Bekanntmachungen

Bundesinstitut fª gesundheitlichen Verbraucherschutzund Veterin~irmedizin

Reduzierung des Eintrags von Salmonellen durch Schlachtschweine in die Fleischgewinnung Das d~inische Modell des >,Fleischsaft-ELISAy Serologische Untersuchungen auf SalmonellaAntik6rper als Infektionsnachweis werden im internationalen Handel nicht akzeptiert [1]. Untersuchungen in D~.nemark [2] fª zu einer anderen Betracb.tungsweise: Bei experimentellen Infektionen von Schweinen mit Salmonella-Serovaren typhimurium und infantis wurde eine Ausscheidung der Erreger unmittelbar nach der Infektion bei 80 % der infizierten Tiere nachgewiesen. Dieser Anteil sank anschlief~end rapide ab und mª in intermittierender Ausscheidung. Eine Immunantwort wurde ab siebten Tag p. i. beobachtet. Insgesamt zeigten 97 % der experimentell infizierten Tiere serologisch positive Reaktionen, deren H6hepunkt 32 bis 37 Tage p.i. lag. Der Anteil der Reagenten sank anschlief~end langsam ab, lag aber am Tag 108 p. i. noch bei 67 %. Es wurde gefolgert, dat~ serologische Reaktionen zwar nicht zur individuellen Identifizierung von Salmonella infizierten Tieren, aber als ein Hinweis auf cine stattgehabte Infektion herangezogen werden k6nnen. Sofern die Herkunft der Schlachtschweine bekannt ist, k6nnen somit Rª schlª auf die Salmonella-Belastung in Herkunftsbestiinden gezogen werden.

Arbeitsanweisung zur Durchfª des Fleischsaft-ELISA Stand: April

1 9 9 8

1 Ger~ite Magnetrª pH-Meter - Kolbenhubpipetten (0,1-10 }al, 10-100 }al, 100-1000 }al) DIN/ISO 9001 8-Kanal Multistepper (50-200 lal) DIN/ISO 9001 Mehrkanalkolbenhubpipette (5-50 }al, 25200 }al) DIN/ISO 9001 Mikrotiterplatten-Photometer Mikrotiterplatten-Wascher Computer mit Reader-Software fª die Messung und Auswertung der ELISA-Platten P~zisionswaage - Kª 5~ • 3~ - Gefrierschrank -21 ~ • 3 ~ Mikrotiterplattenschª Kreisschª -

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G e b r a u c h s m a t e r i a l i e n

Als Konsequenz hieraus wurde der ,>Fleisch- - F96 POLYSORP N U N C - I M M U N O Plate saft-ELISA,, e~abliert. Untersuchungsma~erial ist eine Fleischprobe von ca. 10 g, vorzugsweise - Mikrotiterplatten (F-Form, 8 x 12 Cups) aus dem Zwerchfellpfeiler entnommen. Die - lyoph. STM/SCS-Mischantigen (LPS von S. typhimurium und S. choleraesuis), ZugeL Probe wird in einem fª diesen Zweck konzin. ~ 17c TierSG pierten Probengef~f~ eingefroren und an das Untersuchungsinstitut geschickt, wobei durch negatives und positive Kontrollseren (STM das Auftauen Fleischsaft freigesetzt wird. I, 2, 3, SCS 1, 2, 3) voto Schwein), Zugel. n. 17c TierSG Im ELISA wird LPS aus zwei Salmonella-SeroKonjugat: Kaninchen-anti-Schwein IG-PO, varen gemischt als Antigen eingesetzt. Die P 164, DAKO Auswahl der Antigene ergab sich aus der Hiiufigkeit des Auftretens bestimmter Serovaren - Latexhandschuhe bei Routine-Untersuchungen in D~inemark. Es Kunststoffpinzette stellte sich heraus, daB Satmonella typhimu- Magnetrª rium (0 : 1, 4, 5, 12) und Salmonella infantis (0 : 6, 7) als h~iufigste Vertreter von Salmonella- - Pipettenspitzen DIN/ISO 9001 Reagenzglasst~inder Serovaren nachgewiesen wurden. Anstelle von Salmonella infantis wurde sp~iter aus techniReagenzgl~iser schen Grª Salmonella choleraesuis (0 : 6, - Mef~pipetten DIN 12691, 12695, 12700 7) eingesetzt. Bei Untersuchungen in Deutschland war eine ~.hnliche Sequenz ira Auftreten - Mef~zylinder DIN 12680 von Salmonella-Serovaren zu beobachten, so - Erlenmeyerkolben D I N 12380, 12385, 12387 daf~ die d~inische Antigenkombination ª nommen werden konnte. - Bechergl3.ser DIN 12331 Nachfolgend ist der Ablauf des >,Fleischsaft- - Stehkolben DIN 12347, 12348 - feuchte Kammer ELISA,, ira Detail dargestetlt. -

