CLINICA M E D I C A GENERALE DELL'UNIVERSITA DI FERRARA (Direttore: Prof. A. BASERGA)

DELLA

ASPETTI CITOGENETICI LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA GIANLUIGI CASTOLDI

CONTENTS A) CARATTERISTICHE DEL CROMOSOMA FILADELFIA

A) CHARACTERISTICS CHROMOSOME

B) ORIGINE DEL CROMOSOMA FILADELFIA

B) ORIGIN OF THE PHILADELPHIA CHROMOSOME

C) CLASSIFICAZIONE CITOGENETICA DELLE FOR-

C) CYTOGENETICCLASSIFICATION OF CML FORMS

ME DI LMC

D) FORMEPhi+ 1) Forme con Ph * come unica anomalia 2) Forme con cariotipo 46,XO,Ph 1 3) Forme con Ph ~ associato ad altre anomalie cromosomiche 4) Forme mielobIastiche acute ab initio con Ph ~ E) FORME

OF THE PHILADELPHIA

D) Phi+ FORMS 1) Forms with P h I as the only anomaly 2) Forms with karyotype 46,XO,Ph t 3) Forms with Pht associated to other chromosomal anomalies 4) Acute myelohlastic forms ab initio with Ph I

E) Ph l - FORMS

Ph ~ -

1) Forme inlantili 2) Forme a polinudeati maturi (tipo Emil-Weil e Sde) 3) Leucemie ad eosinofili 4) Sindrome di Freireich

1 ) Infantile forms 2) Forms with mature polynucleated (Emil-Well and S6e type) 3) Eosinophilic forms of leukemia 4) Freireich's syndrome

F) LMC p h i + E Ph ~--- NELL'ADULTO

F) P h i + AND Ph I - CML In ADULTS

G) REPERTI CITOGENETICI NELLE CRISI BLASTICHE DELLA L M C

G) CYTOGENETIC FINDINGS IN BLASTIC CRISES

H) ASSOCIAZIONEDELLA LMC ( P h i + ) CON AL-

H) ASSOCIATION OF P h ' + CML WITH OTHER

OF CML MORBID SITUATIONS

TRE FORME MOREOSE I)

IL CROMOSOMA Ph t IN SITUAZIONI MORBOSE DIVERSE DALLA L M C

L) IL P h I NEGLI STUDI IN FLUORESCENZA E CON TECNICHE DI <> M) RAPPORTI TRA

Ph t E <~ STEM CELLS ~>

I)

P h I CHROMOSOME IN MORBID SITUATIONS DIFFERENT FROM C M L

L) Ph I IN FLUORESCENCE STUDIES AND WITH 'BANDING' TECHNIQUES M) RELATIONSHIPS CELLS

BETWEEN

Ph I AND STEM

Key-words: Banding technique; Blastic crisis; Chronic myeloid leukemia; Clonal evolution; Leucocyte alkaline phosphatase; Philadelphia chromosome. Data di arrivo in Redazione 19-5-1972. La Ricerca Clin. Lab. 3, 239, 1973. 239

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

Nel 1960 NOWELL e HUNGERFORD159 dimostrarono per primi, nella leucemia mieloide cronica (LMC), la presenza di una peculiare anomalia cromosomica (a cancer cell marker) caratterizzata dalle ridotte dimensioni di uno dei piccoli cromosomi acrocentrici appartenenti al gruppo G (fig. 1). Tale riduzione, che interessava le braccia lunghe di uno dei piccoli cromosomi, veniva pressochg contemporaneamente con/ermata da BAIKIE e Coll. 8 ed in seguito documentata da numerosi altri AA. 14, 26, 78, 93, 130, 207. L' alterazione cromosomica venne denominata cromosoma di Filadelfia in omaggio alla sede ove venne e/fettuata la scoperta e, pill sinteticamente, Ph i, secondo la dizione abbreviata della nomenclatura concordata a Denver (1960).

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA. NOWELL and

Per lungo tempo questo cromosoma stato considerato come un cromosoma del paio 21 del gruppo G poich3, secondo COURT BROWNe TOUGH52: <>.Deponeva inoltre a/ayore dell'associazione al paio 2I il /atto che il Ph l possedesse satelliti ben visibili quali sono quelli del paio 21 rispetto a quello 22. Gli studi autoradiogra/ici non avevano a questo riguardo portato elementi sostanziali ai fini differenziativi per l'incostanza, tranne in rare eccezioni 17s, delle modalita replicative a livello di questo gruppo di cromosomi 92, 190, 195 Oggg dopo gli studi in fluorescenza e l'applicazione delle tecniche di banding appare con]ermata l"appartenenza del cromosoma Ph I al paio cromosomico pih Iungo del gruppo G.

HUNGERBORD159 in 1960 were the first to show, in chronic myeloid leukemia (CML), the presence of a peculiar chromosomal anomaly ('a cancer cell marker') characterized by the reduced dimensions of one of the small acrocentric chromosomes belonging to G group (fig. 1 ). This reduction which concerned the long arms of one of the small chromosomes, was confirmed almost at the same time by BAIKIE et al. 8 and later on documented by many other authors 14, 26, 78, 93, 130,20v The chromosomal alteration was cailed Philadelphia chromosome as a compliment to the locality where the discovery was made and, more synthetically Ph I, according to the abridged nomenclature agreed at Denver (1960). This chromosome was for a long time considered as a chromosome of pair 2 1 of G group seeing that, according to COURT BROWN and TOUGHS2: 'in good preparations of cells containing phIchro mosome two of the three normal acrocentrics are appreciably smaller than the remaining one'. Furthermore, in favour of association to pair 21 was the fact that Ph I had quite visible satellites, as are those of pair 21 in respect to 22. Autoradiographic studies in this respect have led no substantial elements for differentiating purposes owing to the changeableness, save for rare exceptions 1us, of the replication modalities at level of this group of chromosomes 92, 190, 195. Actually, after the studies in fluorescence and the application of banding techniques, the belonging of Ph ~ chromosome to the longest chromosomal pair of G group seems to be confirmed.

A) CARATTERISTICHE DEL CROMOSOMA FILADELFIA

A) CHARACTERISTICS OF THE PHILADELPHIA CHROMOSOME

Dopo le prime sporadiche segnalazioni, attualmente l'esame di Paste casistiche cliniche 74. 205, 216, 219 ha consentito una migliore precisazione delle caratteristiche del cromosoma Ph I.

After the first sporadic information, at present the examination of a large number of clinical cases 74, 205,216,219 has made it possible to obtain a better specification of the characteristics of Ph ~ chromosome. a) It would appear to be present in medullary cells, in peripheral blood cells

a) Esso sarebbe presente nelle cellule midollari, in quelle del sangue periferico 240

G. CASTOLDI

(limitatamente a quelle di origine leucemica ss, 60, 156) ed in quelle di origine splenica 197.

(only for those of leukemic origin 35,6o, 156)and in those of splenic origin 197

b) Cellule eritroidi e megacariociti sarebbero anch'essi portatori dell'anomalia cromosomica. In questo senso deporrebbero le ricerche di TRUJILLO e OHNo 21o con la documentazione spettrofotometrica di residui di emoglobina tra i cromosomi di metafasi ben distese contenenti il Ph l. Altre documentazioni indirette riguardano il rapporto numerico tra le cellule attivamente dividentesi osservate in preparazioni citologiche e metafasi contenenti il cromosoma Ph I ~ol, 14o, oppure la documentazione di granuli di ferro dispersi tra i cromosomi, evidenziati con la tecnica citochimica di Perls 5~ o ancora, infine, la dimostrazione autoradiogra]ica della incorporazione di SgFe in meta/asi contenenti il Ph 1 177. L'evidenza dell'anomalia nelle cellule megacariocitarie sarebbe anch'essa indiretta e documentata dalla ]requente reperibilitd del Ph l in duplicato in meta]asi tetraploidi o in numero superiore in meta/asi poliploidi, sia a livello midollare, sia a livello di versamenti sierosi associati alla LMC ~5, 28 (figg. 2, 3, 4, 5 e 6).

b) Also erythroid cells and megakaryocytes would appear to be carriers of the chromosomal anomaly. This seems to be the result of the researches made by T~IJJILLO and OHNO 210 with a spectrophotometric documentation of hemoglobin residues among the chromosomes of well spread metaphases which include Phk Other indirect documentations concern a numerical ratio between actively dividing cells, which were observed in cytologic preparations and metaphases containing Ph I chromosome 101, 140, or else documentation of iron granules scattered amongst chromosomes, evidenced by means of the cytochemical technique of Perls so, or also finally an autoradiographic demonstration of the incorporation of SgFe into metaphases containing Ph Im. The evidence of an anomaly in megakaryocytic cells would also seem to be indirect and documented by a frequent tracing of Ph ~in duplicate in tetraploid metaphases or in higher number in polyploid metaphases, both at a medullary level and in the serous effusions associated with CML is, 28(figs 2, 3, 4, 5 and 6).

'c) Linfociti stimolati in presenza di Fitoemagglutinina (PHA) e fibroblasti non conterrebbero il cromosoma PhL Tall reperti dimostrerebbero la partecipazione unicamente mielopoietica alla proliferazione morbosa 8, s2, 69. Anche nei fibroblasti midollari ottenuti per coltura di /rustoli midollari di pazienti affetti da LMC il Ph I 8 assente. Secondo MANIATIS e Coll. 15ocib escluderebbe la presenza dell'anomalia nelle cellule mesenchimali midollari indifferenziate e la eonfinerebbe ad elementi ematopoietieamente pii~ differenziati quali l'emocitoblasto mieloide e le cellule da esso derivate. d) L'anomalia cromosomica sarebbe presente nel midollo ed anche nel sangue periferico prima di ogni evidenziazione clinica. Tall dati si riferiscono ai concetti oggi ben noti di reduplicazione

c) Lymphocytes stimulated in the presence o/ Phytohaemagglutinin ( P H A ) and fibroblasts do not appear to contain the Ph I chromosome. These reports show that there is only a myelopoietic participation to the morbid proliferation , s2, 69. ph i is also missing in fibroblasts obtained through the culture of bone marrow particles of patients suffering from CML. According to MAmATIS et al. ~sothis would exclude the presence of the anomaly in non-differentiated medullary mesenchymal cells and would limit it to more hematopoietically differentiated elements such as myeloid hemocytoblast and derived cells. d) Chromosomal anomaly would seem to be present in the marrow and also in peripheral blood before any clinical evidence. These data refer to concepts of cellular reduplication today well 241

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

cellulare (doubling time secondo GAL85) e di riconoscibilit~ clinica della malattia. E noto che il quadro ematologico periferico pub essere anomalo gi~ alcuni anni (circa cinque nel caso della LMC) prima chela forma leucemica sia clinicamente rilevabile in base ai sintomi pih appariscenti (leucocitosi, splenomegalia, malessere manifesto, anemia). Il Ph I ~ stato ritrovato a questo riguardo in numerosi casi di diagnosi incerta, in cui successivamente si ebbe lo sviluppo di una conclamata situazione leucemica, come in uno dei primissimi casi da noi segnalati in letteratura 26.

known ('doubling time' according to GALTON85) and clinical picture of the disease. It is well known that the peripheral hematologic picture may have already been anomalous for some years (about five in the case of CML) before the leukemic form is clinically ascertainable on the ground of the most prominent symptoms (leukocytosis, splenomegaly, manifest discomfort, anemia). Ph I was found, in this connection, in many cases of uncertain diagnosis, where subsequently a definite leukemic situation developed, as in one of the very first cases pointed out by us in literature 26.

e) L'anomalia cromosomica pub essere sempre osservata anche nel midollo osseo di pazienti in fase di remissione. dimostrato che in fase di remissione della LMC, parallelamente al miglioramento del quadro morfologico, si viene osservando la scomparsa del Ph r nel sangue periferico, soprattutto in relazione al diminuire degli elementi immaturi o dividentisi ss. Nel midoUo osseo le indagini pih accurate tendono invece a confermare la presenza dell'anomalia eromosomica (Ph I) anche nelle fasi di remissione clinica: la scomparsa del Ph I dovrebbe essere imputata pih frequentemente alla cattiva qualit~ delle preparazioni e all'esiguo numero di metafasi ottenibili in queste condizioni 2~9.Tuttavia quadri midollari con cellule sicuramente prive di Ph I sono stati dimostrati in non poche forme di LMC come, ad esempio, in alcuni casi osservati all' esordio clinico della malattia, in cui le cellule contenenti il Ph ~ erano molto scarse in rapporto alla massa degli elementi mieloidi proliferanti. ~ stato suggerito che in questi casi potessero coesistere due cloni a livello midollare, l' uno con cariotipo normale e l' altro p h i + 33, z~s

e) Chromosomal anomaly may be evidenced also in the bone marrow of patients in remission stage. It is demonstrated that in the stage of CML remission, in parallel to an improvement of the ,norphologic picture, the disappearance of Ph I in peripheral blood is becoming evident particularly in connection with a diminution of immature or dividing elements 3s. As regards bone marrow the most accurate researches tend to confirm the presence of the chromosomal anomaly (Ph ~) also in clinical remission stages: the disappearance of Ph ~ should be more frequently attributed to the bad quality of preparations and to the very reduced number of metaphases obtainable under such conditions 219 However medullary pictures with cells surely without Ph ~ have been demonstrated in some forms of CML like, for instance, in some cases observed at the clinical onset of the disease where cells containing Ph ~were very few in comparison to the mass of proliferative myeloid elements. It has been suggested that in these cases two clones might coexist at medullary level, one with normal karyotype and the other p h i + 33, 215

f) L'anomalia cromosomica non ~ congenita, non essendo dimostrabile al momento del concepimento (zigote). Depongono a favore di questa interpretazione sia il fatto che l'aberrazione cromosomica b presente soltanto nelle ceUule di origine mieloide e non in altri tessuti, sia il fatto che essa non ~ stata

f) Chromosomal anomaly is not congenital, as it cannot be demonstrated at the conception time (zygotic). One finds in favour of this interpretation the fact that the chromosomal aberration is present only in cells of myeloid origin and not in other tissues and the fact that it has been not found

TON

242

G. CASTOLDI

trovata in gemelli monoovulari di pazienti a//etti da LMC 17, 6i, 9,, 96, i16,m, 2~9,220 0 in /igli nati da genitori con LMC 9. Questi ultimi AA., studiando aggregazioni /amiliari di LMC, trovarono il Ph I helle celluIe midollari di un paziente con LMC la cui madre era morta per la stessa malattia. Tuttavia non poterono identi/icare cellule Phz + nelle cotture di fibroblasti sottocutanei, convaIidando indirettamente per questa via la natura acquisita dell'aberrazione cromosomica. Analogamente il Pff non era presente neUe colture di sangue peri/erico e di fibroblasti di una ragazza con leucemia acuta la cui madre era deceduta per LMC. Esiste tuttavia una segnafazione 2o6, peraltro isolata, in cui il ritrovamento del Ph z in gemelli monoovulari ed in un loro discendente con LMC suggerirebbe come, in alcuni casi, la [orma leucemica possa essere geneticamente determinata.

in monoovular twins of patients suffering from CML 17,61,94,96, n6, 137,219,22o or in children of parents suffering from CML 9. These last mentioned authors, studying family aggregations of CML, found Ph ~ in the bone marrow cells of a patient suffering from CML, whose mother had died of the same disease. However Phi+ cells could not be identified in cultures of subcutaneous fibroblasts, thus indirectly corroborating by this way the acquired nature of chromosomal aberration. Similarly Ph I was absent in cultures of peripheral blood and fibroblasts of a girl suffering from acute leukemia, whose mother had died of CML.

