selbst mit Amethopterinkonzentrationen, die um Zehnerpotenzen h6her lagen, konnte eine 95proz. aH-Desoxyuridin-Einbauhemmung nicht tiberschritten werden. Der Verdacht liegt nahe, dab die restlichen 5% in die RNS eingebaut wurden. Die vergleichende Bestimmung der DNS-Synthesegeschwindigkeit fiber die Inkorporation radioaktiv markierten Thymidins unter Amethopterin erscheint also mSglich. Aus dem Vergleich des laC-Thymidin-Einbauzuwachses/Zeit mit und ohne Amethopterin l~if3t sich die Beteiligung von Desoxyuridylat an der Bildung yon Thymidinmonophosphat berechnen. Sie betdigt bei 10-5Mol Thymidin/1 im Inkubationsmedium 30%, bei 10-4Mol/i etwa 17% der GesamtV,

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MI= Markierungsindex Abb. 4: Die Berechnung einer relativen Mal3zahl der DNS-Synthesezeit (Ts) urld der Generationszeit (TG) aus dem 14C-Thymidin-Einbauzuwachs/Zeit (tanc~) im proliferationskinetischen Flief3gleichgewicht.

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produktion. Das stimmt mit Ergebnissen yon Cooper, Perry und Breitman [1], die an menschlichen Leuk~imiezellen gewonnen wurden, gut fiberein. Sofern homogene Zellpopulationen verglichen werden sollen, empfiehlt es sich, den Einbauzuwachs radioaktiven Thymidins pro Zeit unter Amethopterin durch Flfissigkeitsszintillation zu bestimmen. Da ein evtl. unterschiedlicher Anteil DNS-synthetisierender Zellen dabei unberficksichtigt bleibt, mfiBte zur Bestimmung einer relativen Magzahl der DNS-Synthesegeschwindigkeit auBerdem der all-Index autoradiographisch bestimmt werden. Zur Korrektur k6nnte man die gemessene Regression einfach durch den all-Index teilen, fiber die korrigierte Steigung lal3t sich bei Zellpopulationen in proliferationskinetischem Fliel3gleichgewicht eine vergleichbare Mal3zahl der Generationszeit bestimmen (Abb. 4). Dabei f~llt der Markierungsindex heraus. Der Kehrwert der unkorrigierten Steigung ist also ein MaBstab der Generationszeit und die unkorrigierte Regression selbst, d. h. der szintillatorisch bestimmte Thymidin-Einbauzuwachs/Zeit, ein vergleichbares MaB der Proliferationsgeschwindigkeit im Steady-state-Wachstum. - U m genauere Aussagen fiber Ver/inderungen der Proliferationsgeschwindigkeit einzelner Zellarten im Knochenmark zu machen, kann unter Amethopterin die Zunahme der mittleren Silberkornzahl mit der Inkubationszeit als vergleichbares MaB der DNSSynthesegeschwindigkeit durch Einzelzellautoradiographie bestimmt werden. Unbeantwortet bleibt die Frage, ob die DNS-Synthesegeschwindigkeit in vitro mit derjenigen in vivo identisch ist. Aus Untersuchungen yon Helpap und Maurer [6] wissen wir lediglich, dab in vitro nach der Gewebsentnahme dieselben Zellen DNS synthetisieren wie in vivo. In dieser Arbeit lieB sich kein Unterschied in der DNS-Synthesegeschwindigkeit in Abhangigkeit davon nachweisen, ob die Knochenmarkzellen in Medium 199 oder inaktiviertem homologem Serum suspendiert wurden. Aul3erdem bleibt die DNS-Synthesegeschwindigkeit in Medium 199 fiber mindestens 40 Min. unver~ndert, wie der bis dahin gemessene geradlinige laC-Thymidin-Einbauzuwachs/Zeit demonstriert. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dab die GrSBe der DNS-Synthesegeschwindigkeit zumindest yon den Bedingungen der Inkubation weitgehend unabh~ngig ist. Da es im fibrigen hier nur auf vergleichende Messungen proliferationskinetischer Parameter und nicht auf Absolutwerte ankommt, scheint es erlaubt, sie in vitro zu bestimmen. Zusammenfassung Am Modell des Rattenknochenmarks wird ein neues Verfahren entwickelt, die DNS-Synthesegeschwindigkeit in vitro vergleichend zu messen. Dazu wird der 14C-Thymidin-Einbauzuwachs mit der Inkubationszeit in die DNS suspendierter Zellen durch Flfissigkeitsszintillation bestimmt. Das dem Inkubationsmedium zugesetzte Amethopterin in einer Konzentration yon 1,3 • 10-45Iol/i ist in der Lage, die Bildung yon Thymidylat durch Methylierung zu verhindern. Die Knochenmarkzellen kSnnen dann ihren Bedarf an DNS-Thymidin nur aus dem exogenen 14C-Thymidin decken. Eine 14C-Thymidinkonzentration ab 10-5Mol/1 erlaubt eine ungest6rte DNS-Synthese.

