DAI CONGRESSI •

Q

•

N e i g i o r n i 2 7 , 2 8 e 2 9 g e n n a i o 1 9 6 9 si è t e n u t o a R o t t a c h - E g e r n il

Meeting

internazionale sull'azione della glibenclamide (Daonil®). I1 27 gennaio, nella prima seduta presieduta da O»ERmSSE K. (Düsseldorf), si è trattato soprattutto l'argomento della chimica e farmaco-dinamica del nuovo medicamento. Dopo che WEBER H. e Coll. (Frankfurt-Mannheim) hanno descritto la struttura chimica e le caratteristiche del farmaco e SCHMIDT F. H. e Coll. (Mannheim.Frankfurt) la sua farmacodinamica, BÄNDER A. e Coll. (Mannheim-Frankfurt) hanno paragonato l'effetto dell'HB 419 (Daonil®) in diverse specie, dimostrandone la sua alta efficacia nell'uomo, neI quale esso è 450 volte piü attivo del]a tolbutamide. Per quanto riguarda il meccanismo d'azione, essi hanno dimostrato che il farmaco è inefficace negli animali spancreati o con diabete da allossana. LOUI~ATIÈRES A. e Coll. (Montpellier) hanno confermato che I'HB 419 è inefficace nel cane spancreato. La somministrazione del medicamento aumenta l'insulinemia nella vena pancreatica duodenale. La somministrazione di una dose di 2 mg/kg provoca aumento dell'insnlinemia per 24 h. L'effetto della diazoxide, inibente la secrezione di insulina, viene abolito sia in vivo sia in vitro, dall'HB 419. La somministrazione cronica del farmaco neI topo provoca neoformazione di cellule ~ e aumento di peso delle isole, mostrando cos1 una proprietä [3-citotropica. HEBOLD G. e Coll. (Mannheim-Frankfurt) hanno dimostrato che la DL 50 dell'HB 419 somministrato per via orale in cani e conigli è superiore a 10 g/kg e in ratti, topi e cavie è superiore a 15 g/kg. Le prove per la tollerabilitä subcronica hanno dimostrato che possonõ essere tollerate dosi anche di 2.000 mg/kg. SCHMIDT F. H. e Coll. (Mannheim-Frankfurt) e KELLNER H.-M. e Coll. (Frankfurt) hanno studiato la vita media e l'eliminazione dell'HB 419 in diverse specie animali. HEPTNER W. (Frankfurt) ha invece studiato il metabolismo specifico dell'HB 419 marcato con ~4C in conigli, cani e ratti. Nella seconda sednta, presieduta da PFEIFFER t~. F. (Ulm), SIREK O. V. e Coll. (Toronto), studiando il comportamento della glicemia e dell'insulinemia, in cani ai quali era stato iniettato HB 419 i.v. alla dose di 0,25 mg/kg, hanno dimostrato una spiccata diminuzione della glicemia entro i primi 30 min, accompagnata da aumento dell'insulinemia, che raggiungeva valori circa 10 volte superiori a quelli di partenza. L'aumento dell'insulinemia non si verificava se gli animali venivano in precedenza trattati con un ~-bloccante (Kö 592-0,1 mg/kg), mentre la fento!amina produceva un effetto opposto aumentando del 100 oB la liberazione di insulina. Sulla base di questi dati gli AA. hanno avanzato l'ipotesi che I'HB 419 liberi I'insulina dalle cellule ~ stimolando i recettori ~-adrenergici. HASSELBLaTT A. e Coll. (Göttingen) hanno dimostrato che I'HB 419, analogamente alla tolbutamide, aumenta il contenuto in glicogeno del fegato se la funzionalitä corticosurrenale è normalE. SöLING H.-D. e Coll. (Göttingen) hanno studiato l'effetto dell'HB 419 sul metabolismo del fegato perfuso di ratto dimostrando una diminuzione della liberazione di ~-aminoacidi e di fosfato inorganico dal fegato di ratti diabetici da allossana. 400

MEETING INTERN. SULL'AZIONE DELLA GLIBENCLAMIDE

KRÜGER A. (Columbus) ha dimostrato che I'HB 419 inibisce la lipolisi nelle cellule adipose isolate di ratto, mentre non modifica l'ossidazione del glucosio o la iipogenesi. FÆULHABER J. D. e Coll. (Ulm) hanno pure studiato l'effetto dell'HB 419 e di altre sulfaniluree sulla lipolisi di cellule adipose isolate, con risultati analoghi a quelli descritti da KRUOER. Secondo STORK H. e SCHMIDT F. H. (Mannheim), l'effetto antilipolitico dell'HB 419 sulle ceUule adipose isolate è evidente in modo significativo se la lipolisi è stata stimolata con adrenalina. HELLMAN B. (Umeä), Iavorando su insule isolate di topo praticamente prive di cellule ~2, ha dimostrato una diminuzione del glicogeno delle cellule ~ dopo trattamento con HB 419, espressione di una modificazione del potenziale dei fosfati, con aumento, a spese dell'ATP, delI'AMP e del fosforo inorganico intracellulare. GO~E~NA R. e Coll. (Ulm) hanno studiato l'effetto de11'HB 419 sulla regolazione della glicemia e sull'aumento reattivo dell'insulina nei ratti parzialmente spancreati. GRODSKY G. e Coll. (Sah Francisco) hanno studiato 1'effetto delI'HB 419 sulla secrezione insulinica da parte del pancreas di ratto, perfuso in vitro, dimostrando che questo farmaco è 15 volte piü attivo della tolbutamide, che esso agisce sulla liberazione di insulina ma non sulla sua sintesi e che, dopo la fine della infusione di HB 419, la secrezione insulinica si prolunga per un certo periodo di tempo. KERN H. F. (Heidelberg), che ha studiato la morfologia delle isole di ratto al microscopio elettronico, ha dimostrato, 6 h dopo la somministrazione di HB 419, una chiara degranulazione di singole cellule ~ ne1 centro delle insule, che presentano pure un apparato di Golgi ingrandito, con presenza di fasi preliminari dei granuli, mentre le cellule ~ alla periferia sono in generale completamente granulate ed inalterate. Solo dopo 12-24 h quasi tutte le cellule ~ sono degranulate, con complessi di Golgi ingranditi e presenza di numerosi pregranuli.

Marted~ 28, nella prima seduta presieduta da RENOLD A.E. (Genève), LÖFFLER G. e ColI. (Hannover) hanno dimostrato che sia I'HB 419 sia la tolbutamide stimolano la secrezione di insulina da parte di isole pancreatiche di ratto isolate iß vitro secondo la metodica di Lacy e Kostianowski, ma che il primo è sostanzialmente piü efficace. Essi hanno pure paragonato l'azione dell'HB 419 con quella della teofillina e del 3'5'-AMP ciclico.