B) ORIGINE DEL CROMOSOMA FILADELFIA

B) ORIGIN OF THE PHILADELPHIA CHROMOSOME

Tra le varie ipotesi prospettate (tab. 1) per chiarire la mor/ogenesi del Ph I, quella che ammette la delezione di una porzione di materiale cromatidico di un autosoma del gruppo G ~ la pi~ semplice e verosimile. RUBKIN e Coll. 1s6 hanno anche calcolato, sulla base di studi spettro/otometricL la perdita di materiale interessata in questa delezione, aggirantesi in media intorno al 40 % ma variabile, evidentemente, da caso a caso.

Among the various hypotheses which have been put forward (tab. 1) so as to clarify the morphogenesis of Ph I, the simplest and most likely one seems to be that which admits the deletion of a portion of chromatidic material of an autosome belonging to G group. RUDKIN et al. '~ have also calculated, on the basis of spectrophotometric studies, the loss of material connected with this deletion, which is about 40 %, but obviously changing from case to case. However the deletion site is still a matter for discussion: whilst in fact the loss of chromatidic material in the telomerle region would lead to the formation of an unstable centric fragment (owing to possible further rearrangements effected by the free chromatidic portions in way of the deletion), a deletion of an intercalary type should keep the stability of the telomeric portion with reproduction of a deficient but stable chromosome 1~4.In any case this last mentioned type of deletion (intercalary)

Tuttavia la sede della delezione b tuttora oggetto di discussione: mentre in]atti la perdita di materiale cromatidico in corrispondenza della regione telomerica porterebbe alla ]ormazione di un ]rammento centrico instabile (per i possibili riarrangiamenti ulteriori ad opera delle porzioni cromatidiche libere in corrispondenza della delezione ), una delezione di tipo intercalare dovrebbe mantenere la stabilit?t della porzione telomerica, con riproduzione di un cromosoma deficitario ma stabile 164. In ogni caso,

There is however a communication ~ which remains at any rate a single case in which the finding of Ph x in monoovular twins and in a sibling of them suffering from CML would suggest that in some cases the leukemic form can be genetically determined.

243

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

quest'ultimo tipo di delezione (intercalare) dovrebbe verificarsi per e//etto di una duplice delezione in un breve braccio cromatidico quale quello di un cromosoma G e quindi dovrebbe essere un evento assai in/requente in natura 11o Queste difficolt~ interpretative rimangono anche per ammettere che il segmento intercalare deleto vada a traslocarsi su di un altro cromosoma. H s u ,0 ammetterebbe come possibile invece il fatto chela delezione possa ef[ettivamente intervenire qualora il cromosoma G dell'uomo risultasse fornito, come il cromosoma I dell'hamster cinese, di un telomero interstiziale, in modo tale che una rottura unica in questa porzione, preservando una minima porzione telomerica utile, manterrebbe la stabilit?z della regione terminale del cromatide. Recentemente b stata proposta anche la possibilit~ che il Ph I emerga da un processo di inversione pericentrica, essendo stato osservato un Ph I di tipo metacentrico di grandezza eomparabile a quella degli altri cromosomi del gruppo G 29, 191 Secondo alcuni AA. la traslocazione del ]rammento deleto su di un altro cromosoma appare come un'ipotesi non realistica, per il [atto che finora non ~ stata sicuramente osservata. Tuttavia va considerato il ~atto che la traslocazione di porzioni minimali di materiale cromatidico risulta di di[ficile dimostrazione, soprattutto quando vengano interessati cromosomi di grande taglia m. Una traslocazione coinvolgente cromosomi di piccole dimensioni appare invece meglio evidenziabile, come appunto b il caso segnalato da BOTTURA e COOTINHO29 in cui il Ph I risultava come e//etto di una delezione con traslocazione di materiale cromatidico su di un altro cromosoma G: t ( G / G , P f f ) . Infine, secondo un'ultima interpretazione patogenetica, il Ph I potrebbe rappresentare un' unit?t completamente nuova nell'ambito del cariotipo della LAfC, rimpiazzante uno dei piccoli acrocentrici del gruppo G. Se il Pff rappresenta la perdita di un certo numero di geni, ~ improbabile rut-

244

should take place as a result of a double deletion in a short chromatidic arm such as that of a G chromosome and should therefore be a very infrequent event in nature 110. These difficulties of explanation subsist also for admitting that the deleted intercalary segment moves on another chromosome. H s v 110would instead admit as possible the fact that deletion could really take place if G chromosome of man should be found to possess, as the I chromosome of Chinese hamster, an interstitial telomere so that a single breakage in this section, preserving a minimum useful telomeric portion, would keep the stability of the chromatidic terminal region. Recently, the possibility has also been put forward that Ph I may emerge from a process of pericentric inversion, as a Ph i of metacentric type has been observed which is comparable in size to the other chromosomes of G group 29, 191. According to some authors, the translocation of the deleted fragment on another chromosome seems to be a non realistic hypothesis, seeing that up to now it has never been surely observed. However, the fact has to be considered that a translocation of minimal portions of chromatidic material is difficult to demonstrate, above all when large size chromosomes are involved lsl. On the other hand, a translocation involving small size chromosomes seems easier to be evidenced, as in fact it is the case mentioned by BOTTURA and COUTINHO 29, where Ph I appeared as the consequence of a deletion with translocation of chromatidic material on another G chromosome: t(G/G,phI). Finally, according to a last pathogenetic interpretation, Ph I might represent a completely new unit within the range of CML's karyotype replacing one of the small acrocentrics of G group. If Pht represents the loss of a certain number of genes, it is unlikely however

Fig. 1 - Metafase pseudodiploide e relativo cariotipo dimostrante il cromosoma Ph'. Pseudodiploid metaphase and corresponding karyotype showing Ph ~ chromosome.

245

Fig. 2 A-B - Striscio da versamento pleurico in paziente affetto da LMC. Accanto a numerosi elementi della serie granuloblastica sono osservabili anche megacariociti. Colorazione May-Griinwald-Giemsa, 1.300 x. Smear from pIeuraI effusion in a patient affected by CML. Tn addition to many elements of the granuloblastic series also megakaryocytes are visible. May-Grtlnwald-Giemsa staining, x 1,300.

247

Fig. 3 - Meta/ase iperdiploide (69 cromosomi) contenente 2 cromosomi Pht (/recce). (Preparazione da versamento pleurico in paziente a//etto da LMC). Hyperdiploid metaphase (69 chromosomes) containing 2 Ph I chromosomes (arrows). (Preparation from pleural effusion in a patient affected by CML). 249

q~

~o o

ka

ca

251

Fig. 5 - Metafase poliploide (299 c#omosomi) contenente 8 cromosomi Ph ~ (/recce). (Preparazione da versamento pleurico ). PolypIoid metaphase (299 chromosomes) containing 8 Ph I chromosomes (arrows). (Preparation from pleural effusion).

253

eq 9

va

e:m

~.>

2v ~ va

9

9

~8

255

Fig. 7 - ~fetaJasi provenienti da pazienti con affezioni diverse e contenenti cromosomi simili al Phi: A) leucemia mieloblastica acuta; B) trombocitemia; C) eritroleucemia; D) cromosoma piccolo acrocentrico con rottura cromatidica del t~raccio lungo (da midollo di paziente trattato con elevate dosi di cloram/enicolo). Metaphases coming from patients With various disorders and containing chromosomes similar to PhX: A) acute myeloblastic leukemia; B) thrombocythemia; C) erythroleukemia; D) small acrocentric chromosome with chromatidic break of the long arm (from marrow of patient treated with high doses of chloramphenicol).

257

Fig. 8 - Metafase pseudodiploide contenente il cromosoma Ph r appartenente al paio scarsamente fluorescente dei cromosomi del gruppo G. (Osservazione in fluorescenza dopo colorazione con chinacrina). Pseudodiploid metaphase containing Ph ~ chromosome belonging to the less fluorescent pair of G group chromosomes. (Observation in fluorescence after staining with quinacrine).

259

Fig. 9 - Metafase di soggetto normale ( c3) sottoposta a tecnica di ,~ banding ~>. (Denaturazione a caldo in tampone /os]ato). Metaphase of a normal subject ( c~ ) submitted to 'banding' technique. (Denaturation with heating in phosphate buffer).

261

o

z

o

.~

o

~.~

.SN o J

.~'~ .~ ~

263

G. CASTOLDI

acquired defect

present only in the myeloid cells not found in monozygotic twins of patients with CML not found in the cells of children born from parents with CML a) deletion

Ph'

terminal deletion of the long arms of a G chromosome (unstable centric fragment) intercalary deletion of the long arms of a G chromosome (stable deficient chromosome)

b) pericentric inversion (metacentric G chromosome of normal size) c) translocation (reciprocal translocation of chromatidic material from a G chromosome to another chromosome) d) a new chromosoma! unity replacing one of the G group chromosomes (?) inherited defect

not yet proven

Tabella 1 - Origine del crornosoma Filadelfia. Origin of the Philadelphia chromosome.

tavia ammettere che questo deficit possa conferire alla cellula leucemica tutte quelle caratteristiche che la contraddistinguono, anche se non esistono prove in contrario. Questa delezione potrebbe essere semplicemente l'espressione deIl'azione di virus (virus EB) che sappiamo essere in grado di produrre aceentuazione delle costrizioni secondarie in cromosomi del gruppo C in corso di lin]omi 41, lS6, oppure di altri agenti virali probabilmente dotati di capacit~ lesive altamente selezionate a liveUo di singoli cromosomi, come appare recentemente accertato per alcuni cromosomi del gruppo E m. ~ tuttavia molto dif[icile enucleare, nel determinismo delle aberrazioni cromosomiebe, l'influenza esatta esplicata dagli agenti virali, dal momento che, per quanto concerne Ia LMC, sono noti casi Phi+ strettamente correlati a pregresse esposizioni radioatrive32, lOS,114,119,2020 all' applicazione prolungata di radiazioni a scopo terapeutico

to admit that this deficit may give to leukemic cells the traits by which they are distinguished, even if there is no evidence for the contrary. This deletion might simply be the expression of the action of a virus (EB virus) which we know is able to produce an increase in secondary constrictions in chromosomes of C group during lymphomas 41, 136,or of other viral agents probably possessing highly selected noxious capacities at the level of single chromosomes, as seems to have been recently ascertained as regards some chromosomes of E group ls3. It is however very difficult to enucleate the exact influence developed by viral agents in the determinism of chromosomal aberrations seeing that, as regards CML, there is knowledge of Ph I + cases which are strictly correlated to previous radioactive exposures 32, 102, H4, 119,2o2 or to extended application of radiations for therapeutic purposes 67,

C) CLASSIFICAZIONE CITOGENETICA D E L L E F O R M E DI L M C

C)

Tenendo presente criteri strettamente limitati ai risultati deUe indagini citogenetiche, possono essere prese in considerazione, ai [ini classi[icativi, essenzial-

Keeping in mind criteria strictly limited to the results of cytogenetic researches two forms of chronic myeloid leukemia may essentially be taken into

88, 90

67, 88, 90

CYTOGENETIC

CLASSIFICATION

OF

CML FORMS

265

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

mente d u e / o r m e di leucemia mieloide cronica, quelle con Ph I presente (Ph I + ) e quelle con Ph I assente ( P h C - ) . Sinorail gruppo meglio caratterizzato di pazienti con LMC Ph C - ~ quello delle ~orme in/antili, le quali peraltro sono anche dinicamente alquanto diverse dalle /orme dell'adulto (per la lin/oadenopatia, le in/ezioni relativamente /requenti, i/enomeni emorragici sovrapposti). Negli adulti, la di//erenziazione clinica tra pazienti con e senza Ph I ~ meno facile. CARBONE e Coll. 36, comparando 13 soggetti Ph C - con 47 sog~etti p h i + , trovarono che gli unici indici ehe dif/erenziavano le due popolazioni in esame erano costituiti da un vaIore medio di piastrine e di globuli bianchi pih basso negli individui Ph L--. SuUa base dei dati attualmente a disposizione, riteniamo tuttavia che sia possibile elaborare una ulteriore classificazione citogenetica delle /orme di LMC (tab. 2).

consideration for classification purposes, those with the presence of Ph I ( p h i + ) and those where Ph I (Pht---) is absent. Up to now the best characterized group of patients with CML Ph ~--- is that of infantile forms, which are however clinically very different from the adult forms (on account of lymphadenopathy, rather frequent infections, added hemorrhagic phenomena). In adults clinical differentiation between patients with and without Ph I is less easy. CARBON~, et al. 36, comparing 13 Ph ~--- patients with 47 p h i + patients found that the only elements differentiating the two populations under examination were represented by a mean value of platelets and leukocytes, lower in Ph I--- individuals. However, on the ground of the available data, we think that it is possible to work out a further cytogenetic classification of CML forms (tab. 2).

