Virchows Arch. Abt. B Zellpath. 2, 62--73 (1969)

Prozentuale Beteiligung von exogenem Desoxycytidin an dcr Synthese von DNS-Cytosin und DNS-Thymin in HeLa-Zellen* D. MOLLER** Hygiene-Institut der UniversitAt Marburg, Marburg a. d. Lahn (Direktor: Prof. Dr. med. R. SIEGERT) Eingegangen am l l . Juli 1968

Percentage Participation o/ Exogenous Desoxyeytidine in the Synthesis o/ DNACytosine and DNA-Thymine in HeLa-Cells Summary. Autoradiographic experiments with radioactive desoxycytidine in HeLa-cells are described. The ratio of the utilization for DNA-cytosine and DNA-thymine was evaluated. Moreover, the percentage participation of the applied exogenous desoxycytidine in the synthesis of DNA-cytosine and DNA-thymine was measured. The HeLa-cells were cultured in Eagle's medium, supplemented with 10% calf serum, 0.5% lactalbumin-hydrolysate and antibiotics. The experiments with the radioactive precursors were carried out one day after the inoculation in Leighton tubes with coverslips, i.e. in the exponential growth phase. When using radioactive precursors, the medium was replaced without calf serum and lactalbumin-hydrolysate. The cells were incubated in medium containing 3H-CdR(G), CdR(5-T) respectively and TdlZ (methyl-T) for 60 minutes. The precursors were used at a concentration of 0.0002 tzMol/ml. Before autoradiographs were prepared, some of the coverslips were incubated in RNase. In the autoradiographs the mean grain number per marked nucleus and the percentage of the labeled nuclei were measured and the mean grain number per nucleus (both no-marked and marked) was calculated. 9 By use of two different forms of labeled aH-CdR it was possible to calculate t h e ratio of its utilization for DNA-cytosine and DNA-thymine from the mean grain number per nucleus. By use of aH-CdR(G) DNA-cytosine and DNA-thymine were labeled, with CdR-(5-T) only DNA-cytosine was labeled. In these experiments with desoxycytidine its utilizatioh for DNAcytosine and DNA-thymine was in the ratio 50.5:49.5. The amount of TdR utilized for DNA is greater than that of CdR utilized for both DNA-cytosin and DNA-thymine {factor 8.7). The percentage participation of the exogenous precursors in the synthesis of DNA was calculated from the mean number of grains. For this reason the ratio disintegrations: silver grain was evaluated. The calculation was carried out by determining the absolute number of silver grains in the autoradiographs of HeLa-cells on coverslips after aH-TdR incubation and by determinating radioactive disintegrations in the same materials after combustion. The ratio of fl-disintegrations/silver grain is 9.83 : 1 in the area of the nucleus in fixed HeLacells grown on coverslips. Under these conditions in this area the mass per cm ~ is 0.12 mg. The calculations of the percentage participation of the precursors were tested on the formation of an S-phase of 8.3 hr. with 1.08 • 10-11g DNA newly synthesized in this phase and the base ratio of the DNA of the human thymus. At the concentration of 0.0002 ~zMol/ml the percentage participation of exogenously applied CdR in newly synthesized CdR of DNA is 0.616%, in newly synthesized TdR it is 0.40%. Exogenous TdR takes a part of 6.69% in TdR of synthesized DNA. * Die Arbeit lag der Medizinischen Fakult~t der Universit~t Marburg a. d. Lahn als ein Teil einer Habilitationsschrift vor. ** Mit Unterstiitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft.

Prozentuale Beteiligung von exogenem Desoxycytidin in HeL~-Zellen

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The percentage participation of the precursors in the synthesis of DNA depends on the concentration of the CdR. From curves of CdR incorporation with increasing amounts of precursors in the medium the percentage participation was calculated for concentrations between 0.0045 and 4.5 [zg/ml.