MALAISSE W . e MALAISSE-LAGAEF. hanno riscontrato che I'HB 419 stimola la secrezione di insulina da parte di frammenti di tessuto pancreatico di ratto incubati in vitro in presenza di siero anti-insulina. Sulla base del peso molecolare, I'HB 419 è 250 volte piü attivo della glicodiazina, mentre altre sulfaniluree, quali la tolbutamide e la glicodiazina, posseggono un'azione Jndipendente dalla concentrazione di glucosio neI medium. L'effetto dell'HB 419 è proporzionale alla concentrazione di glucosio, e la sua non sembra essere mediata dal sistema adenilciclasiY5'-AMP-fosfodiesterasi, dal momento che non è influenzata dall'imidazolo, un attivatore della fosfodiesterasi. HOWELL S. L. e LACY P. E. (St. Louis) hanno dimostrato che la concentrazione ottimale di HB 419 per stirnolare la secrezione di insulina in vitro da parte di isole pancreatiche di ratto è di 1 t~g/ml. I1 farmaco, nelle condizioni sperimentali descritte, sembra penetrare all'interno delle cellule ~. HELLERSTRöM B. e WESTMAN S. (Uppsala) e STORK H. e SCHMIDT F. H. hanno studiato il comportamento delle isole pancreatiche di topi obesi-iperglicemici, il cui consumo di ossigeno è stimolato da alanina e leucina, ma non da arginina e valina. L'aggiunta di HB 419 o di tolbutamide inibisce il consumo di glucosio, in presenza di leucina. AGUILAR-PARADAE., EISENTRAUT A. M. e UNGER R. H. (Dallas) hanno studiato l'effetto di 0,2 mg/kg di HB 419 iniettato i.v. in cani svegli, dimostrando netto aumento della secrezione di insulina, ma non del glucagone pancreatico, che aumenta solo piü tardivämente, in risposta ad una diminuzione della glicemia di piü di 50 mg % rispetto al valore iniziale. L'aumento dell'insulinemia era evidente 10 min dopo l'iniezione, mantenendosi per 1 h e oltre. Nella seconda seduta, presieduta da CREUTZFELDTW. (Göttingen), BETZIEN G. (Mannheim) ha dimostrato che la dose soglia ipoglicemizzante dell'HB 419 nell'uomo è di 5 "//kg se somministrata i.v. e di 10-15 y per via orale. GERRITZEN M. (L'Aja), studiando l'intensitä e la durata dell'effetto ipoglicemizzante delI'HB 419 alla dose di mg 2 e 4 per os, in soggetti normali, ha constatato che l'effetto ipo401

MEETING INTERN. SULL'AZIONE DELLA GLIBENCLAMIDE

glicemico massimo si verificava dopo circa 3 h dalla somministrazione, con una caduta del 43 % rispetto al valore di base, indipendentemente dal dosaggio. La durata dell'effetto ipoglicemizzante era di 8-9 h con la dose di mg 2 e di 5-7 h con la dose di mg 4. DUBACH M. C. (Basel) ha studiato il cornportamento di glicemia, NEFA e insulinemia in soggetti sani trattati con HB 419 e placebo. BRUNETTI P. e Coll. (Perugia) hanno studiato l'andamento delI'insulinemia in due gruppi di soggetfi sani trattati con HB 419, dimostrando che questo farmaco possiede spiccata attivitä ipoglicemizzante e stimolante la liberazione di insulina: la quantitä di insulina che si libera dopo la somministrazione di mg 5 di HB 419 è superiore a quella riscontrata dopo g 2 di tolbutamide. CHRIST O. e Coll. (Frankfurt) hanno dimostrato che nell'uomo la curva di concentrazione ematica dell'HB 419, iniettato i.v. alla dose di mg 1, ha decorso bifasico, con semivalori per i due processi di 23 min e di 7 h. Dopo somministrazione per os di mg 5, le massime concentrazioni ematiche sono state raggiunte dopo 4 h. SCHMIDT H. A. F,. e I)ETRIDES P. (Bethesda) hanno constatato, dopo la somministrazione per os di mg 5 o 10 di HB 419, che la concentrazione glicemica e I'eliminazione urinaria del preparato vengono influenzate non solo dalla dose ma anche dalIa grandezza granulare del preparato usato. RAI'TIS S. e Coll. (Ulm) hanno studiato la dinamica della secrezione insulinica dopo somministrazione ripetuta di glucosio, tolbutamide e HB 419 in soggetti sani e diabetici. QUAB»E H. J. e KLIEMS G. (Berlin) hanno studiato insulinemia, NEFA e glicemia dopo HB 419 e tolbutamide in soggetti sani e diabetici. HADDEN R. e CoI1. (Belfast) hanno studiato il ritmo circadiano di glucosio, NEFA e insulina in soggetti trattati con HB 419. CANeSSA L. e Coll. (Santiago del Cile) hanno studiato l'effetto acuto dell'HB 419 paragonandolo a quello delIa clorpropamide e della tolbutamide. MRSClC Z. e ColI. (Zagreb) hanno studiato l'effetto dell'HB 419 sulla glicemia, sui NEFA e sull'indice linfocitario PAS-positivo di diabetici. ADEZATI L. e Coll. (Genova) hanno studiato l'effetto della somministrazione di HB 419 sulla risposta al glucagone nei diabetici per quanto riguarda i livelli ematici di glicemia, NEFA ed insulina, dimostrando che I'HB 419, somministrato per un certo periodo di tempo, modifica non solo l'insulinemia di base e la risposta insulinemica precoce aI glucagone, ma normalizza anche il comportamento della fase terminale della curva insulinemica. OTTO H. (Bremen) ha riferito sui risultati ottenuti con la determinazione continuata di glicemia ed insulinemia in soggetti sani trattati con HB 419 e tolbutamide. Nella prima seduta sulla clinica dell'HB 419, presieduta da SCHÖFFLING K. (Frankfurt), M~HNERT H. e KARG E. (München) hanno riferito sulla loro casistica di 300 diabetici trattati con HB 419, con esito positivo nella stragrande maggioranza, senza mai osservare segni di allergia o disturbi collaterali. Risultati parimenti favorevoli sono stati riportati da R~TIENE K. e Coll. (Frankfurt), su 231 diabetici trattati per 18 mesi: 40 di questi erano considerati, al momento dell'inizio della terapia con HB 419, come casi di insuccesso secondario alla terapia con sulfaniluree, ed in 18 di essi si è ottenuto un controllo metabolico ottimo. RULL J. A. e Coll. (Cittä del Messico) hanno impiegato I'HB 419, con l'indicazione terapeutica comune alle sulfaniluree, in 116 diabetici di ogni tipo, concludendo che esso è un farmaco dalla grande capacitä ipoglicemizzante e privo di effetti secondari. SCHMIDT H. e Coll. (Düsseldorf) hanno impiegato I'HB 419 su 90 diabetici di tipo anziano, dimostrando che esso, alla dose di 2,5-20 mg~die è un antidiabetico attivo e ben tollerato. La dose attiva dipenderebbe anche dalla gravitä della situazione metabolica iniziale. L'HB 419 non ha potuto sostituire l'insulina se il fabbisogno superava le 24 U/die. Un gruppo di diabetologi francesi (DE~IL R. di Parigi, GUINET P. di Lione, LINQUETTE M. di Lilla, MIROUZE J. di Montpellier, RAMBERT P. di Parigi e STAHL J. di Strasburgo) hanno sperimentato I'HB 419 su 286 diabetici secondo un protocollo comune, arrivando alle conclusioni che esso può essere somministrato in dose unica nella maggior parte dei casi, generalmente prima 402