D) FORME P h I +

D) p h i + FORMS

1) Forme con Ph I come unica anomalia

1) Forms with Ph I as the only anomaly

a) Forme con linfonodi: si tratta di mani/estazioni assai gravi dal lato prognostico. In genere il decorso di queste situazioni ~ particolarmente accelerato, anche allorchd a livello dei Iin/onodi la sostituzione cellulare non ~ totalmente

a) Forms with lymphoadenopathies: these are very severe manifestations from a prognostic point of view. As a rule, the course of these situations is particularly fast even when cellular substitution at lymphnodal level is not fully

typical CML with lymphoadenopathy

PhI+

a) as the only detectable without splenomegaly chromosomal aberration with erythroid or thrombocytic hyperplasia with high LAP b) phI,XO c) PhX+ other chromosomal aberrations d) phi+ acute morphologicalpicture ab initio

p h I- -

a) in infancy b) Emil-Well and S4e's variant c) eosinophilic leukemia d) Freireich's syndrome (?)

CHRONIC MYELOGENOUS LEUKEMIA

Tabella 2 - Classificazione citogenetica della leucemia mieloide cronica. Cytogenetic classification of chronic myelogenous leukemia.

266

G. CASTOLDI

rappresentata da blasti, ma anche da elementi pitt maturi. In questi casi il Ph I, oltre che nel midollo osseo e nel sangue peri/erico, ~ stato dimostrato anche a livello del tessuto lin[oghiandolare 117.ls8

represented by blasts but also by more mature elements. In these cases Ph ~, as well as in bone marrow and peripheral blood, has been shown to exist also at level of the lymphoglandular tissue 117, 158

b) Forme senza splenomegalia: sono quadri tuttora assai poco documentati, nei quali riesce difficile elencare caratteristiche comuni di base. In realtgl non sempre l'assenza o la scarsa consistenza della milza pub essere attribuita ad una particolare modalit~ evolutiva della/orma morbosa; in alcuni casi si pub effettivamente trattare di mani/estazioni iniziali di LMC in cui lo splene non ha ancora raggiunto dimensioni considerevoli; in altri casi si potrebbe trattare inveee di mani/estazioni giA datanti da lungo tempo in cui un trattamento citostatico, interrompendo un labile equilibrio proli/erativo sino aUora mani/estato, verrebbe ad affrettare il decorso clinico e ad impedire l'estrinsecazione pitt tardiva della splenomegalia. In generale in/atti le /orme di questo tipo sinora descritte appaiono caratterizzate da un decorso assai poco /avorevole 2o3

b) Forms without splenomegaly: these are still scarcely documented pictures, where it is found difficult to list common basic characteristics. As a matter of fact, the absence or poor consistency of the spleen may be attributed to a particular evolutive model of the morbid form; in some cases they may be initial manifestations of CML where the spleen has not yet reached a considerable size; in other cases we may have instead manifestations which were present for quite a long time and in which a cytostatic treatment, by interrupting a transient proliferative equilibrium appearing till then, would hasten clinical course and prevent a more tardive rise of splenomegaly. Indeed, the forms of this type described up to now are found to be characterized by far from favourable course 20s

c) Forme con eritremia e trombocitemia: le mani/estazioni eritremiche associantesi all' esordio o nel decorso di una leucemia granulocitica cronica non sono eventi isolati. Le prime segnalazioni di studi citogenetici in corso di eritremia riguardavano appunto episodi eritremici in soggetti con LMC. Pitt recentemente tali mani/estazioni hanno consentito di con/ermare la presenza dell'anomalia cromosomica (Ph I) anche in precursori della serie rossa e megacariocitaria.

c) Forms with erythremia and thrombocythemia: erythremic manifestations which are found in the onset or during the course of a chronic granulocytic leukemia are not isolated events. The first communications of cytogenetic studies during erythremia related in fact to erythremic circumstances in patients suffering from CML. More recently these manifestations have made it possible to confirm the presence of chromosomal anomaly (Ph I) also in precursors of the red and megakaryocytary series.

d) Forme con livello di fosfatasi leucocitaria alcalina aumentato: la valutazione citochimica del livello di /os[atasi alcalina leucocitaria (FAL) si ~ /requentemente dimostrata in accordo con la presenza del Phq L'intensit?~ della reazione ~ risultata in[atti estremamente bassa in pressoch3 tutti i casi di LMC classica in cui b stato ritrovato il cromosoma Ph I. A questo riguardo si ~ supposto che potesse esistere una stretta re-

d) Forms with increased raze o~ leucocyte alkaline phosphatase: the cytochemical evaluation of the rate of leucocyte alkaline phosphatase (LAP) has frequently shown to be in accordance with the presence of Ph I. The reaction has been in fact of extremely low intensity in nearly all cases of typical CML where the Ph I chromosome has been detected. In this connection, the supposition was made that there could exist 267

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

lazione, anche in accordo con quanto k stato ritrovato neUa sindrome di Down (elevazione dell'indice /os/atasico), tra geni controllanti l'attivitgt della [os/atasi alcalina e materiale deleto a livello del cromosoma Pff . In realt~ sono oggi noti casi in cui il livello di F A L ~ elevato e la /orma morbosa b caratterizzata daUa presenza del cromosoma Pff," b noto d' altronde che un livello di F A L inizialmente basso pub innalzarsi durante le remissioni della LMC, oppure nel corso di una gravidanza o, infine, nella tras/ormazione acuta o, ancora, a causa di una in/ezione intercorrente.

a strict connection, in agreement also with what had been found in Down's syndrome (increased phosphatasic index), between genes governing the activity of alkaline phosphatase and deleted material at level of the Ph ~chromosome. In reality, we know today cases in which the LAP rate is high and the morbid form is characterized by the presence of the Ph I chromosome; it is a known fact, on the other hand, that an initially low LAP rate may become higher during remissions of CML, or else in the course of a pregnancy or, finally, owing to an intercurrent infection.

2) Forme con cariotipo 46,XO,Ph x Sono ri/eriti in letteratura numerosi casi di leucemia mieloide cronica in cui sia il midollo osseo che il sangue peri/erico contenevano cellule P h i + con corredo a 45 cromosomi per perdita di un piccolo cromosoma acrocentrico. Non sempre in tutti i casi riportati era possibile identificare esattamente il piccolo cromosoma acrocentrico mancante 5, 6s, mentre in altri casi, pik numerosi, era stato possibile ri/erire il cromosoma mancante ad un Y ~" 143,196.208.Pressoch~ in tutti questi pazienti sia i lin/ociti che i fibroblasti possedevano un cariotipo normale. Gid nel 1963 TOUCH e Coll. 2o8suppoHero che i pazienti con cellule XO,Phl qpotessero appartenere ad un ben definito sottogruppo di LMC. SPEEI) e LAWLER 1~ attribuirono alla presenza di un si//atto cariotipo la possibilit~t di un decorso clinico estremamente protratto in questi pazienti. DE GROUCHY e Coll. s6 sottolinearono infine il [atto che i pazienti presentanti questo cariotipo non avevano avuto figli. DaUa somma di tutti questi dati era stato possibile dedurre l'esistenza di una variante della LMC caratterizzata dal decorso protratto e dalla in/ertilit?t dei maschi 169. Poich~ l'assenza del cromosoma Y sembra relegata esclusivamente a livello midollare, risulta molto di/ficile spiegare su questa base la scarsa /ertilit~ dei pazienti in questione, sebbene siano stati invocati /enomeni di non disgiunzione nelle mitosi di

2) Forms with karyotype 46,XO,Ph + In literature are mentioned many cases of chronic myeloid leukemia where both bone marrow and peripheral blood contained P h i + cells with 45 chromosomes owing to the loss of a small acrocentric chromosome. It was not always possible, in all reported cases, to exactly identify the missing small acrocentric chromosome 5, 68, whilst in other more numerous cases it had been possible to refer the missing chromosome to a Y s+, 143,196,208 In nearly all these patients both lymphocytes and fibroblasts had a normal karyotype.

268

Already in 1963 TOUCH et al. ~ supposed that patients with XO,PhIq - cells might belong to a well defined subgroup of CML. SPEED and LAWLER196ascribed the possibility of an extremely extended clinical course as regards these patients to the presence of a karyotype of such a nature. Finally DE GROUCHY et al. s6 emphasized the fact that patients having this karyotype had no children. It was possible to infer from the whole of these data the existence of a CML variant characterized by an extended course and by infertility of males 169 As the absence of the Y chromosome seems to be confined solely at bone marrow level, it is very difficult to give an explanation on this ground as to the poor fertility of such patients, although phenomena of non-disjunction in the mitosis of these patients or a frequent loss of Y chromo-

G. CASTOLDI

questi pazienti o /requente perdita di cromosomi Y nelle cellule gonadali. Lo stesso materiale sinora accumulato potrebbe d'altra parte essere insu/ficiente per trarre conclusioni generali e l'assenza di figli in questi pazienti potrebbe essere puramente casuale 19s Per quanto riguarda la seconda caratteristica e ciob il decorso protratto della malattia e la relativa benignit~ della stessa in questi pazienti, k stato supposto che il clone di cellule XO,PhI + possa essere derivato dal clone X Y , PhI + e che abbia assunto un relativo vantaggio di proli/erazione rispetto al suo ceppo originale. Il decorso protratto della malattia in questi casi verrebbe pertanto interpretato non come dovuto all'attivit~ del clone XO,PhI + , ma bens~ alla repressione competitiva nei riguardi della proli/erazione del clone X Y , Pht +.

somes in gonadal cells have been put forward and recollected in this connection. On the other hand, the same material gathered up to now might prove insufficient for drawing general conclusions and the absence of children in these patients could be merely accidental ,93 As far as the second characteristic, that is an extended course of the disease and the comparatively high benignity of the same in these patients, it has been supposed that the clone of XO,phI+ cells may derive from clone XY,PhX+ and it may have taken a certain proliferative advantage in comparison with its original strain. The extended course of the disease in these cases would thus be interpreted not as due to the activity of clone XO,Ph~+, but to a competitive repression as regards proliferation of clone XY,Ph x+ .

3) Forme con Ph I associato ad altre anomalie cromosomiche In questi casi il cromosoma Ph I pub essere associato sin dall'inizio della LMC con altre aberrazioni cromosomiche, oppure pitt/requentemente pub essere associato, nel decorso evolutivo della/orma leucemica, ad altre anomalie cromosomiche. Di questo secondo argomento verrgl ri/erito al riguardo dei cariotipi della LMC nella ]ase di subacutizzazione, mentre qui verranno prese in considerazione le /orme presentanti aberrazioni cromosomiche in aggiunta al Ph 1 sin dall'inizio del decorso clinico. I cromosomi abnormi presenti in questi pazienti possono intervenire in metafasi aneuploidi e poliploidi ~"57, 81, o3, lo9, uT, 1~. Nel paziente descritto da GOH ~3 vi erano due linee cellulari entrambe contenenti il Ph I e a 47 cromosomi, l'una caratterizzata daUa presenza di un cromosoma soprannumerario nel gruppo C e l'altra nel gruppo D. In questo paziente non vi era alcuna evidenza di acutizzazione della/orma a distanza di 1 I mesi dallo studio citogenetico. II caso ri/erito da HousToN e CollJ ~ possedeva invece una linea cellulare pseudodiploide contenente un marker metacentrico. Anche questo paziente non era an-

3) Forms with Ph I associated to other chromosomal anomalies In these cases Ph x chromosome may be associated even [rom the beginning of CML with other chromosomal aberrations or else, more frequently, it may be associated in the evolutive course of the leukemic form to other chromosomal anomalies. We shall speak on this subject in connection with karyotypes of CML in the acute phase, whilst here will be taken into consideration only forms showing chromosomal aberrations in addition to Pht even from the beginning of the clinical course. The abnormal chromosomes present in these patients may intervene in aneuploid or polyploid metaphases 1, sT, sl, 93, 109,147,18s. In the patient described by Gort 93 there were two cellular lines both containing Ph I and with 47 chromosomes, one being characterized by the presence of a supernumerary chromosome in C group and the other in D group. Eleven months after the cytogenetic study in this patient there was no evidence of an exacerbation of the form. Instead the case reported by HOUSTON et al. 109 had a pseudodiploid cellular line containing a metaeentric marker. This patient also had not yet

269

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

cora stato sottoposto a trattamento ed inoltre dimostrava una particolare lenta progressione della manifestazione leucemica. I casi descritti da ADAMS e Coll. 1 e da DE GROUCHY e Coll. s7 erano infine rispettivamente caratterizzati dalla presenza di un cromosoma minuto e da un marker G presente sia nel midoUo che nella cute. Tutti i casi sinora descritti presentavano anomalie cromosomiche giA al momento della prima caratterizzazione cromosomica: ~ noto tuttavia che con relativa [requenza nella [ase cronica dell'evoluzione leucemica possono essere osservate linee aneuploidi o pseudodiploidi contenenti cromosomi abnormi 2n.

undergone treatment and besides showed a particular slow progression of the leukemic manifestation. Finally, the cases described by ADAMS et al. 1 and DE GROUCHY et al. sv were respectively characterized by the presence of a small chromosome and a G marker present both in marrow and skin.