Zusammen/assung. Es wurden Versuche beschrieben, die dazu dienten, erstens das Verh~ltnis zu bestiminen, in dem CdR Iiir DNS-Cytosin und DNS-Thymin utilisiert wird, und zweitens die prozentuale Beteiligung yon exogenem CdR an der Synthese von DNS-Cytosin und D~S-Thymin bei HeLa-Zellen zu ermitteln. HeLa-Zellen wurden in Medium inkubiert, das 3H-CdR(G), CdR-(5-T) und TdR-(methyl-T) in einer Konzentration von 0,0002 ~zMol/ml enthielt. In Autoradiogrammen mit RNase behandelter Pr~parate wurde die Silberkornzahl fiber den markierten Kernen und der Prozentsatz der markierten Kerne bestimmt. Durch Verwendung von aH-CdR verschiedener Markierungsformen konnte das Verh~ltnis berechnet werden, in dem Cdl~ fiir DNS-Cytosin und DNS-Thymin utilisiert wird; es betr~gt 50,5:49,5. TdR wird in stiirkerem MaBe als CdR ffir die DNS-Synthese utilisiert; Faktor 8,7. Absolute Werte fiber die prozentuale Beteiligung der Vorl~ufer wurden aus den Silberkornzahlen berechnet. Das geschah nach Bestimmung des Selbstabsorptionskoeffizienten, der bei einer Massenbelegung yon 0,12 mg/cm2 im Bereich der Zellkerne 0,102 betr~gt. Den Berechnungen wurde eine S-Phasen-Dauer von 8,3 h und die w~hrend dieser Zeit neugebildete DNS-Menge zugrunde gelegt. Danach betr~gt die Beteiligung yon exogenem CdR an synthetisiertem CdR der DNS 0,616%, an synthetisiertem TdR der DNS 0,40%. TdR ist mit 6,69% an synthetisiertem TdR der DNS beteiligt. Die Beteiligung der Vorl~ufer an der DNS-Synthese ist von deren Konzentration abh~ingig, was Untersuchnngen mit Cdt~ (G) best~tigen. Aus relativen Kurven der CdR-Inkorporation f (konz.) wurde die prozentuale Beteiligung bei verschiedenen Konzentrationen zwischen 0,0045 und 4,5 berechnet. Von den beiden Pyrimidin-Desoxyribonucleosiden Thymidin (TdR) und Desoxycytidin (CdR) wurde bisher insbesondere dem TdR Aufmerksamkeit geschenkt, das sich als ein spezifischer Vorl~ufer der DNS erwiesen hatte [1]. Radioaktiv-markiertes TdR wurde fiir zahlreiche Untersuchungen des DNSStoffwechsels herangezogen. Im Mittelpunkt stand dabei seine Anwendung in Verbindung mit der autoradiographisehen Technik zur Bestimmung der Dauer des Generationseyclus und seiner Teilphasen [11, 24--26]. Der Abbauweg dieses Vorli~ufers wurde durch Untersuchungen mit verschiedenen Ze|larten aufgekl~rt [4, 9, 13, 16, 17, 32]. Besonderes Augenmerk wurde in letzter Zeit auf die prozentuale Beteiligung yon exogenem TdR an der Synthese von DNSThymin gerichtet [13, 30]. Das CdR kann im Gegensatz z u dem TdR nicht als spezifischer Vorl~ufer der DNS gelten. Erste Untersuchungen mit 15N-CdR an Ratten [28] wiesen zwar darauf hin, dai3 es nur in die DNS eingebaut wird, doeh ergaben Untersuchungen an HeLa-Zellen aueh eine Betefligung an der RNS-Synthese [20, 22]. In die DNS wird es nicht allein als DNS-Cytosin, sondern ebenso als DNSThymin eingebaut [15, 22, 27, 28]. Uber das Ausmai~ der Verwertung des exogenen CdR ffir die DNS-Synthese liegen bisher keine Untersuchungen vor. I n dieser Arbeit wird berichtet fiber autoradiographische Versuche mit aHCdR zwei verschiedener Markierungsformen sowie mit aH-TdR. Die Versuche wurden an HeLa-Zellen vorgenommen, yon denen die ffir diese Berechnungen erforderliehen GrS~en, DNS-Gehalt sowie die Dauer der DNS-Synthesephase bekannt siad [21]. Es wurde das Verhiiltnis ermittelt, in dem CdR fiir DNSCytosin und DNS-Thymin verwertet wird sowie die prozentuale Beteiligung des exogenen CdR an der Synthese von DNS-Cytosin und DNS-Thymin bestimmt.

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D. MffLLER: Yersuehe und Methodisches Zellkulturen. Die Zfichtung der HeLa-Zellen erfolgte in Eagles-Basal-Medium,

das 0,5% Lactalbuminhydrolysat (LAH), 10% K~lberserum sowie Penicillin (104 E/ml) und Streptomycin (100~zg/ml) enthiclt. W/ihrend der Inkubation dcr radioaktiv-markicrten Vorl/~ufer wurdc Medium ohne LAH und K/~lberserum verwendet (Medienzusammensetzung s. [21]). Die Zellen wurden stets in einem 3 4 Tage-Cyclus neu ausges/it (5,0--6,5 x l04 Zellen/ml ; 100 ml/Roux-Flasche). Radioaktive Inkubation. Es wurde CdR-5-T (8300 mC/mMol) und TdR (methyl-T) (13000 mC/mMol) yon The Radiochemical Centre, Amersham, England, sowie aH-CdR-(G) (991 mC/mMol) von New England Nuclear-Corporation, Boston Mass., USA, verwendet. In einigen F/illen erfolgte eine Verdfinnung der 3H-markierten Vorl/~ufer durch Zugabe yon nichtmarkierten Substanzen (SigmaChemical-Company, St. Louis, Missouri, USA). Ffir die autoradiographischen Untersuchungen wurdcn Kulturen auf Deckgli~sern (10 x 30 mm) in LeightonR6hrchen angelegt (1,5 ml Medium mit 2 x 105 Zellen/ml). Ffir direkte Messungen erfolgte die Aussaat in Probefl/ischchen eines Flfissigkeits-Scintillationsz/ihlers. Am Tage nach der Aussaat, bei einem dichten, noch nicht geschlossenen Zellrasen, land die Inkubation start. Bei Versuchsbeginn und nach beendeter Inkubation erfolgte eine vorsichtige und rasche Waschung der Kulturen mit Hanks-,,BasalSalt-Solution". W/~hrend der Inkubation wurden die Zellen in einer Atmosph/ire mit 5% CO 2 gehalten. Die Fixierung erfolgte mit Carnoyscher Flfissigkeit. Herstellung und Auswertung der Autoradiogramme. Die den fixierten Zellrasen tragenden Deckgl~,ser wurden auf Objekttr/iger gekittet und gewaschen (Trichloressigsiiure-L6sung 5%ig bei 20 ~ C; W/isserung 1/2 h; L6sung des inaktiven Vor1/~ufers, 0,5 mg/ml bei 20 ~ C, 3 h ; W/isserung 1/~ h). In einigen F/~llen folgte eine Inkubation in RNase- bzw. PufferlSsung (RNase-A, Serva-Entwicklungslabor, Heidelberg, 5 mg/100 ml NaC1-Phosphat-Puffer, pH 7,3, 20 h, 37 ~ C) und abermals ffir 20 mia Waschung in Trichloressigs/iure-LSsung. Autoradiogramme wurden hergestellt mit Stripping-Film AR 10, Kodak, London. Die Expositionszeiten lagen zwischen 2 und 34 Tagen. Die Nachfiirbung geschah mit H/imatoxylinEosin. Ffir die Auswertung wurden pro MeSpunkt 5 Pr/iparate herangezogen. Die Bestimmung der Silberkornzahl/markiertem Kern (SkZ/mK) sowie des Prozentsatzes der markierten Kerne erfolgte mit Hilfe eines Planquadrates (80 x 80 be). Der Nulleffekt war gering und wurde berficksichtigt. Versuche a) Inkubation in Medien mit aH-CdR verschiedener Markierungs/ormen und all-TdR. Die