MEETING INTERN. SULL'AZIONE DELLA GLIBENCLAMIDE

del pasto di mezzogiorno: se occorrono 2 compresse, esse possono essere distribuite al mattino e la sera; il farmaco ha buona tolleranza clinica e non provoca disturbi a livello dei sistemi emopoiefico, epatico e renale. BEYER J. e Coll. (Frankfurt) hanno studiato l'effetto dell'HB 419 sul numero di leucociti e piastrine circolanti e sulla transaminasi e fosfatasi di 141 soggetti trattati per 18 mesi. Si osservò nei primi mesi aumento dei leucociti mentre dopo 2-6 mesi comparve leggera leucopenia e in alcuni casi lieve piastrinopenia: ambedue questi parametri, tuttavia, pur proseguendo la terapia, si normalizzarono nel tempo. In 7 pazienti si osservò leggero aumento della fosfatasi alcalina e in soli 2 aumento della SGOT. Gli AA. riferiscono che non fu mai necessario interrompere il trattamento in seguito a disturbi collaterali. Dati simili sono stati pure riferiti da BERINaER A., DEUTSCH D. E. (Wien) e SCHRICKER K. Th. (Nürnberg). BREIDHAC H. D. e Coll. (Melbourne) hanno studiato la funzione tiroidea durante la terapia con HB 419, senza riscontrare modificazioni, e risultati analoghi sono stati descritti da STöTTER G. e SZABO J. (Augsburg). LAMBSI)ORI~F C. C. (Giessen) ha riferito che il trattamento con HB 419 non modifica il sistema della coagulazione. PETRII)ES P. e Coll. (Duisburg) non hanno riscontrato modificazioni del fabbisogno insulinico, in pazienti nei quali esso era particolarmente elevato, con alto titolo di anticorpi, a seguito di una associazione terapeutica con HB 419, mentre KERP L. (Freiburg) ha dimostrato con la tecnica della ultracentrifugazione che I'HB 419 influenza la formazione del complesso insulinaanticorpo, ma che questo avviene solo con concentrazioni del farmaco sensibilmente superiori a quelle terapeutiche. KUROW G. (Berlin) ha riferito sul possibile utile impiego delI'HB 419 in associazione con la terapia insulinica. KNICK B. (Mainz) ha studiato a fondo la funzione epatica di pazienti trattati a lungo con HB 419 senza riscontrare alcuna azione epatolesiva da parte del farmaco, e analoghi risultati ottenuti con biopsia epatica sono stati riferiti da LANDA J. (Buenos Aires) e d'a WAHL P. (Heidelberg) che ha esaminato il quadro enzimatico del siero. BOSHELE B. R. (Birmingham) e C~~ANI)ALIA H. B. (Alabama) hanno riferito sull'impiego, coronato da successo, dell'HB 419 in 35 pazienti con diabete dell'adulto che presentavano nella grande maggioranza, con altri ipoglicemizzanti della serie delle sulfaniluree, controllo metabolico non soddisfacente. Risultati favorevoli con l'uso di questo farmaco sono stati ottenuti anche da RASTOGI G. K. (Chandigarh), KOSAKA K. (Tokyo), e KSIVANEK-SKRABALO L. e Coll. (Zagreb) Nel corso della seconda seduta del 29 gennaio, presieduta da KNICK B. (Mainz), è proseguita la trattazione dell'impiego in clinica dell'HB 419, con interventi di KRALL P. (Boston), LEUBNER H. (Innsbruck), FATEL J. C. e DHIRAWANI M. K. (Bombay), VAISHNAVA H. e Coll. (Nuova Delhi), RENTZSCH K. (Hamburg), GUTSCHE H. e I-tÖPKER W. (Berlin); questi ultimi AA. hanno riscontrato qualche episodio ipoglicemico in pazienti che non erano mai stati trattati in precedenza. Nella terza seduta, presieduta da MEHNERT H. (München), MARIaO S. e Co]]. (La Spezia) hanno presentato i risultati di 67 pazienti trattati con HB 419, con risultato giudicato buono in 40, discreto in 16 e insufficiente in 11. La tolleranza al farmaco è stata buona sia per quanto riguarda la funzionalitä epatica sia per l'emopoiesi. I1 medicamento è stato somministrato in due dosi giornaliere, prima dei pasti principali. Risultati favorevoli, nella terapia del diabete dell'adulto, sono stati descritti anche da CABARRON A. e Coll. (La Plata), BUtNS H. (Newton), STEEN B. e ColI. (Göteborg), BRoaLI H. e Coll. (Zürich), STRETMANN F. W. (Stuttgart), ROI~RtaUEZ-MIRóN J. L. (Madrid), SCHNEIDER T. e Lol'IS S. (Johannesburgh), SCHÄFER H . F . (Frankfurt) e GtlENDL W. (Graz). Numerosi AA. tra questi hanno pure riferito sull'utile associazione delle biguanidi all'HB 419, quando questo non era in grado di controllare da solo lo stato diabetico. MÜLLER R. e Coll. (Frankfurt-Mannheim) hanno quindi riassunto i dati presentati nel corso della riunione, ricordando che da essi risultavano essere stati trattati 5.053 pazienti, dei quali 2.111 avevano ricevuto il medicamento per oltre 6 mesi e 603 per oltre 1 anno, senza significativi segni di intolleranza o di disturbi collaterali, e sottolineando l'elevata efficacia terapeutica del preparato, il suo basso dosaggio, la sua fondamentale indicazione nel trattamento del diabete dell'adulto o senile con adeguata funzionalitä residua delle isole pancreatiche. G.P.

403

3 rd CAPRI CONFERENCE

La 3 «~ Capri Con/erence, organizzata come sempre dalla Casa Editrice « I1 Ponte », si è svolta il 2 e il 3 aprile 1969 ed ha avuto come argomento la farmacocinetica e il meccanismo d'azione degli ipoglicemizzanti orali. I1 tema faceva prevedere l'esistenza di almeno quattro ctistinti tempi di lavoro, giacchè, per quanto concerne sia le sulfaniluree che le biguanidi, la farmacocinetica ed il meccanismo di azione rappresentano fenomeni ben distinfi e quasi mai trattati dallo stesso gruppo di lavoro. Le metodologie e le disposizioni sperimentali tipiche della farmacocinetica rappresentano un patrimonio culturale di farmacologi che raramente aggrediscono i problemi del meccanismo d'azione. I1 felice incontro di biologi, clinici e farmacologici è stato invece sorprendentemente fruttuoso. A ciò si aggiunga un ulteriore elemento positivo: molti dei presenti avevano partecipato anche alla 2 '~a Capri Con/erence, suIla biosintesi insulinica, e le suggestioni implicate da questo tema sono rimaste quasi il sottofondo del lavoro. Si è capito, e in piü di una occasione pubblicamente affermato, che i problemi posti dalla farmacoIogia delle sulfaniluree servono anche egregiamente a chiarire il meccanismo delIa increzione insu]are, talvolta come occasione, talaltra come offerta di particolari disposizioni sperimenta]i: esemplari, in questo ordine di idee, le suggestioni emerse dai contributi di Grodsky e di Lambert. La prima impressione, tratta dal veloce susseguirsi dei contribufi e dal fruttuosissimo incontro in una serie dinamica di interventi in discussione, è che siano stare portate avanfi complessivamente precisazioni molto importanti sul meccanismo d'azione delle sulfaniluree e della piü recente di esse, la glibenclamide (Daonil ®), ma che proprio in questo lavoro siano stare gettate le basi per una completa rielaborazione delle nostre conoscenze in tema di meccanismo di increzione insulinica e della sua patologia. Loubatières ha precisato molto bene, con una serie di documentazioni anche recenti, il ruolo fondamentale delle sulfaniluree nella stimolazione dell'increzione delle cellule B; ed estremamente interessante è stata la correlazione tra i dati biochimici e quelli morfologici forniti nelle due sedute da Orci e da Hellman. Ma, sia l'introduzione di Creutzfeldt alla prima sessione su questo tema, sia i contributi di SöIing e la discussione che ne è seguita, hanno permesso di non dimenticare l'importanza dei fenomeni antidiabetici svolti alla periferia da questi farmaci ed hanno consentito una migliore comprensione dei dati emergenti nella corrente pratica clinico-terapeutica. La complessitä di corretti studi c]inici è stata pol suggerita dai contributi de]la prima sessione, dedicata agli aspetti farmacocinetici. Le conoscenze su questo tema meriterebbero una maggiore diffusione al di lä del mondo dei biologi. Esse costituiscono oggi le basi per una corretta applicazione delle posologie e dei ritmi di somministrazione nei singoli casi. I fenomeni messi in evidenza da Korsgaarcl Christensen per quanto riguarda le interferenze tra sulfaniluree ed altri farmaci costituiscono un interessante capitolo a sé stante di elevato valore teorico oltre che di straordinaria importanza pratica. Nessuna sorpresa che questi aspetti fondamentali della farmacologia siano cos~ facilmente accettati oggi nel mondo dei cultori della endocrinologia, siano essi biologi o clinici. Questo recente modo di impostare il problema farmacologico è infatti estremamente familiare all'endocrinologo, che da tanti anni, ormai, sa quanto sia importante conoscere non solo il ritmo di increzione e quello di degradazione ed eliminazione di ogni increto, ma anche e soprattutto le caratteristiche di distribuzione dell'ormone nei vati compartimenti, le sue capacitä di legame con i componenfi tessutali, con le proteine di trasporto, etc. 404