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Die so gemessene relative MaBzahl der DNS-Synthesegeschwindigkeit ist unabh~ngig davon, ob die Zellen in Medium 199 oder in Rattenserum suspendiert werden. Durch Vergleich der 14C-Thymidininkorporation mit und ohne Amethopterin im Inkubationsmedium wird die Beteiligung der Methylierung an der Thymidylatbildung bestimmt. Sie betr~gt bei einer Thymidinkonzentration von 10-SMol/1 30%, yon 10-4Mol/1 17%. Summary With bone marrow from rats as a model, a new method is evolved for relative measurements of the DNA-synthesis rate in vitro. For that purpose the increase of the l~C-thymidine incorporation with the labelling period into the D N A of suspended cells is determined by means of liquid scintillation counting. Amethopterin added to the incubation medium in a final concentration of 1.3 • 10-4moles/l is able to block the formation of thymidylate by methylation. On these terms, bone marrow cells can cover their requirement of DNA-thymidine from exogenous 14C-thymidine only. A concentration of 10-Smoles 14C-thymidine/1 makes an undisturbed DNA-synthesis possible. Suspension of the cells in medium 199 or rat serum does not influence the DNA-synthesis rate measured under these conditions. By comparing the 14Cthymidine incorporation with and without amethopterin in the incubation medium, the extent of participation of methylation for thymidylate formation is estimated. With a thymidine concentration of 10-Smoles/1 it amounts to 30~0, of 10-4moles/1 to 17~ . Lileratur: 1 Cooper, R. A., S. Perry and T. R. Breitman: Cancer Res. 26, 2267 (1966). - - 2 Dische, Z.: Mikrochemie 3, 4 (1930). - - 3 Fliedner, T. M., E. P. Cronkite u n d V. P. Bond: Sehweiz. med. Wschr. 89, 1061 (1959). - 4 Fliedner, T. M., E. P. Cronkite und V. P. Bond: Folia haemat. 6, 210 (1961). - - 5 Gavosto, F., A. Pileri, C. Baehi and L. Pegor~tro: Nature 203, (London) 92 (1964). - - 6 ttelpap, B. u n d W. Maurer: XII. Symposion der Geselischaft fiir Histochemie, Gent (Belgie, n), 2 2 . - - 2 6 . 9 . 1967. - - 7 Lala, P. K., M. A. Maloney and H. M. Pate: Exp. Cell Res. 38, 626 (1965). - - 8 Mauer, A. M. and V. Fisher: Nature (London) 197, 574 (1963). - - 9 Mauri, C.: Folia haemat. 6, 239 (1961). - - 10 Schneider, W. C.: J. Biol. Chem. 161, 293 (1945). Anschr. d. Verff.: W. Brinkmann, Dr. P. DSrmer, Dr. P. Muschalik, Inst. f. H~matologie, 8 Milnchen 15, LandwehrstraBe 61.