Zellen wurden 60 rain in Medium inkubiert, das aH-CdR-(G) bzw. CdR-(5-T) bzw. aH-TdR enthielt. In allen F/s betrug die aH-Aktivit~t 0,1 tzC/ml und die spezifische Aktivit~t 500 mC/mMol. Bei den verwendeten Vorl~ufern lagen demnaeh/~quimolare Konzentrationen vor. Ein Tell der Pr~parate wurde vor der Herstellung der Autoradiogramme mit RNase behandelt. Bestimmt wurde die SkZ/mK dutch Ausz~hlungvon jeweilsmindestens 1000 Silberk6rnern in einem Pr~parat. Zur Ermittlung des Prozentsatzes markierter Kerne erfolgte pro Pr~parat die Ausz/ihlung yon mindestens 1000 Kernen (markiert und nicht markiert). b) Inkubation in Medien mit steigendeu Konzentrationen yon aH-CdR-(G). Zur Bestimmung relativer Gr6Ben der in Zellen eingebauten aH-Aktivit~t wurde folgendes Verfahren angewandt: Ffir die Fliissigkeitsszintillations-Messungenvorgesehene Probenfl~schchen aus Glas wurden ffir Zellkulturen pr/ipariert und in diese gleiche Volumina einer homogenen Zellsuspension eingeffillt (105 Zellen/ml Medium; 5,0ml/Gefi~13). Am Tage nach der Aussaat

Prozentuale Beteiligung von exogenem Desoxycytidin in HeLa-Zellen

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wurde der Zellrasen 60 min in Medien mit aH-CdR (G) inkubiert, wobei die Konzentrationen zwischen 0,0045 und 4,5 ~tg/ml Medium (Faktor 10) und die 3H-Aktivit~ten zwischen 0,02 und 5,0 ~zC/ml lagen. Nach beendeter Inkubation erfolgte die Fixierung und die weitere Preparation des Zellrasens wie bei der Herstellung der Autoradiogramme. AnschlieBend wurde eine RNase-Behandlung durchgeffihrt. Der Zellrasen wurde sodann mit SzintillatorLSsung fiberschichtet und die 3H-Aktivit~tsmessungen durchgefiihrt. Die SzintillatorLSsung hatte die Zusammensetzung: Toluol/PPO/POPOP (1000cm3:6,0g:0,1g). Die Messungen erfolgten mit dem Flfissigkeitsszintillations-Z~hler(Mark I, Modell, 6860, Nuclear Chicago, USA). Hierbei wurden keine absoluten Bestimmungen der 3H-Aktivit~it angestrebt, sondern nur relative GrSBen zwischen einzelnen MeBpunkten bestimmt. Die MeBergebnisse wurden daher nur als ,,cpm/Cuvette" angegeben. Vergleichende Messungen, bei denen der fixierte Zellrasen mit Hyaminhydroxid gelSst wurde, ergaben, dab bei der direkten Messung des fixierten Zellrasens eine MeBausbeute yon ca. 35 % erreicht wird. Pro Meflpunkt wurden 6 Pr~iparate hergestellt.