3 rd CAPRI CONFERENCE

Relativamente meno suggestiva l'ultima sessione, dedicata ai problemi del modo d'azione delle biguanidi. Nonostante lo sforzo dei ricercatori che hanno presentato i loro dati su questo argomento, non sono emerse novitä sostanziali rispetto a quelle giä rese note per il passato ed anche in recenti convegni sull'argomento. Arduo è apparso anche il compito di ricondurre ad un meccanismo unitario i vari effetti descritti: inspiegabile il motivo per cui la stessa disposizione sperimentale permette talora ai differenti ricercatori di raggiungere effetti opposti e contraddittori. Comunque l'analisi di Segre, che ha presentato e diretto la seduta, e le considerazioni di Butterfield sono stati interessanti capisaldi per chiunque desideri riaffrontare il problema con disposizioni sperimentali nuove. Non si può infine dimenticare che la 3 ra Capri Conference ha offerto ai partecipanti una relazione fuori programma, quella di Steiner, aI quale dobbiamo la identificazione della proinsulina; è questo uno dei piü affascinanti argomenti diabetologici degli ultimi anni, con implicazioni cosl vaste da rar prevedere a breve scadenza un profondo rinnovamento delle nostre conoscenze sulla malattia diabetica. Con profondo acume e in una visione di orizzonti vastissimi, Renold, concludendo la 3 «e Capri Con]erence, ha prospettato un evento futuro che potrebbe avvenire tra un giorno, o tra due anni: la descrizione di un caso clinico in cui si abbia accumulo della proinsulina per difetto dello splitting enzyme. Si apre veramente, con queste considerazioni, una nuova era della fisiopatologia e della clinica del diabete, in cui il « peptide C » verrä ad assumere il ruolo di protagonista. Le Capri Conferences, nella loro indovinata formula, costituiscono ormai una tappa obbligata dei diabetologi, clinici e non, che lavorano alle frontiere ultime delle conoscenze in questo campo. Con il loro dibattito sempre vivo e l'immediato confronto delle opinioni, esse costituiscono anche un prezioso testo la cui diffusione porta indistintamente tutti gli studiosi di buona volontä hell'ideale platea di una cosl illuminata ribalta. L.A.

Tema: Saluto d' apertura. Relatore: LOUBATIÈRES A. - Montpellier C'è un particolare segno del destino nella felice scelta di questa « isola » di Capri come sede di queste conferenze, giunte ormai alla terza edizione. Langerhans, con la sua tesi sulle « isole » del pancreas, del 1869, nel 1875 venne proprio a Capri per un lungo periodo di terapia climatica. I1 nostro tema è, come sapete, Farmacocinetica e meccanismo d'azione degli ipogIicemizzanti orali. 27 anni fa fu scoperto il potere ipoglicemizzante di certe sulfanilamidi; 24 anni fa fu individuato il loro meccanismo di azione; 23 anni fa furono introdotte nella diagnostica e nella terapia del diabete; 10 anni fa fu individuata la loro precisa azione ~-citotropica. In questa conferenza il nostro scopo sarä di dimostrare che l'impulso nato nel 1942 è ancora lontano dall'essersi esaurito. L.A. Tema: Alcuni aspetti genealogici della terapia con sulfamidici. Relatore: MÜLLER R. - Wiesbaden L'O. traccia un profilo sul piano storico e farmacologico dei vari sulfamidici, dalle prime esperienze fino alle attuali applicazioni cliniche dei sulfamidici edei loro derivati. Dopo avere ricordato tutte le sostanze derivate d'a sintesi chimica che furono utilizzate con varia fortuna nella terapia di malattie batteriche e parassitarie dell'uomo, l'O. descrive i primi risultati ottenuti contro Io streptococco con il ProntosiI, la cui azione antibatterica risultò essere riferibile alla presenza del gruppo --SO2NH2- in posizione para dell'anello benzenico. Da allora sono stati prodotti numerosissimi composti sulfamidici. La Ioro azione batteriostatica deriva dal fatto 405

3 rd CAPRI CONFERENCE che essi possiedono un'azione antagonistica sulI'acido para-amino-benzoico, che è un fattore obbligato delI'accrescimento batterico: ne deriva una inibizione della riproduzione dei germi. GIi studi che ne sono derivati sono giunti alla sintesi dell'acido para-amino-salicilico e ciò ha spostato le ricerche verso la chemioterapia d'ella tubercolosi. E' stata cosl ottenuta la sintesi di altre sostanze ad azione anti-tubercolare come il tiosemicarbazone e Fidrazide dell'acido isonicotinico. Un altro sviluppo di questi studi è derivato dall'osservazione che taluni sulfamidici, soprattutto l'acetazolamide, determinano un'inibizione delFanidrasi carbonica, da cui un aumento della diuresi. Vennero cos1 studiati gli analoghi benzotiazinici che risultarono avere una spiccatissima azione diuretica derivante non piü dall'inibizione dell'anidrasi carbonica ma da un aumento delia secrezione di cloro e di sodio, da cui il nome dato a questo gruppo di diuretici, ovvero quello di saluretici. Ad esso appartengono i piü recenti saluretici, il clortalidone e il furosemide. Un altro indirizzo di ricerche è stato quelIo dei sulfamidici ad' azione ipoglicemizzante, ma su di essi l'O. rinuncia a parlare in quanto l'argomento verrä svolto da un altro relatore. S.M. Tema:

La scoperta dei sul[amidici ipoglicemizzanti e in particolare del loro meccanismo d' azione.

