Archiv ffir die gesamte Virusforschung 27, 317--331 (1969)

Institut fiir Medizinische Mikrobiologic der Universit~t Mainz

Riesenzellbildung und virusspezifische Antigene bei Herpesvirus hominis: Informationsflull yon der Eltern-DNS ~ Von D. Falke, D. Bitter-Suermann ~ und I. Clauss Mit 3 Abbildungen (Eingegangen am 30. Dezember 1968)

Friihere Untersuchungen hatten gezeigt, dab die Riesenzellbildung nach der Infektion mit dem herpesvirus hominis eng mit der Friihphase der Virusvermehrung verkniipft ist (1, 2). Ein wichtiger Hinweis hierfiir ist der Befund, daB sich die Virus-DNS-Synthese ebenso wie die l~iesenzellbildung durch Zugabe yon Actinomyein (AM) bis zu 2 Stunden p.i. vSllig blockieren 1/~Bt; durch die Zugabe yon Actidion (AD) kSnnen beide Vorg/~nge bis zu 3 Stunden p.i. blockiert werden. Zu einem sp~teren Zeitpunkt als dem jeweils angegebenen ist eine Blockade nicht mehr mSglieh. Die t~iesenzellbildung beginnt normalerweise etwa 4 Stunden p.i., die Virus-DNS-Synthese etwa 3 ~ Stunden p.i. Diese Behmde gestatten die Folgerung, dub fiir beide Prozesse Transcriptions- und Translationsschritte vorangehen miissen, ehe sie beginnen kSnnen. Die zeitlichen Abh/~ngigkeiten machen es unwahrscheinlich, dub die Tochter-DNS fiir die AuslSsung der Riesenzellbildung verantwortlich ist. Wenn das der Fall w~re, miiBte sich die l~iesenzellbildung durch Inhibitoren der Proteinsynthese, wie z. B. durch AD a]s Folge eines zweiten Translationsschrittes, auch bis zu einem sp/~teren Zeitpunkt blockieren lassen. Dafiir bestehen aber keine Anhaltspunkte. Die Annahme, dab die Riesenzellbildung die Folge yon Vorg/tngen in der ,,Friihproteinphase" ist, kann mSglicherweise auch auf andere Weise gepriift werden. Substanzen wie Cytosin-Arabinosid (C-Ara) und Hydroxy1 Wir danken der Deutschen Porschungsgemeinschaft fiir eine Sachbeihflfe. 2 Auszugsweise auf der 2. Arbeitstagung der Gesellschaft ftir Hygiene und Mikrobiologie am 8. Oktober 1968 vorgetragen.

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D. FALKE, D. BITT]~R-SU]]I~MANI~= up~d I. CLAUSS:

Urea (OH-U) unterbinden in geeigneten Konzentrationen die VirusDNS- und die Zell-DNS-Synthese v6llig, ohne die Synthese der Proteine und der I~NS wesentlich in Mitleidenschaft zu ziehen (3, 4, 5). Einige Versuche in dieser I~ichtung stammen von SIMI~-OFF (6); dieser Autor untersuehte nach Verabreichung yon Bromdesoxyuridin (BdU) beim herpesvi~'us hominis die Synthese von infektiSsen Partikeln und yon virusspezifischen Antigenen. BdU blockiert indessen eine Neu-Synthese yon DNS nieht, da es konzentrationsabh/~ngig in die Toehter-DNS eingebaut wird; diese Substanz gestattet also keine L6sung der gestellten Frage. MuNI~ und S A v ~ (7) haben autoradiographisch in tIeLa-Zellen nach Mitomycin C (MC)-Verabreichung trotz Riesenzellbildung keinen Einbau yon aH-Thymidin (~I-I-T) feststellen k6nnen. Auch dieser Versuch erlaubt wegen der relativ geringen Empfindlichkeit der autoradiographischen Methode keine endgiiltige K1/irung der Frage. Wir haben deshalb die Virus-Synthese phasengerecht (8) mit C-Ara, 0 H - U und MC blockiert, urn festzustellen, ob autoradiographisch 3H-TEinbau erfolgt. Um diese Ergebnisse zu sichern, haben wir zus/~tzlich die DNS extrahiert und die Radioaktivit/~t gemessen. Dariiber hinaus haben wir gepriift, ob neue infekti6se Viria gebildet werden und ob sich membranst/indige Antigene mittels der Immunadh/~renz-tI/~madsorption (IAH) und extrahierbare Antigene mittels der Immunadhhrenz-Reaktion (IAt~) nachweisen lassen. Aui3erdem haben wir die relativen Gen-Gr6Ben nach UV-Bestrahlung von herpesvirus hominis hinsichtlich Infektiosit~t, t~iesenzellbildung und Virus-DNS-Synthese bestimmt. Im folgenden soll fiber die Ergebnisse berichtet werden. Material und Methoden a