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C h e m i k a l i e n

Natriumhydrogencarbonat p.A. NaHCO3 Natriumcarbonat wasserfreip.A. Na2CO~ Natriumchlorid p.A. NaCI Wasserstoffsupei'oxid p.A. 30 % H202 Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat reinst p.A. NaH2PO4 9 2 H 2 0 Di-Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat p.A. Na2HPO4 9 12 H 2 0 Zitronens~iure-Monohydrat krist, reinst C6H80 z 9 t-I20 Schwefels~iure 96 % reinst p.A. H2SO4 Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) p.A. OPD - 2 mg Tabletten, KEM-EN-TEC, Kopenhagen BSA: SIGMA ALBUMIN, BOVINE, Fraction V, A 7906 steriles Aqua bidest.

R e z e p t e

4.1 Karbonatpuffer Die Verdª252 fª das Antigen und den Btocking-Puffer ist Karbonatpuffer. Fª das Beschichten der Mikrotiterplatten mit dem Antigen wird dem Karbonatpuffer zus~itzlich noch 1 M NaCI zugesetzt. Zum Blocken der Platten wird der Karbonatpuffer ohne NaCI mit 1 % BSA versetzt. Herstellung des Karbonatpuffers 0,1 M, pH 9,6 NaHCO3 5,675 g Na2CO3 3,336 g Aqua bidest. 1000,0 mi Haltbarkeit des Karbonatpuffers nach Herstellung eine Woche bei 5 ~ • 3 ~ Fª die Antigenbeschichtung wird kurz vor Verwendung des Puffers NaCI hinzugegeben: NaC1 29,22 g Karbonatpuffer 500,0 ml Fª den Blocking-Puffer wird kurz vor Verwendung des Puffers das BSA hinzugegeben: BSA 5,O g Karbonatpuffer 500,0 ml

4.2 Phosphatpuffer mit Tween 20 (PBSTween), pH 7,4 a) Puffer zum Waschen der Platten b) Nar Zusatz von 0,5 % BSA Verdª puffer fª die Proben und das Konjugat Bundesgesundhbl. 8/98

Bekanntmachungen 4.2.1 PBS-Tween, pH 7,4 NaH2PO4 9 2 H20 0,39 g 1,95 g 3,90 g Na2HPO4 9 12 H20 2,68 g 13,40g 26,80 g NaCI 8,48 g 42,38 g 84,76 g Aqua bidest. 1000 mi 5000 mi 10 000 rol Tween 20 0,5 mi 2,5 ml 5,0 mi Haltbarkeit des PBS-Tween nach Herstellung eine Woche bei 5 ~ • 3 ~ 4.2.2 PBS-Tween mit 0,5 % BSA Dieser Puffer ist tS.glich frisch anzusetzen. 4.3 Zitratpuffer p H 5,0, zur Herstellung der Substrat-Chromogen-L6sung Zitronens~iure 9 H20 7,30 g Na2HPO4 ~ 12 H•O 23,88 g Aqua bidest. 1000,0 mi Haltbarkeit des Zitratpuffers nach Herstellung ein Monat bei 5 ~ • 3 ~ Herstellung sung:

der

Substrat-Chromogen-L6-

30 ruin vor der Verwendung werden vier OPD-Tabletten (~ 2 mg) zu 12 ml Zitratpuffer gegeben (Bitte nur mit Handschuhen und Ptastikpinzette abziihlen - giftig!). L6sen der Tabletten bei RT im Dunkeln. Unmittelbar vor Gebrauch werden zu den 12 ml OPD-L6sung noch 5 q 30 %iges H202 zugesetzt. 4.4 Stopl6sung 0,5 M H2S04 96 %iges H2SO4 Aqua bidest.