Relatore:

LOUBATIÈRES A. - M o n t p e l l i e r

L'O. ha ricordato le sue prime esperienze, iniziate nel periodo 1939-1942 con lo sviluppo della terapia con sulfaniluree nel trattamento di un grande numero di malattie infettive. Si pensava allora che la febbre tifoidea favorisse la comparsa di una ipoglicemia basata sulla concomitante insufficienza surrenalica. Le esperienze dell'O, riguardavano la terapia del tifo con il 2254 RP, ossia il p-aminobenzene-sulfamido-isopropil-tiodiazolo. Dal 1942 al 1946 egli studiò ed osservò gli effetti ipoglicemizzanti di tale sostanza, ma i suoi risuhati furono accohi con molto scetticismo. Giä nel 1946 1'O. proponeva un test diagnostico usando il 2254 RP, molto simile al test alla tolbutamide proposto da Unger e Madison nel 1958. Nel periodo 1955-1956, 1'O. presentò la sintesi delle sue ricerche, proponendo l'applicazione terapeutica nei diabetici delle sulfaniluree, quali ipoglicemizzanti per via orale; contemporaneamente, ricercatori di lingua tedesca presentavano le loro esperienze con la carbutamide e con la tolbutamide. Centinaia di sostanze con effetto ipoglicemizzante vennero da allora sintetizzate dalle sulfaniluree, l'ultima è la glibenclamide (HB 419), che I'O. ha sperimentato dal 1966, riscontrando un effetto simile a quello della tolbutamide, ma circa 500 volte superiore. L'O. ha concluso esponendo la propria opinione sulle sulfonamidi ipoglicemizzanti. Esse potrebbero essere considerate come stimolatrici di due processi fisiologici: la secrezione insulinica e la neoformazione di cellule B. L.R. Tema:

La Jarmacocinetica quale problema farmacologico di base.

R e l a t o r e : D~TTLI L. - Basel Sia la farmacodinamica che la farmacocinetica studiano la rel,~zione « farmaco-organismo », ma da un differente punto di vista; infatti la prima analizza gli effetti svolti da1 farmaco sull'organismo, mentre la seconda studia gli effetti svolti dall'organismo sul farmaco. Tali effetti si possono distinguere nei tre fondamentali processi dell'assorbimento, della distribuzione e della eliminazione. Ognuno di questi processi influenza la concentrazione attuale del farmaco nell'organismo o in un suo distretto, e poichè l'azione farmacologica dipende dalla concentrazione, i dati della farmacocinetica sono indispensabiii per comprendere l'evento farmacodinamico. I1 punto piü delicato è relativo ai problemi delIa distribuzione. Ci sono molti errori di interpretazione in campo medico e biologico, a causa di una cattiva interpretazione di dati e di linguaggi al riguardo. Anche il semplice concetto di spazio di d[stribuzione è talvolta interpretato erroneamente. Ci sono ben pochi aspetti cinetici in cui il volume di distribuzione sia in pratica collimante con un compartimento biologico. Anche la semplice valutazione del livello plasmatico non ha alcun valore se non la si corregge in termini di concentrazione nell'acqua plasmatica, dato che solo le molecole liberamente diffusibili ne1 plasma assumono una certa relazione con il resto dell'organismo, a differenza delle molecole che sono pure nel plasma, ma legate a sistemi di veicolazione. Tutte le considerazioni farmacocinetiche devono quindi essere latte prima di pervenire ad una effettiva valutazione della utilizzabilitä di un nuovo farmaco. L.A. 406

3 rd CAPRI CONFERENCE

Tema:

Farmacocinetica dei sul/amidici ipoglicemizzanti.

R e l a t o r i : KRÜGER-THIEMER E . t , BÜNGER P., SEYDEL J. K. - Borstel La moderna farmacologia è oggi in grado di quantizzare la cinetica dell'assorbimento, della distribuzione, dell'escrezione e d e l destino metabolico dei farmaci. Gli OO. applicano queste moderne vedute alla farmacocinetica delle sulfaniluree. Prendendo come modello la carbutamide e studiandone comparativamente la concentrazione serica e le variazioni glicemiche derivanti dalla sua somministrazione, essi sono giunti alla conclusione che l'attivitä ipoglicemizzante è strettamente correlata con la concentrazione del farmaco nel sangue e che l'effetto ottimale si verifica, per la carbutamide, alla 4 ~ h. Lo studio del grado di assorbimento, del grado di escrezione, dell'emivita e d e l coefficiente di distribuzione, ha permesso di conoscere piü dettagliatamente la farmacocinetica della carbutamide. Il suo assorbimento è estremamente rapido soprattutto allorchè viene somministrato il suo sale sodico. L'escrezione di un farmaco dipende da numerosi fattori come la sua liposolubilitä, il pH urinario, i legami proteici: questi fattori logicamente condizionano in maniera determinante il periodo di emivita. Sotto questo profilo le varie sulfaniluree ipoglicemizzanti si comportano in modo differente l'una da11'altra e ciascuna sulfanilurea può avere anche differente comportamento nei vati soggetti, e anche nello stesso soggetto, per la concomitante somministrazione di altri farmaci. Per quanto riguarda l'attivitä ipoglicemizzante di questi composti, gli OO. avanzano due ipotesi: 1) la mobilizzazione di insulina dai depositi gram, lari delle cellule B; 2) il potenziamento dell'insulina, ad esempio a livelIo della membrana cellulare. S.M. Tema:

Farmacocinetica di una nuova sut/anilurea ipoglicemizzante altamente attiva.

R e l a t o r i : HEPTNER W . , CHRIST O., KELLNER H . M., R u P P W . - F r a n k f u r t Gli OO. hanno riferito i risultafi ottenuti nell'uomo, nel coniglio, nel cane e nel ratto studiando il metabolismo, l'assorbimento, la distribuzione e l'escrezione dell'HB 419 legato al '4C. Sono stati segnalati sei punti di particolare interesse, 1) Dopo somministrazione orale di HB 419, circa il 50 oB era assorbito nell'uomo, mentre negli animali era assorbito oltre il 75 oB. 2) Negli animali, la parte assorbita era temporaneamente accumulata ne1 fegato e nel rene. Le concentrazioni nei muscoli, neI tessuto adiposo e nel pancreas erano decisamente piü basse dei corrispondenti iivelli serici. 3) Dopo iniezione endovenosa, la semivita nell'uomo e nel coniglio era di circa 7 h, nel cane di 4 h e nel ratto di 1,4 h. 4) L'HB 419 assorbito veniva eliminato con le urine nelle specie esaminate e con la bile nei ratti; nei cani e nei conigli, I'HB 419 passava intatto attraverso il circolo entero-epatico. 5) Nel dosaggio terapeutico dell'HB 419, occorre tener presente che i suoi metaboliti non possiedono un'azione ipoglicemizzante. 6) L'uomo ed il coniglio mostravano grande parallelismo nei riguardi della farmacocinetica e d e l metabolismo dell'HB 419. L.R. Tema:

Modificazioni dell'effetto indotte da altri /armaci.

ipoglicemizzante

dei /armaci ipoglicemizzanti

R e l a t o r i : KRISTENSEN M., KORSGAARD CHRISTENSEN L. - C o p e n h a g e n La prima osservazione, relativa a importanti modificazioni nella farmacocinetica di una sulfanilurea indotte da un altro farmaco, riguarda l'innalzamento dei livelli serici della clorpropamide, indotto a sua volta dai salicilati. Poco dopo fu segnalato che il fenilbutazone incrementava l'effetto della tolbutamide e della carbutamide. Allo stato attuale delle segnalazioni, la interazione tra sulfaniluree ed altri farmaci può essere cosi sommarizzata: modificano l'effetto della tolbutamide il sulfofenazolo, i suoi derivati fenilico ed etilico, il dicumarolo, il fenilbutazone, il feniramidol, il sulfoisossazolo; modificano l'azione della clorpropamide il salicilato, il dicumarolo, il sulfafenazolo, il fenilbutazone; quest'ultimo è stato visto pure modificare l'azione della carbutamide e della acetoexamide. Circa ]e modalitä di tali interazioni non tutte sono ancora note; si tratta quasi sempre però di interferenze con la farmacocinetica a livello della degradazione del farmaco. E' stato ad esempio dimostrato che in forti bevitori di alcoolici si realizza una iperattivazione degli enzimi microsomiali responsabili della degradazione della sulfanilurea. L.A. 407

3r0 Tema:

CAPRI CONFERENCE

Farmacocinetica delle biguanidi ipoglicemizzanti.