c) Bestimmung des VerMiltnisses der fl-Zer/~lle des Tritiums zur Silberkornzahl in den Autoradiogrammen. HeLa-Zellen wurden am Tage nach der Aussaat 60 min in 3H-TdRhaltigem Medium inkubiert (0,081 tzC/ml, spezifische Aktivitiit 13000 mC/mMol) und anschlieBend fixiert. Autoradiogramme wurden mit AlZ 10 ,,stripping-film" hergestellt. Die Expositionszeit der getrockneten Autoradiogramme betrug genau 48 h. Es wurde die SkZ/mK, der all-Index (Prozentsatz der markierten Kerne, bezogen auf alle ausgeziihlten Kerne) und die Zellzahl auf den 10 • 30 mm groBen Deckgl~sern ermittelt. Die Bestimmung der SkZ/mK erfolgte durch AuszAhlung yon jeweils mindestens 4000 SilberkSrnern fiber jeweils etwa 100Kernen in 5 Prgparaten. Der Nulleffekt ( < 2 % ) wurde in Abzug gebracht. Die mittlere Silberkornzahl lag bei etwa 44 SilberkSrnern pro markiertem Kern. Der 3H-Index wurde durch Ausz~hlung von jeweils 10000 Zellen/Priiparat ermittelt. Die Bestimmung der Zellzahl pro Deckglas geschah mit Hilfe eines Planquadrates (80 • 80 [z Seitenl~Lnge), das zun~chst auf den oberen linken Rand des Deckglases eingestellt wurde. Die nachfolgenden Ausz~hlungen erfolgten nach jeweiliger Verschiebung des Objektes auf dem Kreuztisch in der Senkrechten um etwa 0,25 mm in insgesamt 36 verschiedenen Positionen. Diese Ausz~hlungen wurden nach jeweiliger Verschiebung des Objektes um 0,5 mm in der Waagerechten 58mal wiederholt (insgesamt 36 • 58 = 2088 Positionen). Danach wurde das den Stripping-Film schiitzende Deckglas im Wasserbad abgelSst und der gesamte Zellrasen einsehlieBlich Stripping-Film von seiner Unterlage restlos abgeschabt, getrocknet und in 02-Atmosphere verbrannt. Die aH-Aktiviti~t des entstandenen Tritiumwassers wurde mit einem Flfissigkeits-Szintillationsz~hler (Mark I, Modell 6860, NuclearChicago, USA) gemessen. Die Szintillator-LSsung hatte folgende Zusammensetzung: Toluol/ _A.thanol/PPO/POPOP (2000 cm3:1260 cm3:20 g: 0,52 g). Der Quench-Effekt wurde berficksichtigt durch Anwendung der Kanalverh~ltnismethode bei Verwendung eines externen Standards. Die Zi~hlausbeute betrug 17--21%. Die ermittelten cpm lagen dabei zwischen 2560 und 4300. d) Bestimmung der Fldchengr6]3en von Kern- und Gesamtzellen. Die Messungen erfolgten in Anlehnung an die Methode von HAUG (1955) [7]. Hierfiir wurde ein in 20 • 20 Felder eingeteiltes Planquadrat verwendet, das bei Benutzung von 01immersion 100 • eine Seitenfl~iche von 80 tz aufweist. Ausgezi~hlt wurde die Zahl der Zellen pro Planquadrat sowie die Zahl der auf Caryoplasma und Cytoplasma liegenden Schnittpunkte. Insgesamt wurden 902 Quadrate mit 10103 Kernen ausgewertet. Ffir die Messungen wurden die Autoradiogramme verwendet, an denen das Verhiiltnis fl-Zerf~lle/Sk bestimmt wurde.

Ergebnisse Autoradiographische Untersuchungen mit 3H-Desoxycytidin verschiedener Markierungs/ormen sowie mit aH-Thymidin. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt. Sie w u r d e n gewonnen nach 60minfitiger I n k u b a t i o n der Zellen in Medien, welche die g e n a n n t e n Vorlhufer in ~quimolarer K o n z e n t r a t i o n enthielten (0,0002 ~M/ml). Die S i l b e r k o r n z a h l e n sind auf eine E x p o s i t i o n s z e i t y o n 1 Tag bezogen. Die S k Z / m K ist n a c h R N a s e - B e h a n d l u n g (Spalte 3) bei allen 5 VirchowsArch. Abt. B Zellpath.,Bd. 2

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D. MULLER:

Tabelle 1. VerMiltnisse der Silberkornzahlen und des Prozentsatzes markierter Kerne nach Inkubation mit 3H-CdR(G), 3H-CdR(5-T) und 3H-TdR bei unbehandelten und mit RNase behandelten PrSparaten

(1) Desoxyribonukleosid

aH-Cdl% (G)

(2) SkZ/mK

(3)

(4) (5) % markierter Kerne

(6) SkZ/Kern

(7)

keine RNasekeine RNasekeine RNaseRNaseBehandlung RNaseBehandlung RNaseBehandBehandlung Behandlung Behandlung lung a

1,67 (• 0,064 3H-CdR (5-T) 0,910 (• 3H-TdR13,5 (methyl-T) (•

1,30 (• 0,701 (• 11,3 (•

48,3 (-- 1 , 7 ) 49,0 (• 47,7 (•

47,4 (• 46,1 (• 47,5 (•

0,805

0,716

0,446

0,375

6,44

(6,44)