Die Angaben iiber die Zellziichtung, die Kulturmedien und die Virussti~mme sind in friiheren Ver6ffentlichungen niedergelegt (8, 11). Inhibitoren. 1-~-D-Ar~binofuranosylcytosin-HC1 Charge Nr. 6939-BDA28.1. verdanken wir den Farbwerken HSchst, Hydroxy-Urea wurde yon der Nutr. Bioehem. Corp., Cleveland (Ohio) bezogen, Mitomycin v o n d e r Fa. Serva, Heidelberg. Autoradiographie. Die Teehnik ist bereits friiher (1) beschrieben worden. aH-Thymidin wurde vom Radiochemical Center in Amersham bezogen und besal~ eine spezifisehe Aktivits yon 5C/m~ bzw. yon 21,4C/m~.r, aH-Uridin (~H-U) besal~ eine spezifische Aktivit~t yon 5C/m~. Immunadharenz. Die IAR und IAH wurde wie besehrieben durchgefiihrt (9, 10). DNS-Extraktion. Die in Vierkant- oder Roux-Flaschen geziichteten Kaninchennieren-Zellen wurden wie in den Versuchen beschrieben behandelt. Pro Vierkantflasche [mit 10 ml BME ~- Zusatz (11)] warden 5 ~ C3H-T oder pro Roux-Plasche (50 ml BiKE -~ Zusatz) 25 ~ C ftir die Dauer von 45 MinuWir danken Frau U. COH~ fiir fleil~ige Mitarbeit.

Riesenzellbildung und virusspezifische Antigene bei Herpesvirus

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ten bis 150 Minuten zugefiigt, das Medium abgegossen, 1 • mit 40 ml NaC1-

PO~-Puffer (0,9% NaC1; m/50 Phosphat, pH 7,2 his 7,4) gesptilt und die Zellen in 2 ml NaCl-PO4-Puffer abgekratzt, mit 2 ml naehgesptilt und die Sptilfltissigkeit vereinigt. Naeh dem Aussehleudern der Zellen wurden diese in 2 ml des Puffers aufgenommen, 8 Sekunden ultrabesehallt und 1,5 ml der Suspension mit 1,5 ml 10~oiger TCA streng bei +4~ versetzt. Naeh 15 Minuten Stehen wurden 0,5 ml der Fliissigkeit auf eine Filtriereinriehtung (HA~u der Millipore-Fflter-Comp., USA, gegeben und die Plttssigkeit abgesaugt. Naehgespiilt wurde mit 30 ml kalter (+4~ 5%iger TCA, 30 ml 70%igem Alkohol mit 2,5% NaAeetat und 30 ml 70%igem Alkohol. Die Filter wurden dann getroeknet, in Ampullen mit je 10 ml Brayseher LSsung gegeben und in einem SeintillationsmeBger~t Typ 3003 (Triearb der Fa. Packard) gemessen. UV-Bestrahlung. Die BestrahIung erfolgte mit einer Sylvania-Lampe (max. Emission bei 2540 ~-). Die virushaltige Flttssigkeit wurde mit einem Magnetriihrer gerfihrt. Zu den entspreehenden Zeiten wurde ein aliquotes Volumen entnommen, fiir die Titrationen verdttnnt und fiir die Prtifung auf Riesenzellbfldung und Virus-DNS-Synthese unverdttnnt auf ein LeightonR6hrehen gegeben. 6 bis 7 Stunden p.i. wurde mit 8H-T markiert.

Ergebnisse 1. Au]treten von Riesenzellen und virusspezi/ischen Antigenen trotz Blockade der Virus-DNS-Synthese I n einer friiheren Arbeit (10) hatten wir berichtet, dal~ die phasengerechte Anwendung von BdU, d. h. die Verabreiehung yon 25 bis 50 BdU/ml Kulturfliissigkeit etwa 2 oder 3 Stunden p.i., die Riesenze]lbildung sowie die Synthese membransti~ndiger oder extrahierbarer Herpes-Antigene nicht beeinfluBt. BdU blockiert aber die Synthese yon Toehter-DNS nieht. Eine Blockade 1s sich aber dureh C-Ara, MC oder OH-U herbeifiihren; es sind dies Substanzen, welche in geeigneten Konzentrationen die DNS-Synthese vSllig hemmen. Die phasengereehte Anwendung dieser Substanzen kSnnte es mithin ermSgliehen, die DNSFunktion der bei der Infektion eingedrungenen Viria ohne StSrung dutch den Informationsflul~ yon seiten der neugebildeten Tochter-DNS zu studieren. Zun~chst wurde in autoradiographisehen Experimenten gepriift, ob naeh Anwendung yon C-Ara, MC oder OH-U noeh Virus- (oder Zell-) DNS-Synthese in den Kernen naehweisbar ist. Infiziert wurde mit einer absorbierten Mu]tiplizit~t yon etwa 1. Mit att-T wurde 60 Minuten lang markiert (spezifisehe Aktivit~t 5 C/m~), die Prs dann aufgearbeitet und ausgez/~hlt. Tabelle 1 sowie die Abb. 1 und 2 zeigen, dal~ dutch die Anwendung yon 100 u C-Ara die Zell-DNS-Synthese und die Bildung yon Virus-DNS v511ig blockiert wird. Ein Betrag yon 3 • 10 -2 M OH-U war hingegen nieht in der Lage, die Synthese der Zell-DNS und der Virus-DNS zu hemmen. Weitere Versuehe mit 3H-T einer spezi~ischen Aktivits yon 21,4 C/raM erbrachten gleichartige Ergebnisse. Unter Verwendung der als vSllig wirksam ermittelten Dosis sollte gepriift werden,