R e l a t o r e : MeHN~RT H . - M ü n c h e n La fenformina, la metformina e la buformina sono i piü importanti derivati guanidinici attivi come ipoglicemizzanti. Nell'uomo, dopo somministrazione orale, il 50 o% della fenformina ed il 90 °B della buformina sono rapidamente assorbiti ed eliminati nelle urine. Solo la fenformina dä origine a derivati metabolici heile eliminazioni. Solo questa presenta pure un meccanismo di ricidaggio intestinale probabilmente attuato via secrezione biliare. In relazione con i differenti dosaggi terapeutici impiegati, i Iivelli ematici ottenibili con le biguanidi vanno dallo 0,1 y/m1 ne! caso della fenformina, agli 8 y/tal ne1 caso delIa metformina. Questi livelli reIativamente bassi si spiegano con la rapida eliminazione per via renale e con la diffusione totale a tutti i distretti corporei. Inoltre, probabilmente, manca ogni legame con le plasmaproteine. Il semiperiodo biologico varia dalle 2,2 h, nel caso della buformina, alle 3,2 h nel caso deIla metformina. Le differenze di comportamento tra una specie e l'altra sono significative. L.A. Tema:

Gli antidiabetici orali. Dose, concentrazione plasmatica ed effetto.

R e l a t o r e : ARIËNS E. J. - N i j m e g e n L'O. si è soffermato sulIe correlazioni esistenti fra dose, IivelIi pIasmatici e risposta alle sulfaniluree, passando in rassegna i fattori vati che interferiscono con l'eliminazione, il tempo di semivita e l'accumulo di questi farmaci. E' stata discussa poi la posizione centrale del Y5'-AMP nel meccanismo della stimolazione insulinica da parte del glucosio, glucagone, isoprenalina e teofillina, con particolare riguardo al ruoIo degli agenti bIoccanti ~3-adrenergid quali potenziatori e delIa diazoxide quale inibitore ddl'azione ipoglicemizzante delle sulfaniluree. La facilitazione da parte delle sulfaniluree della stimolazione de11'insulina mobilizzata da vari composti, quali il glucosio ed il glucagone, è stata postulata come un meccanismo d'azione specifico delle sulfaniluree. L'O. ha conduso affermando che la natura delle correlazioni fra livelli plasmatici delle sulfaniluree, secrezione insulinica e conseguente ef[etto ipogIicemizzante è ancora molto complessa e tuttora allo studio. L.R. Tema:

Vedute attuali sulle modalitä di azione dei sul/amidici ipoglicemizzanti.

R e l a t o r e : CREUTZF~LI)T W . - G ö t t i n g e n Ventisette anni dopo l'identificazione dd potere ipoglicemizzante delle sulfaniluree, il meccanismo della loro azione non è ancora chiarito e la discussione al riguardo è ancora viva. Non c'è dubbio alcuno sul loro potere di aumentare la liberazione insulinica da1 pancreas e questo è stato dimostrato inequivocabilmente in molti esperimenti acuti, sia sull'uomo che sugli animali. Ciò non prova però che questo sia l'unico meccanismo terapeutico in questione. Un secondo possibile effetto terapeutico è Iegato forse alla capacitä di queste sostanze di potenziare in qualche modo l'effetto periferico dell'insulina. In tal senso parlano ad esempio le esperienze in cui si è visto che la tolbutamide potenzia Peffetto dell'insulina esogena ne1 ratto eviscerato totalmente e trattato con infusione permanente di glucosio. Queste considerazioni diventano tanto piü importanti se si pensa che, secondo Ia maggioranza dei ricercatori, dopo trattamenti prolungati con sulfaniluree in soggetti diabetici, i livelli insulinici a digiuno non si elevano e Ia curva di tolleranza aI glucosio migliora nonostante che la liberazione insulinica da glucosio somministrato non sia neppure essa aumentata. Ma anche sul piano ormonale altri meccanismi devono essere presi in considerazione. Recentemente, ad esempio, Samols ha dimostrato che le sulfaniluree riducono la secrezione glucagonica nelPuomo, e si sa che ndla ipoglicemia iatrogenica da sulfaniluree il trattamento con glucagone si è dimostrato piü efficace che quello con solo glucosio. L.A. Tema:

Aspetti fisiologici e/armacologici del ruolo centraIe svolto dal pancreas nel meccanismo d'azione dei sul/amidici ipoglicemizzanti.

R e l a t o r e : LOUBATIÈRES A. - M o n t p e l l i e r L'O. affronta subito il problema del meccanismo d'azione delle sulfaniluree ricordando che, fin dalle prime esperimentazioni da lui eseguite, dal 1942 in avanti, era risultato chiaro che queste sostanze agiscono solamente in presenza di un pancreas funzionante. Questa stimolazione 408

3 rd CAPRI CONFERENCE

non è mediata dal sistema nervoso in quanto sia la vagotomia, sia la distruzione dei centri ipotalamici non modificano la insulinopoiesi conseguente alla somministrazione di sulfaniluree. Anche la presenza di fegato non pate necessaria, come è dimostrato dai risultati in animali epatectomizzati. L'ipotesi di una inibizione delle cellule A da parte delle sulfaniluree, avanzata nel 1956 e successivamente abbandonata, pare oggi avere ripreso vita per gli studi di Samols e di AguilarParada. Ma è certo che il ruolo delle cellule B nella produzione di ipoglicemia è il piü importante. Moltissimi studi hanno messo in evidenza le modificazioni strutturali ed ultrastrutturali delle cellule B che conseguono alla somministrazione di sulfaniluree di cui la piü evidente è la loro degranulazione. Numerosissimi sono inoltre i dati riferiti dalla letteratura che parlano in favore della liberazione di insulina endogena nella circolazione portale conseguente alla somministrazione di sulfaniluree: dai primi esperimenti con la circolazione crociata in animali, al dosaggio dell'insulinemia nella vena pancreatica. Questi risultati parlano in modo inequivocabile a favore di un'attivitä ~-citotropa delle sulfaniluree. La spiegazione dell'intimo meccanismo di queste sostanze non è ancora stata fornita. I1 sinergismo tra tolbutamide e glucosio va molto oltre la semplice sommazione dei due singoli effetti ~-citotropi e fa pensare che Io stimolo sulfanilureico sia mediato da metaboliti del glucosio. A questo proposito, molte sono le incertezze in quanto numerosi composti sono stati messi in rapporto con la secrezione di insulina da parte di vari ricercatori. Recenti ricerche infine hanno messo in evidenza il ruolo di numerosi ioni, tra cui sodio, potässio e calcio, nella secrezione insulinica da sulfaniluree. Infine 1'O. ha portato dati personali e di altri esperimentatori che documentano un effetto di stimolo da parte delle sulfaniluree sul•a proliferazione delle cellule B: esami istologici dimostrano inequivocabilmente la comparsa di isole neoformate in animali a lungo trattati con dosi elevate di glibenclamide e tolbutamide. S.M. Tema:

Azione delle sulfaniluree sulla secrezione insulinica da parte del pancreas per/uso di ratto.

Relatore:

MARIaNI M . - M .