SkZ/mK--mittlere Silberkornzahl fiber den markierten Kernen, umgerechnet auf eine Expositionszeit von 1 Tag. SkZ/Kern = mittlere Silberkornzahl fiber allen Kernen, berechnet aus SkZ/mK und Prozent der markierten Kerne. In Klammern = Standardabweichung. a Die SkZ/Kern nach der RNase-Behandlung bei aH-CdR(G) und zH-CdR(5-T) wurde berechnet mit dem korrigierten Wert yon SkZ/mK, entsprechend dem aH-DNS-Aktiviti~tsverlust yon 16,0% bei 3H-TdR-Pr~tparaten nach RNase-Behandlung. 3 Vorl/~ufern, insbesondere nach aH-CdR-Inkubation gegenfiber der SkZ/mK bei unbehandelten Pr/iparaten (Spalte 2) reduziert. Der Prozentsatz der markierten Kerne zeigt nach der RNase-Behandlung (Spalte 5) gegenfiber den an unbehandelten Pr~paraten gewonnenen Ergebnissen (Spalte4) eine sichtbare Verminderung nur nach 3H-CdR-Inkubation. Da Unterschiede im Prozentsatz der markierten Kerne einerseits nach Verabreichung der verschiedenen Vorliiufer und andererseits bei den Pritparaten ohne und nach RNase-Behandlung bestehen, k6nnen aus den Ergebnissen SkZ/mK nicht unmittelbar Vergleiche hinsichtlich der Menge der inkorporierten 3H-Aktivitiiten angestellt werden. Um vergleichbare Werte zu erhalten, wurde daher aus der SkZ/mK und dem Prozentsatz der markierten Kerne die mittlere Silberkornzahl fiber allen (markierten und nichtmarkierten) Kernen berechnet, die ,,SkZ/ Kern" (Spalte 6 ~- 7) SkZ/mK • Prozentsatz mark. Kerne SkZ/Kern ---100 Nach der RNase-Behandlung und bei paralleler Inkubation in Pufferl6sung zeigte sich eine Verminderung der Sflberkornzahl. Bei der Berechnung der SkZ/ Kern nach RNase-Behandlung (Spalte 7) wurde daher der 3H-DNS-Aktivit~tsverlust beriicksichtigt. Die Inkorporation des aH-CdR-(G) als Funktion der Konzentration. Abb. 1 zeigt die Mel~ergebnisse als cpm/Cuvette bei verschiedenen Konzentrationen des 3H-CdR-(G) zwischen 0,0045 und 4,5 ~g/ml Medium (Faktor 10). Jeder Punkt stellt das Mel3ergebnis eines Pri~parates dar. Die cpm/Cuvette sind bezogen auf die einheitliche spezifische Aktivit~t von 1000 mC/mMol bei allen Konzentrationen. Bei der angewandten Preparations- und Mel~technik stellen die cpm/

Prozentuale Beteiligung von exogenem Desoxycytidin in HeLa-Zellen

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Cuvette nur relative GrSi~endar. Sie geben, zueinander ins Verhiiltnis gesetzt, Auskunft fiber die Inkorporation~verh~ltnisse bei verschiedenen Konzentrationen. Nach RNase-Behandlung repr~sentieren sie die Inkorporation des Vorli~ufers in die DNS. cpm Kuvette

105 -:_Z

/ / / 104

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/ug Desoxycyttdtn/ml Medium

Abb. l. ,,cpm/Cuvette" als Funktion der Konzentration des 3H-CdR (G) im Medium. Einstfindige Inkubation yon HeLa-Zellen in Medien mit steigenden Konzentrationen von 3H-CdR (G), 0,0045 ~g bis 4,5 ~zg/ml Medium (Faktor 10). cpm/Cuvette bezogen auf eine einheitliche spezifische Aktivit~t yon 1000 mC/mMol

Die unterbrochene Linie in Abb. 1 stellt eine lineare Beziehung zwischen der inkorporierten Menge des Vorl~ufers und dessen Konzentration im Medium dar. Bestimmung des Verhdltnisses der Zahl der fl-Zer/dlle des Tritiums zur Silberkornzahl. Es wurde die Zahl der fl-Zerfiille des Tritiums ermittelt, die erforderlich ist, im Autoradiogramm von HeLa-Deckglaskulturen bei Verwendung von S t r i p p i n g - F i l m A R l0 ein Silberkorn h e r v o r z u r u f e n (fl-Zerfs Die MeltTabelle 2. Verh~ltnis der Zahl der fl-Zer/alle zur Zahl der erzeugten Silberk6rner, ermittelt Autoradiogrammen mit AR-lO-,,stripping-/ilm" Pr~parat Nr.

Zellen Deckglas ( • 105)

SkZ mK

8H-Index

1 2 3 4 5

3,03 3.58 2,21 2,10 3,02

43,5 42,5 45,1 43,7 43,2

45,9 48,7 46,0 44,8 47,4

dpm (• 104)

2,16 2,53 1.47 1,45 2,06

a~

Zerf~lle Silberkorn

10,3 9,86 9,23 10,2 9,62

Mittelwert : 9,83 (S = ~ 0,422)

ergebnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt. Durch Ausz~hlungen wurde die Gesamtzahl der Silberk6rner/Pri~parat bestimmt. Das geschah durch Bereehnung der Silberkornzahl/Kern aus der SkZ/mK urLd dem all-Index. Aus der Zell5*

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D. MuLLER:

zahl/Deckglas und der SkZ/Kern wurde die Silberkornzahl/Deckglas berechnet. Sie wurde in das Verh~ltnis gesetzt zur Zahl der fl-Zerf/~lle, die in dem gleichen Pr~parat nach Verbrennung gemessen wurde. Danach sind 9,83 ( ~ 0,422) fl-Zerf/~lle erforderlich, um ein Silberkorn zu erzeugen.