320

D. FALKE, D. BITTER-SuEaMANN und I. CLAUSS:

ob in einem Einstufen-Vermehrungsversuch die Riesenzellbildung und die Synthese membranst/~ndiger Herpes-Antigene durch C-Ara, MC oder dureh Ott-U gehemmt wird (Tabelle 2).

Abb. 1. A u t o r a d i o g r a m m roll K a n i n c h e n n i e r e n - Z e l l e n n a c h Infektion m i t e i n e m riesenzellbildenden t I e r p e s s t a m m . M a r k i e r u n g m i t 3 H - T h y m i d i n 6 ~ --7 89 Std. p.i. Zahlreiehe Silberk 6 r n e r fiber den K e r n e n einer RiesenzeUe. Vergr6/~erung e t w a 1000faeh. t t E - F ~ r b n n g .

Die Riesenzellbildung ist 7 Stunden p.i. in den Viruskontrollen und in den mit C-Ara sowie OH-U oder MC behandelten Kulturen gleich stark (3--zI+). In analoger Weise ist die I A t t in allen Xulturen ebenfalls gleieh intensiv. Im Gegensatz dazu ist aber die Anzahl der neugebildeten P F U (plaque forming units) bei OH-U um etwa den Faktor 1000, bei C-Ara

Riesenzellbildung und virusspezifische Antigene bei Herpesvirus

321

um etwa den Faktor 10.000 geringer uls in den Kontrollen. Diese Ergebnisse liel3en sich stets reproduzieren; sie zeigen, d~13 unter den ~ngegebenen Bedingungen der Synthesehemmung yon Virus-DNS nicht nur die Riesen-

Abb. 2. A u t o r ~ d i o g r a m m y o n ~ a n i n c h e n n i e r e n - Z e l l e n n a c h In~ektion m i t e i n e m riesenzellb i l d e n d e n I t e r p e s s t a m m . M~rkierung wie bei Abb. 1. 2 S t n n d e n p.i. Znga.be y o n 100 ~,/ml Cytosin-Ar~binosid Knlturflfissigkeit. K e i n e Si]berkt)rner fiber den K e r n e n einer Riesenzelle. VergrSBerung e t w a 1000faeh. I t E - F ~ r b u n g .

zellbildung, sondern auch die ~r unver~ndert ablaufen. In weiteren Experimenten sollte nun gezeigt werden, wieweit n~ch Anwendung der genann~en ttemmstoffe die •eusynthese such yon extrahierbarer, r~dioaktiv-markierter Virus-DNS blockiert ist (Tubclle 3).

322

D. FALKE, D. BITTER-SUERVIAlql~"und I. CLAUSS:

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Es wurden mehrere Experimente durchgefiihrt. In Parallelversuchen haben wir auiter der eingebauten gadioaktivit/it auch noch die Antigenmenge 6 Stunden p.i. bzw. 22 Stunden p.i. bestimmt. Es ergab sich folgendes Bild: In den Zellkontrollen reduzieren 100 ,/ C-Ara pro ml Kulturflfissigkeit den Einbau yon aI-IThymidin auf etwa 1%, in den virusinfizierten Kulturen etwa auf knapp 2 ~ wenn 150 Minuten lang markiert wurde. Bei kurzdauernder all-T-Gabe wird naturgem/~$ nur wenig Virus-DNS gebildet. In weiteren Versuchen reduzierten 6 x 10 _2 M OI-~-U den Einbau in den bier nicht aufgefiihrten Zellkontrollen auf etw~ 1% und in den virusbehandelten Kulturen auf etwa r Ein Betrag yon 10 ~- MC/ml ist lediglich in der Lage, den Einbau auf etwa 15 bis 20 ~o zu reduzieren. Setzt man 50 7 MC/ml ein, so wird die DNS-Neusymthese auf e~wa 5 ~o herabgesetzt. Bei all diesen Versuchen ist die Antigenmenge 6 Stunden p.i. gleich gro$, w/~hrend sie 22 Stunden p.i. gegeniiber den unbehandelten Kontrollen um 75% zuriickgeblieben ist. Die im Kulturiiberstand befindlicheAntigenmenge ist in den mit 100 u CAra versehenen Kulturen ebenfalls um 75% geringer als in den Kontrollen. Insgesamt ergibt sich, dal~ unter C-Ara der Einbau yon aH-T in s/~ureunlSsliche DNS um etwa