4) Forme mieloblastiche acute ab initio con Ph I Esiste ormai in letteratura una casistica ben documentata comprovante la presenza del cromosoma Ph I in situazioni leucemiche acute di tipo mieloblastico ab initio. Queste ]orme documenterebbero la possibilitA che il Ph ~ in condizioni particolari, soprattutto se associate ad altre modificazioni dell'assetto cromosomico, possa talora presentarsi in situazioni non strettamente connesse con la LMC. ii possibile che questi casi rappresentino forme di LMC precedentemente misconosciute o con decorso atipico. HIRSCHHORNlo6 ammetterebbe, sulla base di proprie osservazioni, che le cellule P h i + possano rappresentare elementi dotati di vantaggio selettivo nell' ambiente in cui crescono, conducenti ad una situazione quale quella rappresentata dalla LMC, ma non ad una ~ vera ~ leucemia (true leukemia). Il disordine mieloproli]erativo sarebbe rappresentato dalla condizione clinica esprimentesi come LMC che condurrebbe, a seconda della sensibilitA individuale, allo sviluppo della ]orma acuta, cio~ della ~ vera ~ leucemia. In questo senso depongono anche i risultati di HUANGe Coll. 111,secondo cui la capacitA di clonizzare sarebbe particolarmente elevata per le linee cellulari aneuploidi e pi?~ bassa per le linee euploidi e pseudodiploidi. Tale capacit~ sarebbe inoltre del tutto indipendente dal

4) Acute myeloblastic /orms ab initio with Ph 1 There is by now in literature a well documented number of cases evidencing the presence of the Ph I chromosome in acute leukemic situations of a myeloblastic type which are ab initio. These forms would support the possibility that Ph I under particular conditions, above all if associated with other modifications of the chromosomal order, may sometimes appear in situations which are not strictly connected with CML. It is possible that these cases represent CML forms which were previously unidentified or had an atypical course. HIRSCHHORN 106 admits, on the ground of his own observation, that p h i + cells may represent elements possessing a selective advantage in the environment where they grow, and leading to situations such as that represented by CML, but not a true leukemia. The myeloproliferative disorder would be represented by a clinical condition expressing itself as CML which would lead, in accordance with individual sensitivity, to a development of the acute form, i.e. 'true' leukemia. Same conclusions are reached by the findings of HUANC et al. m according to whom the capacity of cloning would be particularly high as regards aneuploid cellular lines and lower as regards euploid and pseudodiploid lines. Furthermore, such capacity would be entirely

270

All the cases described up to now showed chromosomal anomalies already at the time of the first chrom0somal characterization: it is however well known that aneuploid or pseudodiploid lines containing abnormal chromosomes may be observed in the chronic stage of leukemic evolution 21s

G. CASTOLDI

tipo istologico del tumore: linee diploidi di melanoma avrebbero capacitor clonizzante in/eriore a linee cellulari pseudodiploidi di LMC.

Recentemente, WHANG-PENG e Coll. 21ehanno condotto uno studio di revisione su 103 pazienti non selezionati af~etti da leucemia mieloblastica acuta. Circa il 70 % dei pazienti possedeva un cariotipo normale, mentre il 30 % risultava possedere linee aneuploidi. Sebbene nei pazienti con cariotipi aneuploidi non siano state ritrovate anomalie cromosomiche univoche, tuttavia il gruppo G appariva coinvolto pik ~requentemente degli altri gruppi. Quattro casi avevano il dato anamnestico della pregressa esposizione a radiazioni: di questi, 3 possedevano un cariotipo normale ed 1 possedeva un cromosoma Ph I nelle preparazioni da midollo osseo. Un altro pazienre, peraltro senza passato positivo per esposizione a radiazioni, aveva anch'esso un cromosoma Pht nelle preparazioni midoUari. WHANG-t)ENGe Coll. 21esuggeriscono di considerare queste forme come rare crisi blastiche di LMC piuttosto che ]orme di leucemia mieloblastica acuta con Ph l, in accordo con l' osservazione che esse rappresentano condizioni di LMC in cui la linea cellulare mieloblastica appare prima che si siano mani[estate le caratteristiche cliniche ed ematologiche della ]orma leucemica cronica conclamata. E) FORMEPh ~--1) Forme infantili Si tratta di mani/estazioni assai simili, dal lato morfologico, a quelle classiche della LMC e presentanti, dal lato clinico, alcune peculiaritft, come ad esempio la coesistenza di adenopatie, la presenza di eruzioni cutanee, una spiccata trombocitopenia associata talora a monocitosi e lin/ocitosi, e mani/estanti in/ine una spiccata resistenza alla terapia con busul~ano o al trattamento radioterapico. Dati pift recenti dimostrerebbero altres} caratteristiche laboratoristiche particolari, come una elevazione del livello di

independent of the histological type of turnout; diploid lines of melanoma would possess a cloning capacity lower than that of CML pseudodiploid cellular lines. WHANG-PENG et al. ~16 have recently carried out a reviewing study on 103 non-selected patients suffering from acute myeloblastic leukemia. Approximately 70 % of the patients had a normal karyotype, whilst 30 % were found to possess aneuploid lines. Although univocal chromosomal anomalies have not been found in patients having aneuploid karyotypes, nevertheless G group appeared to be more frequently involved than the other groups. Four cases had the anamnestic datum of previous exposure to radiations; out of these, three had a normal karyotype and one had a Ph I chromosome in the bone marrow preparations. Another patient, who however had no positive history of exposure to radiations, also had a Ph I chromosome in bone marrow preparations. WHANG-PENG et al. 2t6 suggest to consider these forms as rarely occurring blastic crises of CML rather than forms of acute myeloblastic leukemia with Ph I, in agreement with the remark that they represent CML conditions where the myeloblastic cellular line is manifest before the appearance of the clinical and hematologic characteristics of the overt chronic leukemic form. v.) Ph I -

FORMS

1) Infantile forms These are manifestations quite similar, from a morphological point of view, to the typical ones of CML and showing, from a clinical point of view, some peculiarities such as, for instance, the coexistence of adenopathies, the presence of rash, a marked thrombocytopenia connected sometimes with monocytosis and lymphocytosis, and finally showing a marked resistance to a busulphan therapy or to radiotherapic treatment. In addition, more recent data would show special laboratory characteristics such as

271

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

emoglobina F e quasi costantemente anomalie della quota immunoglobulinica.

a rising of F hemoglobin rate and almost always anomalies in the immunoglobulinic level.

2) Forme a polinucleati maturi (tipo Emil-Weil e S~) Si tratta di casi relativamente rari caratterizzati dalla presenza nel sangue periferico di forme quasi esclusivamente mature della serie granulocitaria. II livello di ]osfatasi alcalina leucocitaria risultato /requentemente elevato in queste condizioni 185. I reperti citogenetici in queste forme morbose non sono univoci nella letteratura: put prevalendo i casi Ph ~ - , esistono segnalazioni confermanti la presenza di un cromosoma ph 1 8~.

2) Forms with mature polynucleated (Emil-Weil and S~e type) These are relatively rare cases, characterized by the presence in peripheral blood of almost exclusively mature forms of granulocytic series. Under these conditions the rate of leucocyte alkaline phosphatase has been foundj to be frequently high 18s. Cytogenetic reports in these morbid forms are not univocal in literature; although Ph I - are prevalent, there are communications which confirm the presence of a Ph ~ chromosome ~

3) Leucemie ad eosinofili Le leucemie ad eosinofili sono state sino ad oggi oggetto di controversa discussione tra gli ematologi, essendo state di volta in volta interpretate come varianti della LMC (LMC con screzio eosinofilo ), o come estrinsecazioni del quadro morboso di malattie non correlate ad una proliferazione emopatica sistemica (collagenopatia disseminata di ENGFELDT e Z E T T E R S T R O M 71). I sostenitori di quest' ultima interpretazione banno soprattutto insistito negli ultimi tempi su di un inserimento delle due mani/estazioni (leucemia ad eosinofili e collagenopatia) in un unico quadro morboso a genesi autoimmune, estrinsecantesi, a seconda deUe caratteristiche, ora con una mani/estazione prevalente, ora con l'altra 19, m. Da coloro cbe accettano la delimitazione nosologica della leucemia ad eosinofili, viene generalmente riconosciuta l'esistenza di forme di leucemia eosinofila a cellule mature e di forme a cellule immature, a decorso acuto o cronico ~o Per quanto riguarda l'aspetto citogenetico, i casi di leucemia eosinofila descritti in letteratura e caratterizzati dalla presenza del Ph I sono assai rari 65. 9s. 122 Taluni AA. 9s hanno descritto anomalie cromosomiche diverse dal Ph 1, come ad esempio la presenza di grandi markers acrocentrici. Pi~ numerose sono le se-

3) Eosinophilic /orms o/leukemia Leukemiae with eosinophilia have been up to now a subject of controversial discussion among hematologists, having been respectively interpreted as variants of CML (CML with eosinophilic traces) or as manifestations of the morbid pic. ture of diseases not correlated to a systemic haemopathic proliferation (disseminated collagenopathia of ENGrELDT and ZETT~RSTR6M7,). The supporters of this last mentioned interpretation have above all insisted on an introduction of the two manifestations (eosinophilic leukemia and collagenopathia) into a single morbid picture with selfimmune genesis manifesting, according to the characteristics, at times through either prevailing manifestation 19, 16, Those who accept the nosological deli~ mitation of eosinophilic leukemia generally recognize the existence of forms of eosinophilic leukemia with mature cells and forms with immature cells, with either an acute or a chronic course 2o

272

As far as the cvtogenetic aspect is concerned, cases of eosinophilic leukemia described in literature and characterized by the presence of Ph I are very rare ~' 9s, 122 Some authors 9s have described chromosomal anomalies different from Ph I, such as for instance the presence of large acrocentric markers. More numer-

G. CASTOLDI

gnalazioni negative che riguardano lo studio di queste /orme morbose 21, 54, 66, 1s9. t5 verosimile ammettere chela variabilitd dei dati citogenetici, pih che una diversit~ di caratteristiche deUe leucemie eosinofile, stia a rappresentare indirettamente una diversa interpretazione clinica della ]orma morbosa di base. Le ]orme Phi+ probabilmente riflettono quadri di LMC a screzio eosinofilo, le /orme P h C - verosimilmente debbono essere ri/erite ad altre condizioni patologiche iI cui quadro midollare e periferico b giunto a simulare una leucernia eosinofila. Non b ovviamente da escludere che in tutti questi casi le tecniche citogenetiche non siano ancora in grado di mettere in evidenza le caratteristiche peculiari del clone leucernico.

ous are negative contributions regarding these disorders 2~,s4, 66, ~s9. It is likely to admit that the variability of cytogenetic data, more than being a diversity of characteristics in eosinophilic leukemiae, stands indirectly for a different clinical interpretation of the basic morbid form, Ph I + forms probably reflect pictures of CML with eosinophilic trace; Ph I forms should probably be referred to other pathological conditions the bone marrow and peripheral picture of which has come to simulate an eosinophilic leukemia. Obviously, one cannot exclude that in all these cases the cytogenetic techniques are not yet able to clarify the peculiar characteristics of the leukemic clone.

4) Sindrome di Freireich La sindrorne di Freireich riguarda una iperplasia degli elementi granulocitari, con fosfatasi alcalina leucocitaria bassa, anemia refrattaria e perdita caratteristica di un cromosoma del gruppo C nelle preparazioni midollari.

4) Freireich' s syndrome Freireich's syndrome concerns an hyperplasia of the granulocytic elements with 10w leucocyte alkaline phosphatase, refractory anaemia and characteristic loss of a chromosome of the C group in bone marrow preparations.

r) L M C P h i + E Phi-- NELL'ADULTO

F) phi+ AND Ph I - C M L

I1 problema di pazienti P h C - e purtuttavia affetti da LMC rende spesso la diagnosi difficile sotto l'aspetto clinico. Dal lato citogenetico prospetta invece situazioni ancora da meglio delineare in rapporto alia possibilit~ che effettivamente i pazienti Ph ~-- rappresentino un sottogruppo particolare di LMC. Se si prescinde da alcuni casi in cui il quadro ematologico probabilmente dissimulava una situazione mieIofibrotica zu 0 in cui probabilmente altre situazioni mieloproliferative venivano in discussione 31, ls9, esistono osservazioni ben documentate di LMC dell'adulto caratterizzate dall'assenza del cromosoma Ph 1 74, 13~,~o5,21s. Le casistiche a questo riguardo differiseono in rapporto ad alcuni dati, che rispecchiano in parte le modalitk di classificazione dei pazienti ed in parte riflettono la inomogeneitk delle osservazioni spesso basate sui ricoveri in grandi Centri ove generalmente sono studiati

The problem of Ph i - patients with CML often makes a clinically difficult diagnosis. From the cytogenetic point of view such problem evidences situations which are still to be better outlined in connection with the possibility that phL-- patients actually represent a special CML subgroup. Apart from some cases in which the haematologic picture probably concealed a myelofibrotic situation m or where other myeloproliferative situations came into being 3~. ~s9, there are well documented observations of CML of adults which are characterized by the absence of Ph ~ chromosome 74, ~39,20s,215 Case reports differ in this respect as regards some data reflecting in part classification methods of patients and are in part a reflect of the non-homogeneity of observations often based on hospitals in large towns where as a rule complex or atypical cases are studied. But, apart from

IN

ADULTS

273

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID L E U K E M I A

Pht +

age

Ph I -

younger

older predominantly men

sex

LAP

low score

low score

WBC

high

low

platelet count

high

low

basophilia incidence blastic crisis

common

uncommon

later ~//evenly distributed ~.,~

earlier

response to therapy

good

survival (median.)