Bestimmung der Fliichenausdehnung der Kerne und der Gesamtzellen. An Deckglaskulturen von HeLa-Zellen wurde die durchschnittliche Ausbreitung der Kerne und der Gesamtzellen ermittelt. Die durchschnittliche Fl~chengr61~e betriigt beim Kern 182 ~2, bei der Gesamtzelle 439 ~t2. Diskussion Zur Bestimmung des VerMiltnisses der radioaktiven Zer[~ille des Tritiums zur Silberkornzahl. Um aus der Silberkornzahl im Autoradiogramm auf die in den Zellstrukturen enthaltene 3H-Aktivit/~t schliel~en zu k6nnen, mul3 die Gr5i~e der Selbstabsorption der aH-fl-Strahlung bekannt sein. Infolge der Selbstabsorption gelangt nur ein Bruchteil der fl-Teilchen in den aufgelegten Film. Die Gr5Be dieses, die Silberk6rner verursachenden Anteiles (Selbstabsorptionskoeffizient) [18] h~ugt yon den Massenverh/iltnissen der Zellstrukturen ab. Das Verh~ltnis der/?-Zerf/~lle/Sk wurde schon mehrfach untersucht [3, 8, 10, 12, 18, 31], doch sind die Ergebnisse nicht ohne weiteres auf das eigene Untersuchungsmaterial anwendbar. Unter den gegebenen Voraussetzungen (Deckglaskulturen yon HeLa-Zellen. AR-10-Stripping-Film) betr~gt der Selbstabsorptionskoeffizient 0,102: es sind 9,83 (s----• 0,422) fl-Zerf~lle zur Erzeugung eines Silberkornes notwendig. Dieser Wert entspricht am ehesten dem yon WIMBERet al. [31] mit AR-10-Stripping-Film bei einem ,,cell squash" von Tradescantia palludosa ermittelten Verhiiltnis yon 10,9:1. Aus dem Trockengewicht der HeLa-Zellkerne (--~ 8,10 • 10-rig) und der Gesamtzellen (7,62 • 10-1~ sowie aus der mittleren Fli~che des Kernes (182 ~2) und der Gesamtzelle (439 ~ ) ist die durchschnittliche Massenbelegung im Bereich des Kernes abzuleiten. Bezogen auf eine F1/~che von 1 cm 2 betr/~gt das Gewicht des Kernes einschliel~lich einer fiber diesem liegenden Cytoplasmaschicht 0,12 mg. Das Verhi~Itnis der beiden ermittelten Gr6~en Selbstabsorptionskoeffizient ( = 0,102) und Massenbelegung pro cm 2 (~--0,12 mg) steht in guter Ubereinstimmung mit den Ergebnissen yon MAUI~ER und PRIMBSCIt [18], die sich, unabh~ngig von den Massenverhs spezieller Zellstrukturen, auf die Masse/cm 2 und der hiervoa abhitngigen Selbstabsorption beziehen.

Zur Verwendung von Desoxycytidin mit unterschiedlicher 3H-Markierung. Es wurden 2 Markierungsformen des CdR verwendet: 1. CdR-(5-T): Bei diesem ist H in der Position 5 im Pyrimidin-Ring durch Tritium ersetzt. 2. aH-CdR (G): Bei diesem findet man Tritium anstelle von H in ann~hernd gleichm~i3iger Verteilung in neun verschiedenen Positionen, darunter in Position 5 im Pyrimidinring. Da CdR nicht nur ffir DNS-Cytosin, sondern auch ffir DNS-Thymin verwertet wird [20, 23], ist bei der Inkorporation gleicher Mengen von CdR beider Markierungsformen demnach die Inkorporation unterschiedlicher Mengen yon aH-Aktivit~t in die DNS zu erwarten. Die gewonnenen Ergebnisse (s. Tabelle 1) besti~tigen diese Erwartung.