Riesenzellbildung nnd virusspezifische Antigene bei Herpesvirus

323

99% reduziert ist. Dies gilt sowohl fiir die Zell-DNS als aueh fiir die u Die Neusynthese yon Virus-DNS ist also tatsgchlich v611ig blockiert. Diese Reduktion des aH-T-Einbaues hat aber 6 Stunden p.i. noch keinen EinflnI3 auf die neusynthetisierte Antigenmenge. Erst 22 Stnnden p.i. ist die Antigensynthese etwas zuriickgeblieben. Aus den gesehilderten Versuchen mul3 man folgern, da]3 des ElternVirusgenom ffir sieh allein in der Lage ist, die Information fiir die Riesenzellbildung, die Synthese der Membranantigene und der extrahierbaren Antigene abzugeben. Tebene 2. R i e s e n z e l l b i l d u n g , I m m u n ~ d h ~ r e n z - H g m a d s o r p t i o n u n d Virussynthese naeh Verabreichung yon Cytosin-Arabinosid ( C - A r e ) , M i t o m y c i n C (MC) o d e r t I y d r o x y - U r e a ( O H - U ) ZpE 1

IAIP

Viruskontrolle Virus+ 1 • 10- 2 0 H - U + 3 • 10. 2 0 H - U + 6 • 10- 2 0 H - U

3--4+ 3--4+ 3--4+ 3--4+

2--3+ 2--3+ 2--3+ 2--3+

Virus+

3--4+ 3--4+ 3--4+ 3--4+

2--3+ 2--3+ 2--3+ 2--3+

3--4+ --

2--3+ ( + )a

+ + +

I00 50 25 i0

y y y y

C-Are C-Are C-Are C-Are

Vh'us+40 y MC Zellkontrolle

PFU

2

2,9 • 104 3 • 102 2,2 X 101 1 • 101 < 10 ~
~


~

5 X i0 ~

1 7 Stunden p.i. yon (+) bis 4 + geschs 2 24 Stunden p.i. PFU pro 0,2 ml Virusverdiinnung. 3 7 Stunden p.i. yon (+) bis 4 + gesch/itzt (mit menschlichem Anti-HerpesSerum getestet, KBR-Titer 1 : 32, 1 : 20 verdiinnt). 4 sog. beckground der IAH. Hemmsto]]konzentration : y/ml oder molare Endkonzentration. Aus der Tabelle geht weiterhin hervor, dab auch der InformationsfluB ftir die H e m m u n g der Zell-RNS-Synthese dureh 100 y/ml C-Are nieht gehemmt ist. Dies war naeh (1) zu erwarten. Aueh die Information fiir die H e m m u n g der Zell-RNS-Synthese geht also vom Elterngenom aus.

2. Dissoziation der Teil/unktion ]iir In]ektiositSt, /iir Virus-DNS-Synthese sowie /iir Riesenzellbildung dutch U V-Bestrahlung des in/izierenden Virusgenoms Die bisher dargestellten Versuehe mit Inhibitoren hatten gezeigt, dab der InformationsfluB ftir die Riesenze]lbildung, die Antigensynthese und die I-Iemmung der zelleigenen RNS-Synthese vom Elterngenom ausgeht. Eine vor der Infektion vorgenommene Bestrahlung des Virus A r c h i v f. V i r u s f o r s c h u n g , B d . 27, H . 2 - - 4

22

324

D.

FALK]~, D. BITTER-SUERI~IANN und I. CLAUSS:

Tabelle 3. E i n b a u y o n a H - T h y l n i d i n und 3H-Uridin sowie die Antigensynthese nach Einwirkung yon Cytosin-Arabinosid (C-Ara), Hydroxy-Urea ( O H - U ) o d e r M i t o m y c i n C (MC) Versuch

1. Versuch IPM

2. Versuch IPM

30811

125522

Z-ntigengehalt 6 Stunden p.i. 122 Stunden p.i.

8H-Thymidin Zellkontrolle C-Ara-Kontrolle 100 y/ml Viruskontrolle Virus + C-Ara 100 y/ml

106

10I

658

9490

65

160

1 : 32 ~

i

1:32

1 : 2564 (1:32) 5 1:64

1

l (1:8)

V i r u s + C - A r a 50 T/ml V i r u s + C - A r a 25 y/ml

61 95

Viruskon~rolle

9815

1:32

Virus+MC 50 y/ml

480

1:16

V i r u s + OH-U 6 • 10 -2

365

1:32

1:256 (1:32) 5 1:8

(1:2) 1:32

(1:4) aH- Uridin Zellkontrolle C-Ara-Kontrolle 100 y/ml Viruskontrolle Virus -k C-Ara 100 y/ml