1,0 ml 35,0 ml

Hattbarkeit der Stopl6sung nach Herstellung eine Woche bei 22 ~ • 3 ~ 4.5 Kontrollseren und Antigen Die resuspendierten Kontrollseren k6nnen portioniert bei -21 ~ • 3 ~ fª einen Monat aufgehoben werden. Das resuspendierte Antigen kann bei 5 ~ • 3 ~ einen Monat gelagert werden. 5 Durchfª 5.1 Das Salmonella-Antigen wird in der angegebenen Gebrauchsverdª mit dem Karbonatpuffer-NaCl verdª Siimtliche Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden mit 100 q beschickt. Die Platten werden in einer feuchten Kammer fª 18 bis 24 Stunden bei 5 ~ • 3 ~ inkubiert. 5.2 Die Platten werden entleert und mit Aqua bidest, dreimal gewaschen. Anschlieigend Entleeren der Platten. 5.3 Zugabe von 200 pl Karbonatpuffer-BSA pro Vertiefung. Inkubation 15 min bei 22 ~ • 3 ~ 5.4 Die Platten werden entleert und mit PBSTween dreimal gewaschen. Anschlie~end Entleeren der Platten. 5.5 Testverdª Tween/BSA:

der Proben in PBS-

BundesgesundhbL 8/98

Testplatte: 75 lat PBS-Tween/BSA 25 pi vorverd. Probe aus Poolplatte 2 = 1:400 Fleischsaft Poolpatte: 130 q PBS-TweenlBSA 20 q Fleischsaft

= 1:7,5

Testplatte: 75 q PBS-Tween/BSA 25 }al vorverd. Probe aus Poolplatte = 1:30 In der Plattenanlage sind die Kolumnen 1 bis 10 fª den Doppelansatz der Proben vorzusehen, die Kolumnen 11 und 12 fª die Kontrollen. Es ist darauf zu achten, dafl die Poolplatte fª den Fleischsaft in den Kolumnen 11 und 12 die Kontrollseren in der Verdª von I:100 enthalten sollten. Auf der Testplatte fª den Fleischsaft-ELISA befinden sich am Ende die Kontrollseren in der Verdª 1:400 und die Fleischsaftproben in der Verdª 1:30. Inkubation fª eine Stunde bei 22 ~ • 3 ~ 5.6 Die Platten werden entleert und dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Anschlielgend Entleeren der Platten. 5.7 Zugabe von 100 q Konjugat in der Gebrauchsverdª pro Vertiefung. Inkubation eine Stunde bei 22 ~ • 3 ~ 5.8 Die Platten werden entleert und dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Anschliet~end Entleeren der Platten. 5.9 Zugabe von 100 q Chromogen-SubstratL6sung pro Vertiefung. Bei der Arbeit mit einem Multistepper k6nnen bis zu 20 Testplatten in einem Intervall von 15 Sekunden mit der Chromogen-Substrat-

L6sung beschickt werden. Inkubation bei bei 22 ~ + 3 ~ fª 7 min. 5.10 Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 501al Stopl6sung pro Vertiefung. Bei der Arbeit mit einem Multistepper k6nnen auch hier 20 Testplatten in einem Intervall von 15 Sekunden mit der Stopl6sung beschickt werden. 5.11 Messen der Platten in einem Photometer bei 492 nm und einer Referenzwellenliinge von 650 nm. M/Sglich sind als Mefgwellenl~ngen auch 490 nm und 495 nm, bzw. als Referenzwellenliinge 630 nm. 6 Berechnung 6.1 Die O. D.-Werte der positiven Kontrollen und der negativen Kontrollen werden zu den O.D.-Werten der Proben ª eine Regressionsgerade in Beziehung gesetzt. Die auf den Etiketten angegebenen Prozentwerte der Kontrollen getten hierbei als Standardwerte und Konzentrationsangabe. Von diesen Prozentwerten und den gemessenen O.D.-Werten wird eine Regressionsgerade gebildet, ª die nun die Prozentwerte der Proben berechnet werden (Abb. 1). 6.2 Fª eine gª Messung sollte die Regressionsgerade einen Korrelationskoeffizienten von 0,95 nicht unterschreiten und die Y-Achse bei einem O.D.-Wert von 0,000 bis 0,200 schneiden. 6.3 Liegen ein oder zwei Kontrollen deutlich abseits der Regressionsgerade, d.h. der Korrelationskoeffizient liegt in diesem Fall ebenfalls unter 0,95, k6nnen die auff~.lligen Kontrollen aus der Berechnung eliminiert werden. Sind danach die unter den Punkten 6.1 und 6.2 angegebenen Richtlinien erfª kann der Test als gª betrachtet werden. Andernfalls mufg der ELISA wiederholt werden.