40 months

poor 8 months (EzDINLIet al. 74)

31-40 months

12-15 months (WHANG-PENGet al. ~'5)

45 months

13 months (TjIo et al. 20s)

Tabella 3 - Leucemia mieloide cronica in pazientt aduIti. Chronic myelogenous leukemia in adult patients.

casi complessi o atipici. Ma, a parte queste considerazioni, ~ indubbio che le [orme Pht--- dell'adulto di[feriscono dai pazienti Pht + per una pi?~ bassa conta piastrinica e di globuli bianchi, per una scarsit~ di elementi baso[ili in peri[eria, per una maggiore componente mieloblastica midollare e peri[erica, per una pi~ precoce incidenza di crisi blastiche (anchese percentualmente queste non sono signi[icativamente incrementate rispetto alle [orme Ph ~+ ), per una pi?~ scarsa risposta alla terapia e per una sopravvivenza media decisamente in[eriore a quella delle ]orme di LMC Phi+ (tab. 3). Molto si discute sull'interessamento prevalente del sesso maschile e sull'etk neUe ]orme Ph ~---, ma in molte casistiche sono compresi anche quadri leucemici in]antili (sotto i 7 anni), per cui in talune di esse 2o5 la distribuzione per et~ ~ praticamente la stessa tra gruppi Pht + e phL--. La classi[icazione citogenetica deUe ]orme di LMC dell'adulto permette pertanto di eseguire una subclassi[icazione clinica in due sottogruppi con implica274

these remarks, there is no doubt that Ph I - - forms in adults differ from Ph I + patients on account of a lower number of platelets and leukocytes, a lack of peripheral basophilic elements, a larger bone marrow and peripheral myeloblastic component, an earlier incidence of blastic crises (even if by percentage these have not undergone an important increase in comparison to p h i + forms), also on account of a poorer answer to therapy and an average survival definitely lower than the one prevailing in Ph I + CML forms (tab. 3). Many discussions are made as to whether the male sex is prevailingly affected and as to the age in Ph I - forms, but in many case reports also infantile leukemic pictures are included (under 7 years) so that in some of them 2~ distribution according to the age is practically the same between p h i + and Ph x - groups. A cytogenetic classification of CML forms in adult subjects makes it possible therefore to make a clinical sub-classification into two subgroups showing very

G. CASTOLDI

zioni prognostiche e terapeuticbe assai importanti. Il termine di LMC risulta in questo senso appropriato soltanto per le forme Phi+, mentre le /orme Ph L--, a piir rapida evoluzione (da uno a due anni di sopravvivenza), dovrebbero essere piuttosto designate con il termine di ~ leucemia mieloide subacuta ~. Tuttavia EZDINLI e Coll. 74 banno potuto osservare che se viene vaIutato il tempo di sopravvivenza delIe /orme Ph I - , accanto ad una frazione maggiore di persone che va incontro a morte nel primo anno della mani]estazione clinica, esiste una seconda /razione, pi~ piccola, il cui decorso clinico ~ sovrapponibile a quello dei pazienti Ph r + . Una siffatta distribuzione bimodale suggerisee l'inclusione in questo sottogruppo di almeno altre due distinte popolazioni, l'una con caratteristiche ancora della LMC classica, l'ahra a decorso nettamente rapido e con caratteristiche compatibiIi con la definizione sopra proposta di ~ leucemia mieloide subacuta ~>o, per l' et?~ prevalente in cui viene a manifestarsi, di ~ leucemia acuta della vecchiaia ~ 7,

important prognostic and therapeutic implications. The CML denomination is found in this sense to be appropriate only to Ph I + forms, whilst Ph ~ - forms having a more rapid development (survival from one to two years) should rather be named 'subacute myeloid leukemia'. However EZDINLI et al. 74 have been able to note that if a valuation of survival time in Ph I - forms is made, together with a larger fraction of subjects who die during the first year of the clinical manifestation there is a second smaller fraction whose clinical course can be superimposed to that of P h i + patients. Such a twofold distribution suggests the inclusion in this subgroup of at least two more distinct populations, one still having the characteristics of typical CML and the other having a definitely rapid course and characteristics in agreement with the above suggested definition of 'subacute myeloid leukemia' and, considering the prevalent age in which it appears 'acute leukemia o~ the elderly' 74.

G) R E P E R T I CITOGENETICI NELLE CRISI BLASTICHE DELLA LMC

G) CYTOGENETIC FINDINGS IN BLASTIC

La tras/ormazione acuta della L3IC suole accompagnarsi ad una serie di alterazioni a livello cromosomico che oggi possono essere meglio inquadrate sulla base di casistiche reIativamente vaste ed omogenee. A scopo illustrativo verranno qui prese in considerazione aherazioni di tipo qualitativo e alterazioni di tipo strutturale. In alcuni pazienti (circa 1/3) la tras[ormazione acuta non comporta alcuna alterazione qualitativa del cariotipo, persistendo il Pff come l'unica alterazione dimostrabile 142,143, 219. Tuttavia nella maggior parte dei casi ( 2 / 3 ) il cariotipo pub presentare anomalie di vari autosomi 14, 184,lSZ e spesso in associazione con la comparsa di aneuploidia 6. 18, 22, 81,

Acute transformation of CML is generally accompanied by a series of alterations at chromosomal level which can be now better outlined on the ground of relatively wide and homogeneous case reports. For illustration purpose qualitative and structural alterations will be here taken into consideration.

CRISES OF CML

In some patients (about 1/3) acute transformation involves no qualitative alteration of the karyotype, Ph I persisting as the only demonstrable alteration 142.143,219.However, in most cases (2/3) the karyotype may show anomalies of various autosomes 14, 184,157 and often in association with the appearance of aneuploidy 6, Is, z2, 51, 93, 146, 165, 196

93, 146, 165, 196

L'iperdiploidia rappresenta il reperto pilt frequente, sebbene siano state segnalate anche Iinee pseudodiploidi e per/ino

The most frequent finding is the hyperdiploidy, although also pseudodiploid and even hypodiploid lines have 275

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

ipodiploidi. La comparsa di linee iperdiploidi in corso di LMC b stata anche utilizzata da taluni AA. 141come segno premonitore di acutizzazione della /orma morbosa, mentre la comparsa di ipodiploidia b stata assunta da CANELLOS e Coll. u come segno di /avorevole risposta al trattamento (nel caso specifico prednisone + vincristina ) in corso di crisi blastica della LMC. E molto probabileche le ceUule blastiche siano responsabili di queste alterazioni del cariotipo, poich3 generalmente le meta/asi abnormi scompaiono durante la remissione clinica 34, 87, 178 Anomalie addizionali possono intervenire in maniera progressiva via via c h e l a malattia avanza nel tempo, verosimilmente in rapporto anche al trattamento e//ettuato e alla resistenza da esso provocata in alcune linee ceUulari

been reported. The appearance of hyperdiploid lines during CML has been utilized by some authors 141 as a premonitory sign of exacerbation of the morbid form, whilst the appearance of hypodiploidy was taken by CANELLOSet al. 34 as a sign of favourable answer to treatment (in the specific case prednisone + vincristine) during a blastic crisis of CML. It is quite likely that blastic cells are responsible for these alterations of the karyotype, because abnormaI metaphases generally disappear during clinical remission 34, 87, 175 Further anomalies may intervene in a progressive way as the disease advances with time, probably in connection with treatment effected and with resistance brought about by the same in some cellular lines 79, 166,215

79, 166, 215

Le anomalie di tipo strutturale non consistono semplicemente nella perdita 0 nell'aggiunta di cromosomi apparentemente normali (trisomia C)123, ma spesso sono rappresentate da veri e propri markers, quali grandi acrocentrici 0 submetacentrici, come spesso accade in altri tipi di tumori 16. In questi casi sono interessati tutti i gruppi cromosomici ma, come pub essere previsto, sono soprattutto i gruppi C e G a d essere pih /requentemente coinvolti 7o, 165-m, ~u, 215 Fra le anomalie strutturali va annoverato anche il /enomeno particolare del ritrovamento di uno 0 pih cromosomi Ph 1 neUe cellule blastiche della LMC in/ase di subacutizzazione. Generalmente tall cromosomi sono presenti in linee cellulari contenenti 47 0 48 cromosomi, ma numerosi altri cariotipi sono stati segnalati. II Ph I pub essere presente triplicato n4, 192 0 reduplicato (diplo-Pff secondo HAMVV.LlO2) O, pih /requentemente, duplicato nelle /orme di subacutizzazione e nelle /asi blastiche terminali ss, 64, 7o, 72, 101, 120, 124, 125, 126, 127, 128, 132, 115, 170, 183, 199, 200

Questo /enomeno sarebbe connesso con la legge generale che l'induzione di una anomalia cromosomica /avorisce, per la minore stabilitgt dell'assetto cromosomi-

276

Anomalies of structural kind do not consist simply in loss or addition of apparently normal chromosomes (C trisomy) 123 but are often represented by markers such as large acrocentrics or submetacentrics, as is often the case in other types of turnouts 16. In these cases all chromosomal groups are involved, but as it may be expected, those which are most frequently affected are C and G groups 70, 165-172,204, 215. Among structural anomalies one should also include the special phenomenon of the finding of one or more Ph I chromosomes in blastic cells of CML in subacute phase. Generally speaking, these chromosomes are present in cellular lines containing 47 or 48 chromosomes, but many other karyotypes have been reported. Ph I may be present in triplicate 174.192 or reduplicated (diplo-Ph x according to HAMPEL 102)or, more frequently, duplicated in relapsed forms and in terminal blastic phases 55, 64, 7o, 72. 101,120,124, 125,1~, 127,128,132,135,170,183,199.2oo.This phenomenon might be connected with the general law according to which the induction of a chromosomal anomaly favours, owing to the lesser stability of

G. CASTOLDI

co, la comparsa di aberrazioni cromosomiche addizionali. Presumibilmente, tali aberrazioni possono comparire a caso sebbene, nella LMC, una delle vie pi~ ]requenti sia rappresentata dalla non disgiunzione del Ph I con susseguente duplicazione neUe cellule figlie. Se la duplicazione del Ph ~ rappresenti e//ettivamente la causa dell'acutizzazione blastica o sia semplicemente un epi[enomeno, rimane tuttora un problema controverso. La duplicazione peraltro b stata osservata anche al di /uori di crisi blastiche vere e proprie, come nel corso di un caso di leucemia mieloblastica acuta ab initio e nel corso di [orme di LMC in/ase di remissione 62, 194 Sulla base dei risultati acquisiti, PEDERSEN166,167 ritiene di poter a//ermare che, nel corso dello sviluppo della LMC, le cellule iperdiploidi Phi+ sono seIezionate a spese di cellule di altro tipo e che il trattamento citostatico, in particolare, favorisce questa selezione, probabilmente per il fatto che le cellule iperdiploidi sono relativamente resistenti all'azione dei /armaci somministrati. La selezione delle cellule iperdiploidi potrebbe essere interpretata a questo riguardo come espressione deIl'avvantaggiamento di cellule pi~ immature della serie mieloide, durante la progressione della LMC. DE GROUCHYe Coll. ~ hanno dal canto loro elencato tre possibili modelli di evoluzione clonale della [orma mieloide cronica: un primo modello definito dall'acquisizione successiva di cromosomi soprannumerari, un secondo modello caratterizzato dalla perdita di cromosomi in associazione o no all'acquisizione di altri cromosomi, infine un terzo modello definito dalla presenza di riarrangiamenti strutturali. In un'analisi pi~ recente, su 24 casi di LMC evoluti clonalmente 11 obbedivano allo schema di un modello preciso caratterizzato dalla presenza di un cromosoma Pff , dalla perdita di un crornosoma del gruppo 17-I8 e dall'acquisizione di un cromosoma marker mediocentrico della grandezza di un cromosoma C. Nella maggior parte delle cellule esaminate vi era un'alta probabi-

chromosomal order, the appearance of additional chromosomal aberrations. These aberrations may presumably appear by chance, although in CML one of the most frequent way is represented by the non-disjunction of Ph I with subsequent duplication in daughter-cells. Whether duplication of Ph I actually represent the cause of blastic crisis or is simply an epiphenomenon, is still a controversial problem. However duplication has been observed also outside blastic crises, like in the course of a case of ab initio acute myeloblastic leukemia and in the course of CML forms in remission phase 62, 194 On the basis of the acquired results PEDERSEN 166, 167affirms that during the

development of CML the Phi+ hyperdiploid cells are selected at the expense of cells of any other type and that cytostatic treatment favours particularly this selection, probably owing to the fact that hyperdiploid cells are resistant to the action of the administered drugs. In this connection the selection of hyperdiploid cells could be considered as an expression of the advantage during the progression of CML of cells more immature of the myeloid series. DE GROUCHYet al. s7have listed three possible models of clonal evolution of chronic myeloid form: a first model identified by a successive acquisition of supernumerary chromosomes, a second model characterized by a loss of chromosomes, either or not associated to the acquisition of other chromosomes and finally a third model defined by presence of structural rearrangements. In a more recent analysis, 11 out of 24 clonally evolved CML cases followed the scheme of a clear model characterized by the presence of a Ph I chromosome, the loss of a 17-18 chromosome group and the acquisition of a middle-centric marker chromosome as large as a C chromosome. In nearly all the examined cells

277

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

litA che il cromosoma marker fosse un isocromosoma del braccio lungo di un cromosoma 17 ~s

there was a high probability that the marker chromosome could be a long-arm isochromosome of a 17 chromosome 5s

(PhX+)

H) ASSOCIATION OF Phi+ C M L WITH OTHER MORBID SITUATIONS

L' associazione di una LMC Phi+ con altre situazioni morbose ~ stata da tempo segnalata, seppure in un numero relativamente scarso di osservazioni. Pi~ [requentemente, questa associazione si verifica per il concomitare oil sovrapporsi di un'altra situazione emopatica, ma il processo leucemico pub accompagnarsi anche a manifestazioni morbose di altra natura, spesso congenita, come la sindrome di Down e la sindrome di Klinefelter. Soprattutto interessante ~ l'associazione della LMC con altre situazioni emopatiche per le possibili implicazioni concernenti il livello dell' alterazione cromosomica, la sede e la contemporaneit~ o meno dell'insorgenza. JOSEPH e Coll. m hanno riferito due casi di LMC complicati, dopo rispettivamente 6 e 4 anni di decorso daUa loro evidenziazione clinica, da linfoadenopatie istologicamente classificate come lin/omi maligni, e nelle quali era dimostrabile il cromosoma Ph ~. In accordo con altri casi riportati in letteratura, ma non seguiti citogeneticamente, il reperto clinico caratteristico di queste /orme era dato dalla rapidit~ dell'evoluzione dopo la comparsa dei linfomi. ~ possibile pensate che il trattamento chemioterapico precedentemente eseguito abbia predisposto il paziente leucemico ad una seconda proliferazione maligna, tra l'altro maggiormente resistente al trattamento. Un'ipotesi alternativa suggerirebbe che la stimolazione operata dagli agenti chemioterapici abbia potuto spingere le cellule staminali ~ totipotenti ~ a differenziarsi secondo una linea lin/omatosa o reticolare maligna piuttosto che verso la serie granulocitica. ~ infine possibile, in questi casi, interpretare le masse tumorali linfoadenopatiche come ~ crisi blastiche extramidollari ~, piuttosto che come veri linfomi, in quanto costituite

The association of Phi+ CML with other morbid situations has been already reported even if in a comparatively limited number of observations. This association occurs more frequently on account of the coexistence or the superimposing of another hemopathic situation, but a leukemic process may go together also with morbid manifestations of another often congenital character such as Down's syndrome and Klinefelter's syndrome. Association of CML with other hemopathic situations is interesting above all for the possible implications concerning the level of chromosomal alteration, the site and contemporary or non-contemporary inception. JOSEPH e t al. 117 have reported two cases of CML complicated respectively after 6 and 4 years from their clinical evidence by lymphoadenopathies histologically classified as malignant lymphomas and where Ph I was demonstrable. In agreement with other cases reported in literature but which were not cytogenetically followed, the characteristic clinical pattern of these forms was given by the rapidity of the evolution after appearance of lymphomas. One could think that the previously performed chemiotherapeutic treatment predisposed the leukemic patient to a second malignant proliferation more resistant to the treatment. An alternative hypothesis suggests that the stimulation brought about by chemiotherapeutic agents may induce the 'totipotent' staminal cells to differentiate according to a malignant lymphomatous or reticular line rather than towards the granulocytic series. Finally it is possible, in these cases, to interpret lymphoadenopathic tumorous masses as 'extrameduUary blastic crises' rather than true lymphomas, as these are formed of cells so highly indifferentiat-