- Montpellier

L'O. ha riassunto i risultati, ottenuti dai suoi esperimenti sul pancreas isolato e perfuso di ratto, nei seguenti punti: 1) la tolbutamide da sola, senza glucosio, aumenterebbe la secrezione basale di insulina; 2) la tolbutamide potenzierebbe la secrezione insulinica sollecitata dalle concentrazioni di glucosio. Allorchè la concentrazione è molto elevata, l'effetto potenziatore della tolbutamide sulla secrezione insulinica dovuta al glucosio, persisterebbe a lungo dopo la soppressione dell'infusione di sulfonamide; se la concentrazione è bassa, l'effetto potenziatore della tolbutamide cesserebbe quando si arresta l'infusione; 3) nelle condizioni sperimentali studiate dall'O., ripetute somministrazioni di tolbutamide in presenza di glucosio non modificavano la risposta della secrezione insulinica del pancreas; 4) esisterebbe un antagonismo fra gli effetti della tolbutamide e quelli della diazoxide sulla secrezione insulinica. L.R. Tema:

Eventi ultrastrutturali connessi con l'azione della tolbutamide e della glibenclamide sulle cellule B del pancreas in vivo ed in vitro.

Relatori:

ORCI L,, STAUê»ACHeR W . , BEAVEN D., LAMBERT A. E., RENOtD A. E., ROUILL~R CH. - G e n è v e

E' stato indagato il meccanismo che prelude, daI punto di vista strutturale ed ultrastrutturale, al fenomeno di liberazione insulinica dall'isola pancreatica, avendo riguardo particolarmente a quella indotta sia dalla tolbutamide sia dalla glibenclamide. Sono stati seguiti i fenomeni che accadono nel pancreas durante un periodo di 2 h successivo aI trattamento dell'animale vivente con sulfaniluree iniettate i.v. e quelli rilevabili su pancreas in vitro sottoposto a stimolazione da parte di sulfaniluree introdotte nel mezzo. Le immagini cosl verificate suggeriscono che la liberazione insulinica indotta dalle sulfaniluree si realizzi anzitutto attraverso una solubilizzazione intragranulare dell'ormone, con suo successivo trasferimento attraverso la membrana vescicolare, il citoplasma e la membrana esterna della cellula B. 409

3 rd CAPRI CONFERENCE

Durante la successiva rase di rigranulazione le immagini ottenute al microscopio elettronico suggeriscono: uno stato di intensa sintesi proteica ed un'incrementata respirazione mitocondriale, un vivace trasferimento verso l'apparato di Golgi del materiale proteico sintetizzato nel reticolo endoplasmico, con successivo strutturarsi dei noti granuli ~. Particolare attenzione è stata posta nell'osservazione della zona di transizione tra reticolo ergastoplasmico e regione dell'apparato di Golgi, poichè numerose formazioni vescicolari evidenziate in questa regione possono rappresentare l'equivalente morfologico di specifiche funzioni addizionali associate con i meccanismi di sintesi e di liberazione insulinica. L.A. Tema:

Reperti morfologici nelle isole di ratto dopo somministrazione di una sulfanilurea ipoglicemizzante altamente attiva.

R e l a t o r i : ENGELBART K., K I E F H . - F r a n k f u r t Facendo riferimento agli studi sulla morfologia delle isole pancreatiche dopo sfimolazione sulfanilureica, gli OO. hanno studiato gli effetti della glibenclamide sulle isole di ratto a distanza di 1, 2, 3, 4, 6, 8, 16 e 24 h dalla somministrazione di un'unica dose del farmaco, pari a 7 mg/kg. Ahri animali furono studiati a distanza di 1-9 giorni dalla somministrazione di 2 dosi di glibenclamide. I1 materiale è stato studiato sia col microscopio normale sia con quello elettronico. Gli studi hanno rilevato una degranulazione delle B-cellule che può esser correlata alle modificazioni quantitative del contenuto in insulina. In concomitanza di questa degranulazione, è stato osservato un aumento dei granuli nelle vicinanze od a contatto della membrana cellulare, che talora presenta delle soluzioni di continuitä. Gli OO. non ritengono tuttavia probabile una secrezione per emiocitosi quale è stata prospettata da ahri, ma piuttosto una sua liberazione dai granuli all'interno della celIula. Secondo gli OO. non si può sostenere l'ipotesi che queste variazioni funzionali delle B-cellule siano specifiche per le sulfaniluree: esse corrispondono alle comuni reazioni delle B-cellule agli stimoIi insulino-secretori. S.M. Tema:

Azione dei sul/amidici ipoglicemizzanti sul metabolismo epatico.

R e l a t o r e : SöLING H . - D . - G ö t t i n g e n L'O. ha osservato che nei ratti l'ipoglicemia da somministrazione di sulfaniluree era accompagnata da un aumento della concentrazione del glicogeno epatico, mentre nei cani essa non era accompagnata da un aumento nella concentrazione periferica artero-venosa del glucosio. Entrambe queste azioni delle sulfaniluree erano diverse da quelle osservate, neue medesime condizioni, con l'insulina. Tale discrepanza può essere spiegata dalle ricerche di Samols che concludono che le sulfonamidi ipoglicemizzanti inibiscono la liberazione de1 glucagone pancreatico. Riguardo all'azione diretta delle sulfaniluree sul metabolismo dei carboidrati ne1 fegato, durante trattamenti di lunga durata, benchè ancora poco si sappia in questo campo, all'O. sembrerebbe possibile che, accanto alla liberazione ed alla sintesi deIl'insulina, questi farmaci portino alcune variazioni ne1 metabolismo del fegato, modificando i'azione dell'insulina nel fegato stesso. Ricerche sperimentali su tale problema sono state condotte dall'O, con la carbutamide e la glibenclamide e sono tuttora in corso. L.R. Tema:

Meccanismo d'azione dei sul/amidici ipoglicemizzanti. Altri effetti extrapancreatici.

Relatore:

MADS~N J. - C o p e n h a g e n

Gli antidiabetM di tipo sulfanilureico sono in grado di ridurre i livelli glicemici nel cane, nel gatto e nel ratto attraverso meccanismi sia pancreatici, sia extra-pancreatici, ma sempre insulino-dipendenti, cioè necessitanti ddla presenza insulinica. In esperimenti acuti su animali intatti i meccanismi extra-pancreatici possono rendere conto della componente principale nell'effetto ipoglicemizzante, ma nonostante tutte le disposizioni sperimentali adottate il modo con cui ciò accade resta ancora oscuro. Tuttavia non può essere definitivamente accantonata l'ipotesi che le sulfaniluree siano in grado di liberare un'insulina atfiva da una forma mascherata scindendo legami di complessi molecolari a peso elevato; probabilmente si tratta di plasmaproteine. Elementi indiretti a favore di questa ipotesi si possono riscontrare nella letteratura: ad esempio è stato riconosciuto che le sulfaniluree sono in grado di inibire il legame tra bromo410

3 rd CAPRI CONFERENCE sulfaleina e proteine plasmatiche. Allo stesso modo sia la tolbutamide che la clorpropamide possono inibire il legame specifico tra la thyroxin-binding globulin e la tiroxina o la triiodotironina. Non privo di interesse in questo senso il fatto che la carbutamide è in grado di prevenire in vitro l'aggregazione delle molecole insuliniche indotte dallo Zn. L.A. T e m a : Struttura chimica ed effetto ipoglicemizzante. R e l a t o r e : BÄNDER A. - F r a n k f u r t In tutti i laboratori del mondo sono stati studiati circa 12.000 composti di sintesi allo scopo di ottenere nuovi ipoglicemizzanti attivi per via orale. Tutti contengono ii gruppo sulfonamidico - - S O 2 - - N H - - e quindi sono delle sulfonamidi. L'O., conffontando le migliaia di formule, ritiene che le capacitä ipoglicemizzanti siano legate ad una struttura che, pur helle sue varianti, si ripete in tutti questi prodotti. L'O. ha presentato tutte le varianti della predetta formula facendo una specie di genealogia dalla tolbutamide alla glibenclamide, ultima, in ordine di tempo, tra le sulfaniluree. Infine I'O. ha preso in considerazione le biguanidi ipoglicemizzanti, illustrando la loro derivazione dalla guanidina e le formule chimiche dei recenti composti facenti parte di questa serie. S.M. Tema:

Proinsulina e biosintesi dell'insulina.