10143

1650 a

725

2400 420 280

1 Markierung 45 Minuten lang. Markierung 150 Minuten lang. a Markierung 60 Minuten lang. 4 Die Titerangaben beziehen sich auf das Zellsediment (immer gleiches Volumen). 5 Die Titerangaben in Klammern beziehen sich auf den Antigengehalt, gemessea mit der Immunadh/~renz-Reaktion im Kulturiiberstand nach Ultrazentrifugation (2H Stunden bei 19.000 UPM) und Aufnahme in vergleichbaren Volumina. Der ZPE (RZB) ist 7 Stunden p.i. 4 + . Die Substanzen (Ara-C, MC und OH-U) wurden nach dem ~ediumwechsel 2 Stunden p,i. gegeben. m i t U V k 6 n n t e diese d r e i F u n k t i o n e n beeintrgchtigen. D a b e i b l e i b t zun/~chst offen, ob alle drei F u n k t i o n e n gleichm/iBig a l t e r i e r t w e r d e n oder ob einzelne F u n k t i o n e n s t r a h l e n e m p f i n d l i c h e r sind als andere. W i r h a b e n deshalb H e r p e s v i r u s hominis (Stature J E S ) m i t U V b e s t r a h l t .

Riesenzellbfldung und virusspezifische Antigene bei Herpesvirus

325

In den nicht bestrahlten Kontrollen wurde die Infektiosit~t wie fiblieh durch Verdiinnungsreihen bestimmt. Die virushaltige Flfissigkeit enthielt so viel PFU, dab nach Verimpfung yon 0,2 ml pro Leighton-RShrehen 7 Stunden p.i. der Zellrasen fast vSllig in Riesenzellen umgewandelt ist; etwa 65% der Kerne zeigen dann 6 bis 7 Stunden p.i. ,,Virus-DNS"Synthese. Dies wfirde einer absorbierten Multiplizit~t yon ebwa 1 entspreehen. Wenn man die Zahl der Kerne innerhalb der Riesenzellen mit der Zahl der Kerne auBerhalb der Riesenzellen in Beziehung setzt, kann man den entsprechenden Quotienten als MaB fiir das AusmaB der Riesenzellbildung im Zellrasen verwenden. Setzt man diesen Quotienten bei einer Kontrollkultur dem Wert 100% gleich, so zeigen kleinere Werte dieses ,,Riesenzell-Index" an, dab in der entspreehenden Kultur die Riesenzellbildung behindert worden ist. In analoger Weise kann man diejenigen Kerne, in denen Virus-DNS gebildet wird, autoradiographisch ausz~hlen und in Beziehung zu den inaktiven Kernen setzen. Aueh hier wurde der erhaltene ,,DNS-Synthese-Index" der Kontrollkultur gleich 100% gesetzt. Dabei wird ein kleiner Prozentsatz (weniger als 10~o) der Kerne in der Synthese-Phase (3H-Index) mit Zell-DNS-Synthese vernachl/~ssigt, der noch Zell-DNS-Synthese zeigt. Diese wird bekanntermaBen dureh den infektiOsen ProzeB blockiert. Mit den bestrahlten Proben wurde genauso veffahren. In Vorversuchen hatte sieh gezeigt, dab eine temperaturbedingte Inaktivierung der Viria bei 45~ eine gleichsinnige Abnahme der Infektiosit~t, der Virus-DNS-bildenden Kerne und des Prozentsatzes der in- und auBerhalb der Riesenzellen befindlichen Kerne zeigt. Aueh bewirkt die Verdfinnung der Virussuspension eine dem Verdfinnungsfaktor entspreehende Abnahme der Aktivit~ten. Tr~gt man die Zahl der noeh infekti6sen Teilchen logarithmiseh gegen die Bestrahlungszeit auf, so resultiert eine lineare UV-Inaktivierungskurve. Der lineare Verlauf der Kurve ist nur for den Absehnitt yon 0 his 160 Sekunden gegeben. Eine U]trabeschallung des Ausgangsmaterials vor der UV-Exposition bewirkt keine meBbare Verl~ngerung des linearen Kurvenabsehnittes. Eine Verhinderung der Photoreaktivierung durch 0,2% Coffein l~Bt sieh bei unserer Versuchsanordnung nioht verwirkliehen, da Coffein die Virussynthese in der Zelle hemmt. Der EinfluB der Photoreaktivierung ist aber woh] sehr gering, da die infizierten Kulturen in einem dunklen Brutsehrank gehalten und nur zum Mediumswechsel und zur 3H-T-Zugabe aus dem Brutsehrank genommen wurden. Der Kurvenverlauf der Abb. 3 zeigt, dab die Infektiositgt erheblioh UV-sensibler ist als die F~higkeit, die Riesenzellbildung zu induzieren und die Virus-DNS-Synthese anzuregen. In mehreren Versuehen wurden gleichsinnige Resultate erzielt, jedoeh schwank~en die Werte ffir die 22*