H) ASSOCIAZIONE DELLA L M C CON ALTRE FORME MORBOSE

278

G. CASTOLDI

da cellu[e cos~ altamente indifferenziate da rendere impossibile, aU'esame istologico, la loro vera origine. Esse potrebbero in questo senso, come documenterebbe il marker Ph I, precedere o vicariare crisi blastiche a livello peri/erico o nel midollo osseo. Il problema dell'associazione della LMC con il morbo di Hodgkin ~ stato a/]rontato recentemente da ~ZDINLI e Coll. 73 nell'ambito di una discussione pii~ ampia riguardante l'incidenza delle leucemie in generale nel corso della malattia hodgkiniana. Nei vari casi riconsiderati, l'occorrenza di una /orma leucemica ~ in genere posteriore aU'insorgenza della malattia di Hodgkin. In particolare ~ stato sottolineato il reperto di alterazioni cromosomiche caratteristiche di ogni tipo di leucemia (Phl, markers, aneuploidia) a livello midollare, di contro all' assenza di ogni alterazione nel midollo di soggetti affetti soltanto dalla forma hodgkiniana. Questi dati sono assunti dagli AA. come testimonianza del fatto che le due malattie in questione rappresentano entit~ totalmente distinte. Poich3 d'altra parte oltre alla malattia di Hodgkin l'unico dato in comune in questi pazienti era la pregressa irradiazione, si pub arguire come l' occorrenza della LMC possa rappresentare nient'altro che il sovrapporsi alla malattia di base di una leucosi indotta da radiazione. Il tempo medio di comparsa, nella casistica esaminata, ~ di 7 anni, il che in buon accordo con i dati di GALTON,5 sul doubling time delle forme di LMC 12" ~3. Il fatto che tali forme di associazione si siano rese pi~ evidenti negli ultimi anni, ~ in accordo, secondo l' opinione degli AA. sopra citati, con l'attuale introduzione di cicli radioterapici assai intensi e con il tempo di sopravvivenza oggi pih protratto di questi malati. L'associazione mieloma-LMC ~ gi~ stata fatta oggetto di diverse segnalazioni, ma solo recentemente indagata con criteri citogenetici. In un caso segnalato da RITZMANN e Coll. 182 coesistevano LMC e gammopatia monoclonale (tipo IgG, k) caratterizzato citogeneticamente da diverse stemlines, una delle quali

ed as to make it impossible to ascertain their actual origin at the histological examination. They could in this sense, as Ph I marker evidences, precede or vicariate blastic crises at peripheral level or in the bone marrow. The problem of the association of CML with Hodgkin's disease was recently examined by EZDINLI et al. 7s in the frame of a more general discussion concerning incidence of leukemia as a whole in the course of Hodgkin's disease. In the various cases which were reconsidered, a leukemic form occurs generally later than the inception of Hodgkin's disease. In particular, stress has been laid on the report of chromosomal alterations which are characteristic of all type of leukemia (Ph ~, markers, aneuploidy) at medullary level, as against the lacking of marrow alterations in patients suffering only from the HodgkinJan form. These data are taken by the authors as documenting the fact that the two examined diseases represent totally distinct entities. As the only factor in common in these patients besides Hodgkin's disease was a previous irradiation, it may be inferred from this that the presence of CML may represent nothing else but the superimposing of a leukosis induced by radiation to the basic disease. The average time of appearance is, in the range of examined cases, of 7 years, which is quite in agreement with GALTON'S 85data on the 'doubling time' of CML forms 12, is. The fact that these forms of association have become more evident in recent years is in agreement, in the opinion of the above mentioned authors, with the present introduction of very intense radiotherapic cycles and with the today more prolonged survival time for these patients. The myeloma-CML association has already been the theme of various communications, but it has only recently been investigated according to cytogenetic criteria. In a case reported by RITZMANN et al. 182 there was a coexistence of CML and monoclonal gammopathy (IgG, k type), the case being cyto279

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

mostrava sia il Ph I, sia una aberrazione cromosomica, a tipo di marker submetaeentrico, gi?~a suo tempo descritta come caratteristica delle ]orme di Waldenstr6m (cromosomi M W ) . [~ possibile che l'associazione sia fortuita, o che si tratti di una proliferazione combinata mielo-plasmocitaria, ma anche eventualmente che possa avere operato un processo di risposta plasmacellulare monoclonale alla proliferazione mieloide o, infine, che una situazione di paresi omeostatica (deficit immunologico) possa aver favorito l'emergenza del clone leucemico. L'esistenza di metafasi contenenti il Ph I e cromosomi grandi metacentrici in associazione dimostrerebbe d'altronde come nello stesso ceppo proli[erativo si siano innestate due anomalie appartenenti a disordini proliferativi diversi, richiamando anche per questa via l'interessamento di cellule staminali comuni, come giA segnalato in caso di associazioni multiple di disordini ematologici 42. In maniera analoga verrebbe a richiamarsi ad un coinvolgimento di cellule reticolari comuni l' associazione tra LMC e reticolosarcoma, descritta da LIBRE e Mc

FARLAND 148

genetically characterized by various stemlines, one of which showed both the Pht and a chromosomal aberration of submetacentric marker type formerly described as typical of WaldenstriSm forms (MW chromosomes). It is possible that this association is casual or that we have here a combined myeloplasmocytary proliferation, but it is also possible that a process of monoclonal plasmacellular answer to the myeloid proliferation is operating, or finally that a situation of homeostatic paresis (immunological deficit) may have favoured the appearance of the leukemic clone. The existence of metaphases containing Ph I and associated with large metacentric chromosomes would show, on the other hand, that in the same proliferative strain are inserted two anomalies belonging to different proliferative disorders, thus provoking in this way the intervention of common staminal cells, as already pointed out in case of multiple associations of hematological disorders 42. Analogously, the association between CML and reticulosarcoma described by LIBRE and Mc FARLAND 148 can be explained as an involvement of common reticular cells.

I) IL CROMOSOMA Ph I IN SlTUAZlONI MORBOSE DIVERSE DALLA LMC

I) P h I CHROMOSOME IN MORBID SITUATIONS DIFFERENT FROM CML

Sebbene il cromosoma Pff sia tuttora considerato come un'entit~ specifica caratterizzante dal lato citogenetico la LMC, vi sono tuttavia diverse condizioni in cui l'esame cromosomico ha portato alla dimostrazione di cariotipi contenenti elementi in tutto riconducibili al cromosoma di Filadelfia (tab. 4). Cib ha portato a qualche limitazione nella definizione del Ph I come marker della LMC, potendo essere meglio indicato, secondo alcuni AA., come ~ cromosoma caratteristico delle sindromi mieloproliferative ~ o come ~ l'elemento che meglio distingue le cellule della serie mieloide da quella linfoide ~ (the most satisfying evidence of the divergence of myeloid and lymphoproliferative ele-

Although Ph x chromosome is still considered to be a specific entity characterizing CML from a cytogenetic point of view, nevertheless there are other conditions where a chromosomal examination has led to the demonstration of karyotypes containing elements very similar to the Philadelphia chromosome (tab. 4). This has brought some restrictions to the definition of Pht as a marker of CML, as it can be be~ ter defined, according to some authors, as 'characteristic chromosome of myeloproliferative syndromes', or as 'the most satisfying evidence of the divergence of myeloid and lymphoproliferative elements' 143 As a matter of fact chromosomes similar to Pht have been found in many haemato-

280

G. CASTOLDI

hematological d~orders

acute granulocytic leukemia erythroleukemia polycythemia thrombocythemia osteomyelo-fibrosis/sclerosis leukopenia (? etiology) acute lymphocytic leukemia

other disorders

Down's syndrome familial transmission of Phi-like chromosome drug - - induced disorders - - lysergyde - - chloramphenicol cytostatic drugs X-ray exposition

Ph'-( like )-chromosome

-

-

Tabella 4 - Presenza di cromosomi Phl-simili in aJJezioni diverse dalla leucemia mieloide cronica. Presence of Pht-(like)-chromosomesin disorders other than chronic myelogenous leukemia.

ments m ) . In realta cromosomi simili al Ph I sono stati ritrovati in numerose condizioni ematologiche ed extraematologiche ed in particolare nella eritroleucemia 46, m, nella leucemia mieloblastica acuta 2s, 97, m, ~52,m, nella policitemia vera ~ss,~1, nella trombocitemia 221, helle /orme osteo- e mielo/ibrotiche 30, u, m, 139, 21s, in situazioni di leucopenia di natura indeterminata 2u, in un caso di metaplasia mieloide agnogenica 83 e, occasionalmente, in qualche meta/ase di pazienti con anemia perniciosa non trattata 4s. In questi casi il P f f ~ limitato ad una piccola percentuale delle meta]asi esaminate, a di//erenza di quanto avviene nelle /orme classiche di LMC in cui l'anomalia cromosomica ~ reperita generalmente in una elevata percentuale di cellule. In campo extraematologico, un cromosoma simile al Ph 1 ~ stato dimostrato in associazione aUa sindrome di Down u, 9~, 2o7, nella sindrome di Kline/elter, in un soggetto esaminato nel corso di uno studio su maschi oligo/renici ricoverati in ambienti istituzionali ed in alcuni casi con chiara evidenza per una trasmissione ]amiliare, come in un soggetto esaminato da t i c c i e Coll. 279 e portatore di spina bifida (in cui il cromosoma Ph I era presente sia nei genitori che nei nonni),

logic and extrahaematologic conditions, particularly in erythroleukemia 46, 134, in acute myeloblastic leukemia 25, 97, i31,is2, 162,in true polycythaemiaISa'2~ in thrombocythemia ~l, in osteo- and myelofibrotic forms 30, si, izT,139,218,in conditions of leukopenia of an undefined nature 134, in a case of agnogenic myeloid metaplasia 8s and, occasionally, in some metaphases of patients suffering from untreated pernicious anemia 45

In these cases Ph I is a small percentage of the examined metaphases, unlike what happens in typical forms of CML where the chromosomal anomaly is generally found in a high percentage of cells. From an extrahaematologic point of view, phi-like chromosome was found in association with Down's syndrome 24, 99, 207, in Klinefelter's syndrome, in a subject examined during a study on recovered oligophrenic males and in some cases with clear evidence for familial transmission, as in a subject with spina bifida examined by RIccI et al. i79 (in this subject Ph I chromosome was present both in parents and in grandparents), or in families with a high inciden281

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

0 in famiglie con elevata incidenza di LMC in cui molti membri presentavano, in assenza di ogni situazione patologica, un cromosoma Filadelfia-simile 160,21s Anche talune condizioni legate strettamente ai trattamenti terapeutici prolungati con farmaci citostatici m, con cloramfenicolo 44, con lysergide 97 0 connesse con l'esposizione ai raggi X ss, 9o, hanno potuto condurre alla dimostrazione di cromosomi con le caratteristiche del cromosoma di Filadelfia. Molti di questi dati rilevati in epoca precedente all'introduzione delle tecniche di fluorescenza, andrebbero oggi rivalutati in base alla possibilit~ che, in alcuni casi, non debba trattarsi di effettivi cromosomi Ph I, ma piuttosto di Y deleti 0 di altri frammenti cromosomici (fig. 7). Tuttavia in alcuni casi, come ad esempio nel corso di radiazioni, Pinsorgenza di cromosomi Ph I non ~ pih ritenuta eccezionale, come dimostrano gli studi di vari AA. giapponesi sull'insorgenza delle forme leucemiche nei sopravvissuti alle esplosioni atomiche di Hiroshima 0 nei soggetti esposti per ragioni di lavoro alla radioattivit~. Proprio in rapporto al problema della interdipendenza tra Ph I e radiazioni va inserito il caso riferito da PROPP e LlzzI 176riguardante un paziente affetto da leucemia linfoblastica acuta in cui potd essere documentata la presenza di un cromosoma Filadelfia-simile. II paziente in questione era un radiologo che per 12 anni aveva praticato fluoroscopie e che sulla base di questa attivitA poteva aver sviluppato un quadro di leucemia contenente il Ph I. In queste condizioni il problema interpretativo si riallaccia a quello pih generale delle associazioni tra LMC e altre emopatie, in cui possono essere coinvolte stem cells diverse, e cio~ filiere proliferative diverse da quella mieloide, come sino ad ora ammesso per le forme Ph z +.

ce of CML in which many members showed, in the absence of any pathological situation, a Philadelphia-like chromosome 160,21s Also some conditions strictly connected with protracted therapeutic treatments with cytostatic drugs 168,chloramphenicol *~, lysergyde 97 or connected with exposure to X-rays 88, 90have allowed the demonstration of Philadelphialike chromosomes. Many of these data which were ascertained prior to the introduction of fluorescence techniques, should today be revaluated owing to the possibility that, in some cases, it may not be a question of Ph ~ chromosomes but rather of deleted Y or other chromosomal fragments (fig. 7). However in some cases, as for instance during radiations the appearance of Ph I chromosomes is no longer considered exceptional, as is shown by the studies of various Jat~anese authors on the appearance of leukemic forms in survivors of the Hiroshima atomic explosion or in subjects exposed to radioactivity for occupational reasons. We have to mention the case reported by PROPP and LlzzI 176concerning a patient suffering from acute lymphoblastic leukemia where the presence of a Philadelphia-like chromosome could be evidenced just for the problem of interdependence between Ph I and radiations. The patient in question was a radiologist who had been practising fluoroscopies for 12 years and, as a consequence, might have developed a Ph I leukemic form. Consequently, the explanatory problem is linked to the more general problem of associations between CML and other hemopathies where different stem cells may be involved, that is to say proliferative series different from the myeloid as has been accepted up to now for p h i + forms.