Prozentuale Beteiligungyon exogenemDesoxycytidinin HeLa-Zellen

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Bei der Verwendung yon CdR-(5-T) rfihrt die gcmessene aH-Aktivitiit nur yon der aH-Aktiviti~t des DNS-Cytosins her. Der ffir DNS-Thymin utilisierte Anteil verliert seine aH-Markierung infolge der Methylierung. Bei Verwendung yon aH-CdR(G) dagegen ist sowohl das DNS-Cytosin als auch das DNS-Thymin 3H-markiert. Dabei bleibt zu berticksichtigen, dal~ die spezifische Aktivit/~t des aH-CdR (G) bei Utilisation als DNS-Thymin infolge der Methylierung um einen Bruchteil (1/0) reduziert wird. Eine Korrektur der gemessenen 3H-Aktivitiit bzw. der Silberkornzahlen nach Verwendung yon aH-CdR (G) ist mSglich; denn dutch die parallele Anwendung beider Markierungsformen k6nnen die auf die 3H-Aktivit~t des DNS-Cytosias und des DNS-Thymins zu beziehenden Silberkornzahlen berechnet werden. Die korrigierten Werte (Tabelle 1, Spalte 6 und 7) betragen demnach: SkZ/Kern ohne l~Nase-Behandlung gleich 0,85; SkZ/Kern nach RNase-Behandlung gleich 0,76. Zur Ent]ernung der aH-RNS-Aktivitiit. Die Verabreichung yon 3H-CdR an HeLa-Zellen ffihrt nicht nur zu einer aH-Markierung der DNS, sondern auch der RNS [20], wobei der ffir die RNS utilisierte Anteil mit steigender CdR-Konzentration zunimmt [23]. Das findet seinen Ausdruck nicht nur in einer Zunahme der SkZ, sondern auch in einem erh6hten Prozentsatz der markierten Kerne. Nach RNase-Behandlung der gleichen Pr~parate verbleibt ein Prozentsatz markierter Kerne, der dem 3H-Index nach aH-TdR-Inkubation entspricht [23]. Im vorliegenden Falle ffihrt die RNase-Behandlung zu der crwarteten Verminderung der SkZ bei den 3H-CdR-Priiparaten; jedoch war eine solche yon geringem Ausma[~ auch bei den 3H-TdR-Pr~paraten nach Inkubation in RNase sowie in Pufferl6sung feststellbar. Demnach mu[3 hier der Verlust eines geringen Anteiles yon aH-DNS-Aktivit~t angenommen werden, da 3H-TdR ausschliel~lich zu einer Markierung der DNS ffihrt [1]. Die Markierung lediglich der in S befindlichen Kerne spricht gegen eine Utilisation des atI-TdR ffir die RNS. Die Art der bei HeLa-Zellcn entstehenden Abbauprodukte des TdR [13] l~[3t die Verwertung ffir die RNS unm6glich erscheinen. Andererseits sind die angewandten Pri~parationsmethoden gecignet, das w~hrend der Inkubation in einem PhosphatPool gespeicherte, nicht in die DNS eingebaute aH-TdR zu entfernen [19]. Die Verminderung der SkZ/mK bei den 3H-TdR-Pr/iparaten unter den Bedingungen der RNase-Behandlung ist am ehesten zurfickzuffihren auf einen teilweisen Verlust der aH-DNS-Aktivit~t infolge einer Aktivierung der in nahezu allen Geweben nachgewiesenen DNasc [6, 5, 29]. Da bei den aH-CdR-Priiparaten nach RNaseBehandlung ein aH-DNS-Aktivit~tsverlust gleichen Ausmal]es anzunehmen ist, wurde die SkZ/Kern (Tabelle 1, Spalte 7) entsprechend dem aH-DNS-Aktivit~tsverlust bei den aH-TdR-Pr~paraten korrigiert. Die Utilisation des CdR /iir DNS-Cytosin und DNS-Thymin. Es war beabsichtigt, durch die parallele Anwendung yon 3H-CdR (G) sowie CdR-(5-T) das Verhi~ltnis zu ermitteln, in dem CdR ffir DNS-Cytosin und DNS-Thymin utilisiert wird. Hierzu werden die Werte yon SkZ/Kern nach RNase-Behandlung gegenfibergestellt. Die SkZ/Kern yon 0,76 bei 3H-CdR (G)-Priiparaten repr~sentiert das aH-markierte DNS-Cytosin und DNS-Thymin, die SkZ/Kern yon 0,375 bei CdR-(5-T)-Pr~paraten das 3H-markierte DNS-Cytosin. Diesen Werten ist zu entnehmen, dal] das CdR zu 50,5% ffir DNS-Cytosin und zu 49,5% ffir DNSThymin utilisiert wird. Dieses Ergcbnis best~tigt die Befunde biochemischer

70

D. MOLLER:

Untersuchungen am gleiehen Zellstamm, wonach CdR zu gleichen Anteilen ffir DNS-Cytosin und DNS-Thymin [22] verwertet wird. Ein weiteres Anliegen war es, durch die gleichzeitige Anwendung von ~H-TdR Aufschlu• darfiber zu erhalten, in welchem Ausmal3 das CdlZ im Vergleich zum TdR eingebaut wird. Es sollen daher die SkZ/Kern von ~H-TdR (6,44), von 3H-CdR (G) (0,76) und von 3H-CdR-(5-T) (0,375) gegenfibergestellt werden. Demnach ergibt sich folgendes Utilisationsverh~ltnis : 3H-TdR: 3H-CdR (G) : 3H-CdR-(5-T) ---- 1:0,115:0,058. Diese Ergebnisse zeigen, da[3 das TdR in wesentlich stiirkerem Mai~e (Faktor 8,7) ffir die DNS utilisiert wird. Die prozentuale Beteiligung yon exogenem Desoxycytidin an der DNS-Synthese. Bei Kenntnis des Verh~ltnisses/5-Zerf~lle/Silberkorn, bzw. des Selbstabsorptionskoeffizienten, kann aus den gemessenen Silberkornzahlen die Menge eines verabreichten Vorl~ufers errechnet werden, die w~hrend der Dauer der DNS-Synthese-Phase (S) inkorporiert wird. Die w~hrend S inkorporierte Menge eines Vorl~ufers (V) ist nach folgender Gleichung zu berechnen: Spezifische Aktivit~t

3H-Aktivit~t SkZ/mK • S mMol -- Selbstabsorptionskoeffizient • 1440 • V

(I)

Die Berechnung sehliei~t die Beziehung der/~-Zerf~lle/min aus der SkZ/mK (bei einer Expositionszeit yon einem Tag) ein. SkZ/mK dpm---- Selbstabsorptionskoeffizient • Minuten/Tag

(II)

Daraus ergibt sich: V ~- . . . . SkZ/mK . . • S • mMol Selbstabsorptionskoeffizient • 1440 • 3H-Aktivitat

(III)