326

D. FALKE, D. BITT]~R-SuERMANN und I. CLAUSS:

Inaktivierung der riesenzellbildenden Eigenschaft etwas. -- Damit erscheint es denkbar, d al3 es nach der Bestrahlung Viria gibt, die ihre F/~higkeit zur Selbstproduktion in der Zelle g/~nzlich verloren haben, die aber wohl in der Lage sind, die Riesenzellbildung auszulSsen. Es ist in diesem Fall mSglicherweise eine ,,kleine" Riesenzelle zu erwarten, d. h. eine wenig vergrSBerte Zelle, die Mehrkernigkeit zeigt. Um diese Hypothese zu priifen, haben wir diejenigen Kulturen, die mit dem Virus-Ausgangsn/n o 1,0 -

PFU oder

./,

0,1 -

I 0

~ 20

I t.o

I 80

160

sec. u v 0 PFU

x DNS

9 RZ

Abb. 3. U V - B e s t r a h l u n g y o n H o r p e s v i r u s hominis (2540 ~_). B e s t i m m u n g der Infektiosit/~t, des P r o z e n t s a t z e s V i r u s - D N S - b i l d e n d e r K e r n e sowie der Riesenzellbildung. Die U V - E m p findlichkeit tier I n f e k t i o s i t ~ t ist erheblich grSl~er als die der b e i d e n a n d e r e n Virus-Eigenschaftem

material (Verdiinnung 10 -3) und mit den 80 Sekunden lang UV-bestrahlten Proben (Verdtinnung 10 -2) infiziert waren, fixiert, nach Giemsa gef/~rbt und dann naeh diesen mehrkernigen Zellen gesucht. Die UV-Dosis fiir die Bestrahlung wurde so gew/~hlt, dub naeh 80 Sekunden der Anteil an infektiSsen Teilehen auf 10% reduziert war. Diese gew/~hlten Verdiinnungsstufen fiir das bestrahlte und das nieht bestrahlte Virus eathalten etwa eine gleich groBe Zahl direkt auszghlbarer Plaques; diese Wahl geschah, um nich~ allzu viele vielkernige Riesenzellen im Pr/~parat zu haben. Bei st/irkerer Verdiinnung wiirden andererseits zu wenig mehrkernige Zellen erkennbar gewesen sein.

Riesenzellbfldung und virusspezifische Antigene bei Herpesvirus

327

In Tabelle 4 ist aufgezeichnet, daB tats/~chlich in den Kulturen, die mit 80 Sekunden lang bestrahltem Material infiziert waren, ein erheblich grSBerer Prozentsatz an mehrkernigen Zellen (5 bis 10 Kerne) auftritt als in der Viruskontrolle. Dies wird ersichtlich, wenn man die Zahl der mehrkernigen Zellen auf die Zahl der jeweils ausziihlbaren Plaques bezieht. Aus Tabelle 4 geht also hervor, dab fiir die unbestrahlte Viruscharge die Zahl der P F U in einem bestimmten Verh/~ltnis zu den gez/~hlten ,,Mehrkern"-Zellen steht, die nach Verbringung der Charge auf LeightonTabelle 4. U V - B e s t r a h l u n g y o n H e r p e s v i r u s h o m i n i s u n d K e r n z a h l p r o R i e s e n z e l l e ( M i t t e l w e r t aus 3 V e r s u e h e n ) Z a h l tier K e r n e pro m e h r k e r n i g e Zene

2 3 4 5 6

7 8

9 10

Zellkontrolle

V i r u s k o n t r o l l e 10 -3

Z~hP

%2

Zahl

%

258 28 4

89 9,6 1,5 0,4

548 60 14 7 3 5 5 3 9

84 12 2,1 1,0 0,5 0,7 0,7 0,5 1,3

1

80 ~ i n u t e n U V - B e s t r a h l u n g 10 -8 Zahl %

375 63 33 20 23 13 10 9 14

67 11 5,9 3,6 4,1 2,3 2,0 1,8 2,3

1 Zahl der geziihlten Zellen mit 2 . . . 10 Kernen. 2 Prozentsatz der Zellen mit 2 . . . 10 Kernen. Titration: 1,0 ml Medium§ ml Virusverdiinnung. .Leighton-RShrchen: 0,3 ml WM§ ml Virusverdiinnung, Kontrolle 0,5 ml WM 2 Stunden p.i. Mediumwechsel~-Immunserum 1:20 (0,2/R). UV: 10cm Abstand. Riihren mit Magnetriihrer. RShrchen sichtbar sind. Bei der bestrahlten Charge ist dieses Verh~ltnis verschoben: Auf eine bestimmte Plaquezahl k o m m t jetzt eine hShere Anzahl yon Mehrkern-Zellen. Wenn man annimmt, dab jedes Plaquebildende Partikel im Leighton-RShrchen zu einer ,,Mehrkern"-Zelle fiihrt, so m u ] m a n folgern, dab nach Bestrahlung eine Reihe yon Viruspartikeln ihr VermSgen verloren haben, regul~re Plaques zu bilden, dagegen abet wohl noch in der Lage sind, die Bildung yon Mehrkern-Zellen zu induzieren. Dieser Befund gestattet die Folgerung, daB partiell durch UVStrahlen inaktiviertes Virus noeh in der Lage ist, die Bildung mehrkerniger Zellen anzuregen. Diskussion

Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit haben der Frage gegolten, ob das Genom der eingedrungenen Viria yon herpesvlrus hominls unter den Bedingungen einer vSlligen Blockade der Synthese yon Tochter-

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D. FALK~, D. BITTER-SU]~RI~AI~Nund I. CLAUSS:

DNS, die Information fiir die Ingangsetzung der Riesenzellbildung, fiir die Synthese membranstgndiger und extrahierbarer Antigene sowie ftir die Hemmung der Zell-RNS-Synthese abgibt. Uber erste Beweise dafiir war bereits friiher beriehtet worden (1). Die autoradiographischen Experimente Ms auch die Einbaustudien yon 3H-T in sAureunlSsliches Material haben deutlich gezeigt, dab C-Ara die Synthese yon Tochter-DNS vSllig unterbindet. Trotzdem waren die genannten Aktivits im Zeitraum eines Einstufen-Vermehrungszyklus nieht beeintr~chtigt. Auch mit MC und OH-U haben wir ~hnliche Ergebnisse erhalten. C-Ara blockiert die DNS-Synthese, seine Wirkung 1s sich durch Zugabe yon d-Cytidin aufheben. Ferner wird die Umwandlung yon UM~P in dUMP bloekiert (21). Wenn ein Einbau in die DNS erfolgt, diirfte dieser sehr gering sein (21). Die oben gestellte Frage nach der Funktion, also der Friihfunktion des Genoms der eingedrungenen Viria des herpesvirus hominis l~l~t sieh demnaeh im positiven Sinne beantworten. Mo~GA~ und Mitarbeiter (12) haben elektronenmikroskopiseh in herpesinfizierten Zellen, die mit OH-U behandelt waren, Capside nnd Hiillmaterial beobaehtet. Auch sie fanden, dab unter ihren Bedingungen die Virus-DNS-Synthese auf etwa 1% reduziert war. Wir mSehten betonen, dal~ bei Einhaltung der gesehflderten Bedingungen Riesenzellen entstehen und dab sieh in ihren Membranen mittels der IAH virusspezifische Antigene naehweisen lassen. Hierbei kSnnte es sich, wenn wir die Untersuehungen aus dem Arbeitskreis yon MORGAN (12) zum Vergleieh heranziehen, um ,,Virus.Hfillmaterial" handeln. Wir haben aber Bedenken, das Anftreten yon virusspezifischem Antigen-Material in der Zellmembran ursgchlieh mit dem Prozel~ der Riesenzellbildung in Verbindung zu bringen, wie es MO~GA~ (12) tut. Solche Antigene ]assen sieh mit der IAH ngmlioh auch in der Membran yon il~fizierten Zellen naehweisen, wenn mit Zellabkugelung erzeugenden Herpesstgmmen infiziert wird (10). Die Versuche fiber die Menge der neugebildeten antigenen Substanzen haben ferner gezeigt, dab aueh veto Tochter-Virnsgenom, wie nieht anders zu erwarten, ein Informationsflul~ ffir die Antigensynthese ausgehen mul~. Die Blockade der Synthese yon Virus-DNS verringerte n~mlich die Menge neugebildeter antigen-wirksamer Substanzen, wenn die Zeitspanne yon 3 Synthesezyklen durehlanfen wurde. Eine detaillierte AntigenAnalyse steht jedoch noeh aus. Hinsichtlieh des zytopathisehen Effektes, in unserem Fall der Riesenzellbildung, hat sieh, wie bereits f r f h e r beriehtet, eindeutig zeigen lassen, da~ dieser Effekt in einer ,,Friihproteinphase" vom Elterngenom ausgeht. W~hrend JOKLIK (16) noch keine genauen Angaben machen konnte, berichtete jetzt auch BABLA~IA~ (18), dal] sich der friih auftretende