L) IL P h I N E G L I S T U D I IN F L U O R E S C E N -

L) Ph I

ZA E CON T E C N I C H E DI << BANDING >>

WITH

Una riconsiderazione della posizione del cromosoma Ph ~ nella strutturazione

A new consideration of the position of Ph I chromosome in the structure of

282

IN F L U O R E S C E N C E

STUDIES

AND

~BANDING' T E C H N I Q U E S

G. CASTOLDI

del cariotipo ~ intervenuta recentemente dopo gli studi di CASVERSSONe Coll. 3a, 39, 40 e di ZECH 224, basati sull'impiego di fluorocromi come la chinacrina e la chinacrina mostarda, in grado di legarsi in corrispondenza dell' acido desossiribonucleico ( A D N ) cromosomico secondo siti pre/erenziali. Queste osservazioni hanno consentito l'identificazione selettiva delle diverse coppie cromosomiche in base alla presenza di strie trasversali piil o meno brillanti in corrispondenza dei cromatidi caratterizzabili per la /requenza con cui esse sono riproducibili. Con l'impiego della chinacrina risulta generalmente agevole l'identificazione visuale del cromosoma As, di uno dei cromosomi D e dell'Y no. Con l'uso della chinacrina mostarda ~ inoltre possibile dimostrare una netta differenza tra le coppie G21 e G22. In condizioni normali si dimostra chela coppia 22 ~ generalmente pi~ pi~ piccola di dimensioni rispetto alla coppia 21 (secondo la classificazione concordata a Denver e ripresa a Chicago). Con lo studio in fluorescenza dopo chinacrina la coppia pi~ piccola dimostra una banda fluorescente estremamente brillante in corrispondenza della regione prossimale delle braccia lunghe, mentre la coppia pi~ grande presenta una colorazione pik paIlida. L'esame comparato in fluorescenza di cariotipi di soggetti mongoli (trisomia 21) ha portato alla dimostrazione che il cromosoma soprannumerario appartiene alia coppia pi~ piccola, presentando anch' esso una banda [ortemente fluorescente in corrispondenza della regione prossimale delle braccia lunghe. Nel caso della LMC invece il cromosoma Ph I viene ad associarsi alla coppia con fluorescenza debole e quindi alla coppia opposta a quella della sindrome di Down 163 (fig. 8). La diretta conseguenza di queste osservazioni ~ innanzitutto il [atto che i cromosomi Ph ~ e l'extracromosoma G del mongolismo, una volta attribuiti alla medesima coppia cromosomica (Gzl), appaiono oggi corrispondere a coppie diverse del gruppo G e, pik precisamente, al paio pi~ lungo (G2D e al paio pi~ corto (G22) rispettivamente. Questa appar-

the karyotype has been recently effected after the studies by CASPERSSONet ah as, 39,4o and ZF.CH224based on the use of fluorochromes such as quinacrine and mustard quinacrine linked to the chromosomal desoxyribonucleic acid (ADN) according to preferential sites. These observations have made possible the selective identification of various chromosomal pairs according to the presence of more or less brilliant transversal bands of chromatids which are characterized by the frequency by which they are reproducible. Using quinacrine the visual identification of As chromosome, of a D chromosome and of Y is0 is generally easy. Using mustard quinacrine it is possible to demonstrate a clear difference between GEl and GEE pairs. In normal conditions it is shown that pair 22 is generally smaller than pair 21 (according to the classification agreed in Denver and confirmed in Chicago). By fluorescence study after quinacrine the smaller pair shows an extremely brilliant fluorescent strip in the proximal region of long arms, whilst the larger pair shows a less intense staining. A comparative fluorescence examination of karyotypes of mongolian subjects (2 1 trisomy) demonstrated that the supernumerary chromosome belongs to the smaller pair and that it shows a strongly fluorescent strip in the proximal region of long arms. Instead in the case of CML Ph I chromosome is associated to the weakly fluorescent pair and therefore to the pair opposed to that of Down's syndrome 163 (fig. 8).

A direct consequence of these observations is firstly that Ph I chromosomes and G extrachromosome of mongolism which were formerly ascribed to the same chromosomal pair (Gzl) now appear to correspond to different pairs of G group and, more precisely, to the longer pair (G2,) and to the shorter pair (G22) respectively. This fact has been 283

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

tenenza a coppie cromosomiche separate ~ stata suffragata anche dall'utilizzazione delle cosiddette tecniche di banding che consentono, mediante procedimenti vari di denaturazione dell'ADN 4, 4s, 63, 84, 223, di ottenere la dimostrazione di bande eterocromatiche ipercolorantesi con il Giemsa e caratteristiche di ogni cromosoma. Anche con questa tecnica il cromosoma soprannumerario nella sindrome di Down risulta appartenere alla coppia cromosomica breve deI gruppo G dotata di una banda iperscura nella regione prossimale delle braccia lunghe m, mentre il cromosoma di Filadelfia viene ad essere associato al paio lungo presentante una colorazione pallida con regione scura in corrispondenza del centromero (figg. 9 e 10). L'appartenenza a diverse coppie cromosomiche neU' ambito del gruppo G sarebbe ulteriormente dimostrata da alcuni studi autoradiografici ns che dimostrerebbero come il Ph I appartenga al paio replicantesi precocemente, mentre l' extracromosoma nel mongolismo appartenga al paio replicante pih tardivamente. In base aUa classificazione adottata a Denver e a Chicago (fig. 11) e alle caratteristiche di fluorescenza e di banding, la sindrome di Down associata al paio cromosomico pih piccolo dovrebbe essere pertanto identiflcata come trisomia 22. Tuttavia, per riconoscimento comune aUa IV Conferenza per la Standardizzazione in Cito~enetica (Pari# I970), si ~ convenuto too di attenersi alia classificazione del pattern fluorescente dato da CASVERSSONe Coll. 38 e di classificare il cromosoma 21 come il cromosoma associato alla sindrome di Down e come pih piccolo del cromosoma 22. Questa revisione classificativa faciliterebbe anche il compito di ridenominare una sindrome da tempo definita come ~ trisomia 21 ~, quale appunto il mongolismo. Per definizione, il cromosoma Ph 1 verrebbe quindi ad appartenere alla coppia opposta, e cioO la 22. Questi dati, in parte inaspettati, banno riproposto il problema dei rapporti tra cromosoma Filadelfia e fos]atasi al-

284

also supported by the use of the so-called 'banding' techniques which make it possible, by means of various processes of DNA denaturation 4, 43, 63, 84,223to obtain a demonstration of intense staining with Giemsa of heterochromatic bands characteristic of each chromosome. Also with this technique the supernumerary chromosome in Down's syndrome is found to belong to the short chromosomal pair of G group with a very dark band in the proximal long arm region 1~1,whilst the Philadelphia chromosome is then associated to the long pair showing a pale staining with dark region connected with the centromere (figs 9 and 10). The belonging to different chromosomal pairs within G group may be further demonstrated by some autoradiographic studies 17s which would show that Ph 1 belongs to the early replicating pair, whilst the extrachromosome in mongolism would seem to belong to the later replicating pair. On the ground of the classification agreed in Denver and Chicago (fig. 11) and the characteristics of fluorescence and banding, Down's syndrome associated with the smaller chromosomal pair should therefore be identified as 22 trisomy. However by general agreement at the IV Conference on Standardization in Cytogenetics (Paris 1970) it was established 100 to conform to the classification of fluorescent pattern given by CASPERSSON et al. 38 and to classify 21 chromosome as the chromosome associated with Down's syndrome and as smaller than 22 chromosome. This revised classification would also facilitate the task for recalling a syndrome which for a long time has been defined as '21 trisomy', as is just the case for mongolism. By definition, Pht chromosome would thus belong to the opposite pair, i.e. 22. These partly unexpected data have once again raised the problem of relationships between Philadelphia chromo-

G. CASTOLDI

longerpair ..... qumacrine fluorescence technique

i mongolism ~ ~ CML

~ Phi

f mongolism banding

~ ~

techmque

autoradiography

CML [ mongolism l CML

Denver-Chicago

o,aee,f,catoo

shorter pair ~i ( (associatedwtth the parr with a stronglyfluorescent extra G chromosome band in the proximalregion of the long arms) ~ ~) I (associatedwith the weakly fluorescentpair) L I (associatedw~ththe pair presentinga dark band in the extra G chromosome proximalregionof the long ~. ~ arms) { (associatedwith the pair presentinga pale staining)

~ phi

~ late repl)catmgpair (extraG chromosome) early replicatingpair (PhI)

G2, j(

G22

Fig. 11 - Schema della identificazione dei gruppi cromosomici 21 e 22 in base ai criteri della colorazione con chinacrina, della tecnica di <>e autoradiografici. Il cromosoma PhI appartiene al paio di cromosomi pi~ lunghi (21) mentre l'extracromosoma nella sindrome di Down appartiene al paio di cromosomi pi~ corti (22). Diagram of identification of 21 and 22 chromosomes according to the methods of quinacrine-staining, 'banding' technique, and autoradiographic methods. Ph I belongs to the pair of longer chromosomes (21), whilst the extrachromosome in Down's syndrome belongs to the pair of shorter chromosomes (22).

calina leucocitaria ( F A L ), dal momento che l'elevazione dell'intensit~ della reazione nella sindrome di Down e l'abbassamento relativamente costante nella LMC avevano /atto fortemente sospettare la presenza di una anomalia regolativa genica coinvolgente lo stesso cromosoma nei due disordini 2, 2o9. In realta molte circostanze avevano da tempo messo in dubbio la possibilita che una semplice relazione dosaggio genico-contenuto enzimatico potesse spiegare l'abbassamento del livello di /os/atasi alcalina nella LMC, ad esempio il /atto c h e l a F A L ~ bassa anche nei casi phi___ 74 o che la F A L pub crescere durante le /asi di acutizzazione della LMC, oppure che pub possedere una intensita

some and leucocyte alkaline phosphatase (LAP), because the more intense reaction in Down's syndrome and the comparatively constant lowering in CML had been the cause for a strong suspicion of the presence of a genetic regulatory anomaly involving the same chromosome into the two disorders 2, 2o9. In reality, many circumstances questioned the possibility that a simple relationship genic dosage-enzymatic content could explain the lowering of alkaline phosphatase rate in CML, the fact for instance that LAP is low also in Ph I cases 74 or that may grow during the exacerbation phases of CML, or else that it may possess a normal intensity in some cases of Ph I + CML 118,ls4, 20s, and 285

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

normale in taluni casi di LMC Ph* + ns, m, 2os o, infine, che pub presentare un indice assai basso anche in altre manifestazioni morbose non associate a Ph r (tab. 5) 121 L'appartenenza del cromosoma Ph I ad altra coppia cromosomica prospetta attualmente non solo una dissociazione del comportamento di questo enzima dal Ph I, ma ripropone il problema del ruolo giocato dall'aberrazione cromosomica nella patogenesi della LMC.

finally that it may show a very low score also in other morbid manifestations not associated with Ph I (tab. 5) la.

The fact that Ph I chromosome belongs to another chromosomal pair evidences not only a dissociation of the behaviour of this enzyme from Ph I but once again the problem of the role of chromosomal aberration in the pathogenesis of CML.

M) RAPPORTI TRA Ph I E << STEM

M) RELATIONSHIPS BETWEEN P h I AND

CELLS >>

STEM CELLS

II ]atto che il cromosoma Ph I sia presente in una percentuale assai elevata di cellule in quasi tutti i casi di LMC suggerisce che esso ~ strettamente legato alla patogenesi di questa ]orma morbosa. Nel caso esso rappresentasse semplicemente un epi/enomeno della leucemogenesi o un by-product, esso sarebbe meno costante. ~ possibile che gli agenti leucemogeni possano indurre la malignita e il Ph I in una determinata cellula come fenomeni separati ma concomitanti, oppure b possibile chela loro azione sia localizzata primitivamente a livello di un cromosoma G che successivamente interviene nella proli/erazione maligna. Verosimilmente le cellule contenenti il

The fact that Ph I chromosome is present in a very high percentage of cells in nearly all cases of CML suggests that it is strictly connected with the pathogenesis of this morbid form. I f it simply represents an epiphenomenon of the leukemogenesis or a 'by-product', it would be less constant. It is possible that leukemogenous agents may induce the malignancy and Ph I in a given cell as separated but concomitant phenomena, or else it is possible that their action is at first located at the level of a G chromosome which subsequently interferes in the malignant proliferation. Most likely cells containing Ph I have a more selective g r o w t h increase in respect to other

j gene-dose relationship

1) in Down's syndrome (trisomy 21) LAP score is usually elevated 2) increase of LAP score during remission of CML (increase of normal granulocytic cells) 3) older granulocytic cells (as in CML) have low LAP score

[no gene-dose re[ationship

1) untreated CML cases show sometimes a normal or even elevated LAP score 2) LAP score is low in the most part of Ph ~ - cases 3) several disorders demonstrate low LAP score without Pht chromosome (nephrotic syndrome, hereditary hypophosphatasia, PNH, refractory anemia, progressive muscle atrophy) 4) LAP score may be elevated during remission or in acute blastic crisis when Ph I is still detectable 5) Ph I does not belong to the pair of chromosomes responsible for the Down's syndrome (according to the fluorescence and banding results).

LAP

Tabella 5 - FosJatasi alcaIina leucocitaria e cromosoma Phq Leucocytary alkaline phosphatase and Ph I chromosome. 286

G. CASTOLDI

1) unicity of the chromosomal aberration (Ph:) 2) dose-relation of the X-ray leukemogenesis (Lewis) 3) Burch's age-incidencecurve 4) relation between Galton's doubling time and leukemia onset in Hiroshima's survivors 5) lack of pathologicallyabnormal features in the myeloid leukemic cells 6) similarity of the clinical pictures Tabella 6 - Fattori a Javore deIl'insorgenza monomutazionaIe delI'anomalia Ph1. Evidence for the monomutational onset of the defect Phi.