2.8 2.e 2.4 2,2 2

1.s l.e ~ 1.4 1.z 1

[ ~

Konelation= 0,9999958 Stelgung = 29,75t465 Standardfehler = 0,002380285

0.s 0,6 0,4

0,2

SeTldWI

Poolplatte 1: 240 pl PBS-Tween/BSA 10 pl Serumprobe

Poolplatte 2: 150 ~1 PBS-Tween/BSA 50 q vorverd. Probe aus Poolplatte 1 = 1:100

0 0

10

20

30

40 bemchneter

= 1:25

50

80

70

80

90

10(

O.D.-We~ (%)

Abbildung 1: Regressionsgerade.

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B ekanntmachungen

Literatur: [1] OIE: Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. ParŸ 1996. [2] Nielsen, B., Baggesen, D., Bager, F., Haugegaard, J., and Lind, P.: The serological response

to SalmonelIaserovars typhimurium and infantis in experimentally infected pigs. The time course followed with an indirect anti-LPS ELISA and bacterioIogicaIexaminations. Veterinary Microbiology 47 (1995) 205-218.

Dr. Dieter Protz, Prof. Dr. Gª Steinbach, Peter Bahn, Dr. Annemarie Kiisbohrer,Dr. Christian Staak, Bundesinstitut fª gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veteriniirmedizin, Diedersdorfer Weg 1, 12277 Berlin

Gesundheitliche Beurteilung von Kunststoffen im Rahmen des Lebensmittel- und Bedarfsgegenst~indegesetzes 196. Mitteilung~

Antriige zur Aufnahme neuer Stoffe in die Empfehlung III. Polyethy|en:

)i,nderungen und Erg~inzungen der Empfehlungen:

Phosphats, darf 3 mg/kg Lebensmittel nicht ª

II, Weichmacherfreies

Zum Probtem der AbMngigkeit der H6he der Migration vom verwendeten PotyethylenTyp (LDPE/HDPE) in bezug auf die bei der Beantragung der Aufnahme neuer Stoffe vorzulegenden Untersuchungsergebnisse zur spezifischen Migration wird wie folgt Stellung genommen:

weichmacherfreie Mischpolymerisate des Vinylchlorids und Mischungen dieser Polymerisate mit anderen Mischpolymerisaten und chlorierten Polyolefinen mit ª gendem Gehalt an Vinylchlorid in der Gesamtmischung

Polymer aus 2,2,4,4-Tetramethyl-7-oxa-3,20diaza-20-(2,3-epoxypropyl)-dispiro[5.1.11.2t heneicosan-21-on, die Migration dieses Stofles darf 5 mg/kg Lebensmittel nicht ª schreiten,,.

Die spezifische Migration von Additiven ist abMngig vom Polymertyp. Bei Polyethylen nimmt die spezifische Migeation im allgemeinen mit fallender Dichte zu. Eine strenge Gesetzm~igigkeit kann mit dem gegenwiirtigen Kennmisstand nicht abgeleitet werden.

Die Empfehlung II, zuletzt geiindert nach dem Stand voto I. 12. 1996 [Bundesgesundhbl. 40 (1997) 109], wird wie folgt ergiinzt:

Zur Neuaufnahme eines Additivs in die Empfehlung III fª Polyethylen sind daher Migrationswerte mit einem Polyethylen zu ermitteln, aus dem die Migration am gr6igten ist. Unter dieser Voraussetzung gestellte Antr~ige fª zur Festlegung der maximalen Einsatzmenge. Die Kunststoffkommission des B g W bescMftigt sich gegenw~irtig mit der Definition eines solchen worst-case-Materials, entsprechende Spezifikationen werden zu gegebener Zeit ver6ffentlicht. In Hillen, in denen von diesem Vorgehen abgewichen wird, werden auf der Grund|age der eingereichten und toxikoIogisch akzeptierten Migrationswerte Richtwerte fª die spezifische Migration des beantragten Additivs festgelegt. Sofern die Substanz bereits abschlieflend durch den Wissenschaftlichen Lebensmittelausschuig der Europiiischen Kommission bewertet wurde, wird der dort festgetegte spezifische Migrationsgrenzwert ª nommen. Wenn die Migrationswerte im Einzelfall diesen Richtwert nicht ª kann von der gesundheitlichen Unbedenklichkeit i. S. von ~ 31 Abs. 1 des Lebensmittel- und Bedarfsgegenst~indegesetzes ausgegangen werden.

* 195. Mitteilung: Bundesgesundhbl. 41, 4 (1998) 182 360

Polyvinylchlorid,

Stand vom 1.6.1998

Der Punkt 3 a) ,,Reste von Zersetzungsprodukten fotgender Katalysatoren, wird erg~inzt durch: ,,1,3-Di(isopropylperoxyneodecanoyl)benzol, h6chstens 0,02 %,, Der Stoff ist in die Begrenzung ,,insgesamt h6chstens 0,2 %,, einbezogen.

Ira Punkt 4 (Stoffe fª die Verarbeitung zu Fertigerzeugnissen) wird zwischen den Eintragungen ,,Azodicarbonamid ..... und ,,Zitronens~.ure ..... das ,,oder,, gestrichen. V. Polystyrol, das ausschliefflich durch Polymerisation von Styrol gewonnen wird Stand vom 1.6. 1998 Die Empfehlung V, zuletzt ge~indert nach dem Stand voto 1.12.1996 [Bundesgesundhbl. 40 (1997) 109], wird wie folgt erg~inzt und ge/indert: Der Punkt 3 d) ,,Antioxydanzien- wird erg~inzt durch:

III. Polyethyten

,,Dibutylzinnmaleat, h6chstens 0,02 % ~b,

Stand vom 1.6.1998

Die Fuflnote I b lautet:,,nur zur Herstellung von gescMumtem Polystyrob,

Die Empfehlung III, zuletzt ge~.ndert nach dem Stand voto I. 12. 1996 [Bundesgesundhbl. 40 (1997) 109], wird wie folgt erg~inzt und geiindert: Der Punkt 3 c) ,,Reste von Zersetzungsprodukten folgender Initiatoren, wird erg~inzt durch: ,,Methylisobutylketonperoxid, 0,05 %~,.

h6chstens

Der Punkt 3 e) ,,Stabilisatoren, wird erg~inzt durch: ,,bis(hydrierte TalgsSure)amine, oxidiert, h6chstens 0,05 % 1,3-Propandiamin, N,N- 1,2-ethandiylbis-, Polymer mit 2,4,6-Trichlor-l,3,5-triazin und N-Butyl-2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinamin, h6chstens 0,3 %~,. Die beiden Stoffe sind in die Begrenzung ,,insgesamt h6chstens 1,0 %~~ einbezogen. ,,2,4,6-Tri-tert-butylphenyl-2-butyl-2-ethyl1,3-propandiolphosphit, die Migration dieses Stoffes, einschliet~lich des entsprechenden

Im Punkt 3 g) ,,Gleitmittel und/oder Formtrennmittel, wird hinter ,,Didecylphthalateingefª - Bis-(2-ethylhexyl)adipav, Der Stoff ist zusammen mit Di-(2-ethylhexyl)phthalat und Didecylphthalat in die Begrenzung ,,insgesamt h6chstens 3,0 %,, einbezogen. Im Punkt 4 (Treibmittel) werden zwischen den Eintragungen ,,Kohlens~iureabspalrende Mischungen ..... und ,,Zitronens~iure ..... die Worte ,,ferner auch- gestrichen. Vil. Polypropylen Stand voto 1.6. 1998 Die Empfehlung Vil, zuletzt geiindert nach dem Stand vom I. 12. 1996 [Bundesgesundhbt. 40 (1997) 109], wird wie folgt erg~inzt bzw. ge~ndert: Der Punkt 3 c) ,,Stabilisatoren- wird ergiinzt durch: Bundesgesundhbl. 8/98