Riesenzellbildung und virusspezifisehe Antigene bei Herpesvirus

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zytopathische Effekt des Vacciniavirus durch Zugabe yon Puromycin verhindern 1s also vom Elterngenom ausgehen mull Die Unwirksamkeit yon C-Ara (wie auch yon FdU) auf bestimmte Prozesse wird als Hinweis auf die Zugeh5rigkeit zur Friihproteinphase gewertet (18). L~VlTT und BECKER (3) berichten, dal3 C-Ara die Synthese yon Herpes-Virus-DNS verhindert, aber nicht die Umhtillung bereits fertiggestellter DNS beeintr~chtigt. Aus den elektronenmikroskopischen Untersuehungen yon MORGA~(12) mit OH-U als aueh aus denjenigen yon SI~GJSl~T und FALK]S 05) mit Cyeloheximid beim herpesvirus hominis kann gesehlossen werden, dal~ offenbar Envelope- und Capsidmaterial gleichzeitig bereits sehr/riihzeitig im Infektionszyklus gebildet wird. Die Befunde am herpesvirus homini8 legen Vergleiche unter den Bedingungen einer Blockade der' Synthese yon Toehter-DNS mit dem Verhalten anderer DNS-haltiger Viren, insbesondere der DNS-haltigen Tumorviren, nahe. So blockiert C-Ara oder OH-U die Entstehung des V-(irus)-Antigens, nicht aber die Entstehung des T-Antigens beim SV40- oder beim Adenovirus (13, 14). Beim Herpesvirus hingegen entstehen sowohl Capside als auch Hiillmaterial. Eine friihzeitige Verabreiehung yon Actinomyein C oder yon Cycloheximid (Aetidion) bloekiert beim herpesvirus hominis (1, 2) und beim SV40-Virus (13, 20) alle Syntheseprozesse, auch die zytopathisehen Effekte. OH-U unterbindet beim Vacciniavirus (4) auI~er der Synthese yon D~S anch noeh das Auftreten der beiden ~ui~eren Hiillen, obwohl unreife Partikeln (sog. Baby-Viren) entstehen. Offenbar bestehen virusspezifisehe Untersehiede hinsichtlich der Transcription des Elterngenoms. Die Experimente mit partiell UV-inaktiviertem Herpesvirus zeigen sehliel~lieh, daf3 nur ein Tell des Virusgenoms fiir die Ingangsetzung der DNS-Synthese nnd der Riesenzellbildung, jedoch das ges~mte Genera fiir die Synthese infektiSser Viria erforderlieh ist. Partiell inaktiviertes Virus regt Riesenzellbildung an. WAUBKE und Mitarbeiter (19) waren kiirzlieh nach UV-Bestrahlung yon Herpesvirus hinsichtlich der chromosomenseh~digenden Eigensehaften dieses Virus zu ghnliehen Ergebnissen gekommen.

Zusammenfassung Es wird fiber den EinfluB von Cytosin-Arabinosid, ]-Iydroxy-Urea und yon Mitomycin C auf die Entsbehung membransts oder extrahierbarer Antigene, auf die l~iesenzellbildung sowie auf die Herpesvirus-bedingte Hemmung der Zell-RNS-Synthese beriehtet. Dureh die Verabreichung der drei Substanzen wird die Reduplikation der DNS des eingedrungenen Virus vSllig bloekiert. Trotzdem lassen sieh die Ph/~nomene der Riesen-

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D. FALKE, D. BITTER-SuElcMA~ und I. CLAVSS:

zellbildung, der V i r u s - A n t i g e n - S y n t h e s e u n d der S y n t h e s e h e m m u n g d e r Zell-t~NS in vollem U m f a n g e nachweisen. Des weiteren w u r d e gefunden, da~ U V - B e s t r a h l u n g die drei untersuchten F u n k t i o n e n des t t e r p e s v i r u s in u n t e r s c h i e d l i c h e m Ausmal~ beeinflul~t: N a e h d e r B e s t r a h l u n g n i m m t die Z a h l derjenigen P a r t i k e l , welche P l a q u e s zu bilden vermSgen, s t a r k ab, wi~hrend die Z a h l derjenigen P a r t i k e l , die l~iesenzellen bilden oder D N S - S y n t h e s e anregen, in ger i n g e m Mai~e h e r a b g e s e t z t wird. Es w i r d d a r a u s d e r Sehlu~ gezogen, da]~ die F s zur I n d u k t i o n der Riesenzellbildung u n d der D N S - S y n t h e s e einen kleinen Treffbereich hat, w ~ h r e n d die Fi~higkeit zur P l a q u e - B i l d u n g die M i t w i r k u n g von wesentlieh m e h r Cistrons erfordert.

Summary The experiments describe the influence of Cytosine-Arabinoside, HydroxyUrea and Mitomycin C upon the appearance of herpes-specific membranebound or extractable antigens, upon giant cell formation and the virus induced inhibition of celI-RNA synthesis. The application of these substances inhibits the synthesis of viral-DNA. Under these conditions giant cell formation, antigen-synthesis and inhibition of cell-RNA synthesis are normal (8 hours post infection). Therefore the DNA of the infecting virus-particle is responsible for these virus-induced functions. UV-irradiation of the infecting virus particles destroys the capacity to form plaques much more readily than the ability to form multinucleated cells or the ability to induce viral DNA-synthesis. The ability to induce giant cell formation or virus DNA-synthesis needs apparently less eistrons than the capacity to form plaques.

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