Ph ~ hanno un vantaggio selettivo di crescita sulle altre cellule lo, n e gradualmente prendono il sopravvento imponendosi come linea cellulare secondo le modalit~ evolutive della proliferazione clonale. Probabilmente per determinare l'alterazione cellulare caratteristica della LMC sono necessarie una ~s (tab. 6) o poche mutazioni (all'incirca quattro, secondo GALTON85), ma ancora oggi rimane pura congettura stabilire a quale livello interviene una delezione di un cromosoma G ad evocare l'anomalia caratteristica. Sulla base dei rapporti tra reperti citogenetici e citologici nella LMC si era giunti sin dai primi tempi delle indagini cromosomiche al concetto che l'anomalia specifica (Ph I) non era strettamente limitata alla serie granulocitaria, ma interessava verosimilmente anche la serie eritroide e megacariocitaria. Queste osservazioni riportavano in discussione il problema del ~ livello ~> dell'anomalia cromosomica, in quanto una comunanza del Ph I a filiere proliferative diverse conduceva direttamente ad ammettere Pinsorgenza della mutazione cromosomica almeno a livello della cellula staminale. I1 problema citogenetico sotto questo profilo veniva quindi a sovrapporsi alle impostazioni strettamente citologiche cbe gia diversi AA., ed in particolare FESRATA 7sper primo, avevano dato delle forme leucemiche, come espressione di un difetto della cellula staminale. Alcune osservazioni, come quella di FIALKOW e Coll. 7~ riguardante donne eterozigoti per la glucosio-6-fosfato-dei-

cells 10, 11 and are gradually prevailing as a cellular line from the point of view of clonal proliferation evolutive pattern. In order to determine the cellular alteration which is characteristic of CML, one 13 (tab. 6) or few mutations (about four according to GALTON85) are probably required, but it still remains a mere conjecture to establish at what level acts a deletion of G chromosome which brings forth the characteristic anomaly. On the ground of the relationships between cytogenetic and cytological findings in CML even from the beginning of the investigations on chromosomes the opinion had been reached that the specific anomaly (Ph I) was not strictly limited to the granulocytary series, but quite probably involved also the erythroid and megakaryocytic series. These observations once more evidenced the problem of the chromosomal anomaly 'level', because a common existence of Ph I at different proliferative series brought directly to admit the appearance of chromosomal mutation at least at level of staminal cell. From this angle the cytogenetic problem was placed above the strictly cytologic explanations that various authors, particularly FERRATA 7S, had given of leukemic forms as an expression of a defect of the staminal cell. Some observations, such as that of FIALKOW et al. 76 concerning heterozygous women for the glucose-6-phospha287

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

drogenasi (G-6-PD) e affette da LMC P h i + in cui eritrociti e granulociti contenevano un solo allele dell' enzima, non soltanto deponevano in favore di una comunanza della cellula staminale, ma sostenevano anche l'unicellularita dell'insorgenza della LMC, in accordo con le teorie sull'origine monoceUulare dei tumori di W I N G E 2/7, H A U S C H K A lo3, LEVAN e Coll. w e MAKINO149

te-dehydrogenase (G-6-PD) and suffering from p h i + CML whose erythrocytes and granulocytes contained only one allele of the enzyme, not only spoke in favour of a common staminal cell but gave evidence also for the unicellularity of the onset of CML, in agreement with the theories on the monocellular origin of tumors described by WINGE 217, HAUSCHKA 103, LEVAN et al. 14v and MAKINO 149

Questi dati tuttavia non hanno trovato attualmente sicure conferme ma anzi, talora, osservazioni in netta contraddizione. ~ verosimile che il Ph 1 possa originare in pih di una singola stem cell e che non necessariamente debba originare a livello della stem cell. Per quanto riguarda la pluralita delle stem cells interessate, depone a favore di questa ipotesi il caso di un paziente affetto da LMC Ph* + , portatore di mosaico 4 6 , X Y / 4 7 , X X Y presente sia nei linfociti che nel midollo osseo, in cui il Ph l era distribuito in entrambe le linee cellulari. In questo caso era evidente la necessita che il Ph I fosse insorto in stem cells diverse. Analogamente, FIALKOW e Coll. 77 e LAWLER e BANGER144hanno esaminato la distribuzione del locus Xg (legato al sesso) in eritrociti di /emmine con LMC P h i + . Poich8 i risultati della distribuzione corrispondevano a quella di fernmine normali, si poteva concludere che la teoria della genesi unicellulare del Ph 1 era errata 0 che il locus Xg sul cosiddetto cromosoma X inattivato, non era inattivato. Anche il semplice esame morfolo#co del Ph I deporrebbe infine a [avore della pluralita delle stem cells interessate alla produzione di questa anomalia. ~ noto che nella stessa preparazione cromosomica le varie metaJasi posseggono cromosomi Ph I relativamente diversi morfologicamente, almeno per quanto riguarda l'indice centromerico. Poich8 non si pub supporre che nello stesso caso la diversa morfologia dei cromosomi Ph I sia l'espressione semplicistica di diversi gradi di spiralizzazione cromatidica, ~ necessario ammettere anche per

288

Up to now these data have not found sure confirmations but, on the contrary, were sometimes strongly contradicted. Ph I may probably originate in more than one stem cell and it must not necessarily originate at the level of the stem cell. As regards the great number of involved stem cells, this hypothesis is supported by the case of a patient suffering from Ph I + CML carrier of a 46,XY/47, XXY mosaic present both in lymphocytes and bone marrow, where Ph I was distributed in both cellular lines. In this case Ph I surely originated in different stem cells. Similarly, FIALKOWet al. rl and LAWLER and BANGER144 investigated the distribution of Xg locus (linked to sex) in erythrocytes of females suffering from CML p h i + . As the distribution data corresponded to that of normal females, we could draw the conclusion that the theory of unicellular genesis of Ph I was wrong and that Xg locus on the so-called inactivated X chromosome was not inactivated. Finally, also a simple morphological examination of Ph I would emphasize the great number of stem cells involved in the genesis of this anomaly. It is a known fact that in the same chromosomal preparation the various metaphases have Ph I chromosomes comparatively different from the morphological point of view, at least as far as the centromesic index is concerned. As one cannot suppose that in the same case the different morphology of Ph I chromosomes is simply an expression of various degrees of chromatidic spiral information, it is

G. CASTOLDI

questa via l'intervento di pik stem cells neUa produzione dell' anomalia caratteristica. Per quanto concerne la sede celluIare originaria del Ph I, non sempre la cellula staminale pub essere presa in considerazione, ma esistono condizioni in cui ~ possibile dimostrare come l' anomalia cromosomica sia insorta in corrispondenza di elementi pi~ maturi, ad esempio nei casi in cui il Ph I appare limitato ad una sola serie proli/erativa cellulare ( eritroide, granulocitaria, megacariocitaria). Non pub essere tuttavia escluso in queste condizioni che la primitiva stem cell interessata dalla anomalia cromosomica (Ph I) abbia prodotto accanto a s~ anche una stem line Ph ~---, oppure che il vanta~gio selettivo acquisito dalle cellule Ph ~ positive sia rimasto limitato ad una sola serie cellulare rispetto alla proli/erazione degli elementi midollari tos.

necessary to admit also for this phenomenon the intervention of several stem cells in the genesis of the typical anomaly. As regards the primary cellular seat of Ph ~, the staminal cell cannot be always taken into consideration, but there exist conditions where it is possible to demonstrate that chromosomal anomaly evolved in connection with more mature elements, for instance in cases in which Ph ~ seems to be limited to a single cellular proliferative series (erythroid, granulocytary, megakaryocytary). However, under these conditions cannot be excluded the fact that the primitive stem cell connected with chromosomal anomaly (Ph I) has also produced a closely related Phi-- stem line or else that the selective advantage acquired by positive Ph ~cells remained limited to a single cellular series in comparison with the proliferation of bone marrow elements ~0s

CONCLUSIONI

CONCLUSIONS

DaU'esposizione sopra e//ettuata risulta l'importanza dell'indagine citogenetiea a livello delle /orme di LMC: essa si ~ arricchita negli ultimi anni di vaste casistiche la cui elaborazione ha consentito non solo una riconsiderazione di concetti gi~l in parte accennati all'inizio degli studi citogenetici (proli/erazione clonale, vantaggio selettivo di linee aberrate lo, 11, 12, 13, 145, 146), ma anche di inquadrare sotto schemi megIio delineati [orme proliferative a mor/ologia eonsimile, eppure a decorso clinico e con implicazioni prognostiche diverse. In questo senso ha significato la distinzione eft /ettuata, almeno nell' ambito delle leucemie dell' adulto, tra /orme Ph I + e/orme Ph L--. Ma lo studio citogenetico ha oggi consentito di ravvisare anche elementi prognostici a significato pi~ generale nel decorso della LMC, come ad esempio il subacutizzarsi della/orma al comparire di un quadro aneuploide di tipo iperdiploide o l'approssimarsi di una remissione in base alla comparsa di meta/asi ipodiploidi.

The above description shows the importance of a cytogenetic research in CML forms; in the course of last years this research was supported by many case reports the elaboration of which not only has made possible the revisal of concepts already partly outlined at the beginning of the cytogenetic studies (clonal proliferation, selective advantage of aberrant lines lo, 11, 12, 13, 145, 146), but also to arrange under better traced schemes proliferative forms having a similar morphology and yet showing a different clinical course, also with different prognostic implications. In this scheme, the distinction made at least within the leukemiae of adults, between PhX+ and Ph I - forms is of considerable importance. But the cytogenetic study has now allowed to perceive also prognostic elements with a more general significance in the course of CML, such as for instance sub-exacerbation of the form at the appearance of an aneuploid picture of a hyperdiploid type or else the approaching of a remission on the ground of the appearance of hypodiploid metaphases. 289

CYTOGENETIC ASPECTS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA

Se dal lato clinico-pratico gli insegnamenti derivati dallo studio citogenetico sono stati numerosi, altrettanto /ruttuose sono state le osservazioni riferibili a fini strettamente biologici: la dissociazione delle coppie cromosomiche interessate neUa LMC e nel mongolismo ha portato a meglio definire il ruolo dei cromosomi G nel controllo di talune attivita enzimatiche quali la fos/atasi alcalina e galattoso- I-fos/ato- uridil-trans/erasi u2 Non meno importanti sono infine le implicazioni inerenti all'interessamento delle stem cells nell'insorgenza dell'anomalia cromosomica: esse hanno dato elementi di supporto alla teoria ferratiana della LMC, anche se ancora oggi, come in ogni altra situazione tumorale, il ruolo patogenetico dell'anomalia in esame rimane indefinito.

I f the acquired k n o w l e d g e through cytogenetic study has been ample from the clinico-practical p o i n t of view, equally advantageous have been the observations attributable to strictly biological purposes: the dissociation of chromosomal pairs involved in C M L and in mongolism has led to a b e t t e r definition of the role of G chromosomes in the control of some enzymatic activities such as alkaline phosphatase and galactose-Iphosphate-uridyl-transferase 212. Finally, no lesser i m p o r t a n t are the implications relating to the i n v o l v e m e n t of stem cells in the appearance of chromosomal anomaly: it have given s u p p o r t i n g elements to the theory of FERRATA regarding C M L even if today, just as in any o t h e r turnout situation, the pathogenetic role of the anomaly u n d e r examination is still undefined.

RIASSUNTO I1 cromosoma di Filadelfia (Ph ~) rappresenta un elemento distintivo (marker) della maggior parte delle forme di leucemia mieloide cronica (LMC). Tuttavia alcuni quadri particolari di LMC, quali quelli dell'infanzia, la forma a polinucleati maturi tipo Emil-Weil, le forme ad eosinofili, sono in genere caratterizzate dall'assenza del cromosoma di Filadelfia. Nell'adulto, il ritrovamento del P h I pu6 essere utilizzato a scopo diagnostico, essendo le forme Ph i _ caratterizzate da un decorso pih severo e da una sopravvivenza mediana minore rispetto alle forme Phi+. Nel corso delle crisi blastiche della LMC il Ph i pus associarsi ad altre anomalie strutturali cromosomiche che testimoniano della evoluzione clonale di alcune linee proliferative avvantaggiate. Malattie diverse dalla LMC possono dimostrare occasionalmente cromosomi simili al Ph:: h stato pertanto proposto di considerare il cromosoma di Filadelfia non come cromosoma distintivo della LMC, ma piuttosto come marker delle sindromi mieloproliferative in generale. Le pifi recenti acquisizioni in base allo studio in fluorescenza dopo colorazione con chinacrina dimostrano che il Ph i appartiene al paio pih lungo dei cromosomi del gruppo G (21), mentre il cromosoma interessato nella sindrome di Down appartiene al paio di cromosomi pih corto (G 22). Tall dati, in accordo anche con gli studi di banding, dimostrano come non esista un rapporto tra queste due aberrazioni, in particolare per quanto riguarda una supposta azione di controllo genetico del1'attivitfi della fosfatasi alcalina (bassa in genere nella LMC ed elevata nella sindrome di Down) localizzabile a livello di geni dei cromosomi del gruppo G. I rapporti tra Ph ~ e stem cells dimostrerebbero infine come il Ph * possa insorgere a livello di cellule molto indifferenziate; rimane invece ancora oggi controversa la sequenza degli eventi patogenetici coinvolti nel determinismo dell'anomalia. SUMMARY Philadelphia chromosome (Ph') represents a marker of the most part of chronic myeloid leukemia (CML). However, some particular patterns of CML such as the infantile ones, the form with mature polynucleates of Emil-Well type, the eosinophilic forms are as a rule characterized by the absence of Philadelphia chromosome. In adults the finding of Ph ~ may be utilized for diagnostic purposes, as Ph:-- forms are characterized by a more severe course and a lesser mean survival in comparison with Phi+ forms. During the blastic crises of CML Ph I may be associated with other structural chromosomal anomalies which prove the clonal evolution of some advantaged proliferative lines. Diseases different from CML may occasionally show Phklike chromosomes; it has been therefore suggested to consider the Philadelphia chromosome not as a CML distinguishing chromosome, but rather as a marker of myeloproliferative syndromes. The most recent acquisitions on the ground of the fluorescence study after quinacrine staining show that Ph i belongs to the longer pair of G group's chromosomes (21), whilst the chromosome involved in Down's syndrome belongs to 290

G. CASTOLDI

the shorter pair of chromosomes (G 22). These data, in agreement also with banding studies, show that there is no relationship between these two aberrations, particularly with regard to a hypothetical action of genetic control for the alkaline phosphatase activity (generally low in CML and high in Down's syndrome) which may be located at the level of group G chromosomes genes. Finally, the relationships between Ph ~ and stem cells would demonstrate that Ph I may appear at the level of very undifferentiated cells; on the other hand the succession of pathogenetic events involved in the determinism of the anomaly is still controversial. REFERENCES

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Requests/or reprints should be addressed to: GIANLUIGI CASTOLDI CIinica Medica Generale deU'Universit~ di Ferrara 44100 Ferrara - Italia Traduzione a cura dell'A.

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