Den Berechnungen wiihrend S inkorporierter Mengen der verabreichten Vorlgufer nach Ausdruck (III) liegen zugrunde: S = 8,3 h [21]; spezifische Aktivit~t (bei allen Vorliiufern) 500 mC/mMol. Im Falle 3H-CdR (G) erfolgte die Berechnung getrennt ffir die Anteile DNS-Cytosin und DNS-Thymin. Die ffir die DNSSynthese verwerteten Mengen des exogenen Vorl~ufers sind in Tabel]e 3, Spalte 4 dargestellt. 13ber die prozentuale Beteiligung von exogenem TdR an der DNS-Synthese lagen bisher nut ungef~hre Angaben vor [30]. Autoradiographische und chemische Untersuchungen arL HeLa-Zellen [14] zeigten eine v o n d e r Menge des Vorli~ufers abh~ngige Beteiligung an neugebildetem DNS-Thymin. So ergab sich bei einer Konzentration yon 0,505 ~g/ml eine Beteiligung von 18,7%. Untersuchungen fiber die Beteiligung von exogenem CdR an der DNS-Synthese wurden bisher nicht durehgefiihrt. Die prozentuale Beteiligung der exogenen Vorlgufer an der Gesamtmenge der w~hrend der DNS-Synthese-Phase (S) von den HeLa-Zellen neugebildeten Nucleoside ist bei Kenntnis der w~hrend S neugebildeten DNS-Menge zu berechnen. Diese betri~gt bei HeLa-Zellen 1,08 • 10-Zig [21]. In der Tabelle 3, Spalte 2, sind die Gewichtsanteile der Nucleoside an der neugebildeten DNS dargestellt. Sie wurden ermittelt anhand des BasenverhAltnisses des mensehlichen Thymus [2]. Die prozentuale Betefligung des exogenen CdR an DNS-Cytosin

Prozentuale Beteiligung von exogenem Desoxycytidin in HeLa-Zellen

71

betr/igt demnach 0,62%, an DNS-Thymin 0,40% (Tabelle 3, Spalte 5). Wesentlich gr56er ist mit 6,69% der Anteil des exogenen T d R an der Synthese von DNS-Thymin. Diese VerMltnisse gelten jedoch nur fiir die angewandten K o m zentrationen von 0,0002 ~xMol/ml. Tabelle 3. Anteil der verabreichten Vorliiu/er 3H-CdR(G), CdR(5-T) und aH-TdR an den neusynthetisierten Pyrimidinnucleosiden der DNS bei einer Vorliiu/erkonzentration ira Medium von 0,0002 ~tMol/ml

(1) Nucleosid

(2) Gewichtsanteil des Nucleosids an synthetisierter DNS-Menge ( • 10-1' g)

(3) Verabreichter Vorl~ufer

(4) Menge des fiir die DNS-Synthese verwerteten exogenen Vorl/iufers ( X 10- n g)

(5) Anteil des exogenen Nucleosids an synthetisiertem Nucleosid ( %)

CdR

0,157 0,157 0,249 0,249

CdR-(5-T) 3H-CdR-(G) aH-CdR-(G) ~H.TdR

0,000968 0,000968 0,000995 0,0166

0,616 0,616 0,400 6,69

TdR

50--

-

50

/

~

%

/

10-

,/ 0,01o,ool

10

-

/

c

/ // I

o,i

I

I

0,01

I

0,1

-

0,01

10

Ng ThymiOn bzw Desoxycytldm/ml Medium

Abb. 2. Prozentuale Beteiligung yon exogenem Desoxycytidin und Thymidin an der Synthese yon DNS-Cytosin und DNS-Thymin. Kurve A: Prozentuale Beteiligung von TdR an der Synthese von DNS-Thymin; Kurve B: Prozentuale Beteiligung von CdR an der Synthese von DNS-Cytosin; Kurve C: Prozentuale Beteiligung yon Cdl%an der Synthese von DNS-Thymin Die gleichzeitig und unter identischen Versuchsbedingungen bei Verwendung /iquimolarer Konzentrationen gewonnenen Ergebnisse gestatten es, den relativen Verlauf der Kurven, die bei Verwendung der entsprechenden Vorl/iufer als Funktion der Konzentration ermittelt wurden, auf die gewonnenen Me6punkte festzulegen. So konnte die prozentuale Beteiligung des exogenert CdR an der Synthese von DNS-Cytosin (Abb. 2, Kurve B) und von D N S - T h y m i n (Kurve C) aus dem Kurvenverlauf nach aH-CdR-(5-T)-Inkubation [23] und nach

72

D. MULLER:

3 H - C d R ( G ) - I n k u b a t i o n (Abb. 1) abgeleitet werden. Z u m Vergleich w u r d e die n a c h a u t o r a d i o g r a p h i s c h e n U n t e r s u c h u n g e n gewonnene K u r v e A nach 3 H - T d R I n k u b a t i o n [14] hinzugeffigt. D a n a c h ist ein sehr iihnlicher K u r v e n v e r l a u f ffir die p r o z e n t u a l e Beteiligung des T d R ( K u r v e A) u n d des C d R ( K u r v e B u n d C) a a der D N S - S y n t h e s e zu erkenaen. Die K u r v e n B u n d C (CdR-Beteiligung an D N S - C y t o s i n u n d D N S - T h y m i a ) weisen i m Bereich der niedrigeren Konzent r a t i o n e a einen weniger flachen Verlauf u ~ t e r 45 ~ auf als die K u r v e A (TdRBeteiligung a n D N S - T h y m i n ) . Die Gegeniiberstellung m a c h t zugleich die wesentlieh geringere U t i l i s a t i o n des C d R ffir die D N S i m Gegensatz z u m T d R deutlich : dieses V e r h a l t e n liegt d e m n a c h bei siimtlichen K o n z e n t r a t i o n e n vor.

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