Relatore:

STEINER D . F. - C h i c a g o

La scoperta della proinsulina, il precursore insulinico monosequenziale, ed una serie di osservazioni sulla presenza di un simile materiale (il componente b) nel pancreas di soggetti affetti da insulinoma, hanno creato tutta una nuova problematica. La proinsulina è un grande polipeptide di 81 aminoacidi ne1 bovino e di 84 nel suino. Quello che conosciamo come catena A deIl'insulina comprende il radicale carbossilico della ùequenza globale, e quello noto come catena B dell'insuIina comprende il radicale aminico. I1 polipeptide C, o frammento collegante, risulta quindi di circa 30 aminoacidi ed è interposto tra il radicale carbossilico della catena B e quello aminico deIla catena A, che risuhano cos~ mascherati nella proinsulina. L'allontanamento del polipeptide di connessione C ha luogo in vivo ed in vitro ad opera di uno specifico sistema enzimatico. Incubando in vitro isole pancreatiche ed aminoacidi marcati si assiste dapprima ad una rapida incorporazione di questi nella molecoIa proinsulinica; dopo 15-25 min si rivela il tracciante anche ne11'insulina libera e dopo di ciò la veIocitä della sua comparsa diventa lineare e costante. Contemporaneamente si è dimostrato che il semiperiodo di trasformazione della proinsulina in insulina è di circa 1 h e che l'allontanamento d'el polipeptide di collegamento C avviene nelFinterno della cellula B e non durante la liberazione ne1 mezzo. Dal punto di vista immunoIogico gli anticorpi antiinsulina reagiscono con una capacitä dimezzata anche con la proinsulina de1Ia specie corrispondente, ma molto piü difficilmente con la proinsulina di specie diverse. Dal punto di vista biologico la proinsulina bovina conserva solo il 2 % dell'attivitä biologica della insulina nella preparazione di cellule adipose isolate, e il 25 % sulle striscie di tessuto adiposo periepididimario e di diaframma. Ciò sarebbe dovuto essenziaImente alla capacitä di questi tessuti di liberare I'insulina allontanando il polipeptide di coniugazione C. La considerazione conclusiva che si può rare è che in qualche caso di diabete ereditario la lesione può essere costituita da una eventuale mutazione äella struttura aminoacidica del polipeptide di collegamento C, per cui ne possano risultare anomalie nella fase di biosintesi, di distribuzione e di liberazione dell'insulina. ~~.,*~~:~,~» L.A. Tema:

Aspetti fisiopatologici e clinici attuali del meccanismo d'azione dei sulfamidici ipogIicemizzanti.

Relatore:

P F E I F F e R E. F. - U l m

Gli effetti imprevisti deII'HB 419 non possono essere ascritti unicamente alla maggiore efficacia o « forza » del nuovo farmaco, che mostra di possedere attivitä biologica anche alle concentrazioni piü basse. Sempre considerando la tolbutamide quale farmaco ipoglicemizzante di confronto, si deve presumere un'azione dell'HB 419 diversa per qualitä anzichè per quantitä, diversitä che deriva forse da un potenziamento o da una facilitazione del metabolismo del glucosio all'interno della cellula B o della produzione energetica di questa, anche nelle isole di 411

3 rd CAPRI CONFERENCE

Langerhans diabetiche. Forse è stato davvero trovato un rappresentante di una « nuova classe di sulfaniluree ». Questo aspetto può spiegare in pieno il risveglio di un nuovo interesse per questo vecchio (13 anni) argomento. T e m a : Biosintesi e liberazione dell'insulina in colture di pancreas /etale di ratto. R e l a t o r i : LAMBERT A . E . , ORCI L., KANAZAWA Y., RENOLD A . E . - G e n è v e I1 pancreas fetale di ratto è stato asportato al 18° giorno di sviluppo e cohivato in particolare mezzo di incubazione allo scopo di studiare la sintesi e la liberazione di insulina immunoreattiva (IRI) sotto particolari stimoli. E' stato visto cos~ che tanto lo stimolo del glucosio che quello della tolbutamide vengono notevolmente rinforzati dalI'aggiunta di caffeina: anche l'aggiunta deI 3',5'-AMP ciclico porta ad un rinforzo di tali stimoli ma in minor misura. I1 2-desossiglucosio inibisce invece lo stimolo del glucosio, del 3',5'-AMP ciclico e della caffeina mentre, inaspettatamente, rinforza lo stimolo della tolbutamide. La glibenclamide è risuhata in questi studi essere 80 rohe piü attiva della tolbutamide. Gli OO. concludono asserendo che la liberazione di insulina da queste coltnre di pancreas possa dipendere dall'accumulo di 3',5'-AMP ciclico e dalla presenza di una o piü sostanze ad azione intermediaria derivanti dal metabolismo intermedio ma non obbligatoriamente dalla glicolisi. Le sulfaniluree potrebbero agire favorendo l'accumulo di questa o queste sostanze ad azione intermediaria. S.M. T e m a : Metabolismo e secrezione insulinica in isole isolate. R e l a t o r i : ASHCROFT S. J. H . , RANI)I~E P. J. - Bristol Dopo una breve rassegna dei fattori che possono influenzare la secrezione insulinica e delle ipotesi riguardanti il meccanismo della stimolazione dell'insulino-secrezione, gli OO. hanno descritto i risuhati dello studio della quota di ossidazione de1 glucosio da parte delle isole di topo in vitro e delle proprietä cinetiche delle ATP D-glucosio-6-fosfotransferasi e della attivitä della glucosio-6-fosfatasi negli omogenati di isole di topo. L'ossidazione del glucosio nelle isole di topo verrebbe stimolata da concentrazioni di glucosio che stimolano la secrezione insulinica e, in grado moho minore, dalla tolbutamide. II mannoeptulosio sopprimerebbe l'ossidazione del glucosio e la secrez~one insulinica. I1 glucagone stimolerebbe la secrezione insulinica senza aumentare l'ossidazione del glucosio, mentre l'adrenalina e la diazoxide sopprimerebbero la secrezione insulinica senza inibire l'ossidazione del glucosio. Secondo gli OO. tali risuhati, nonostante certe riserve, sarebbero compatibili con l'ipotesi che il metabolismo del glucosio sia legato agli effetti dello zuccbero sulla secrezione e che il mannoeptulosio possa agire inibendo la fosforilazione del glucosio. Sono stare scoperte due attivitä di ATP D-glucosio-6-fosfotransferasi. Una di esse avrebbe un basso coefficiente per il glucosio, verrebbe inibita non competitivamente dal glucosio-6-fosfato e com•etitivamente dal mannoeptnlosio, e corrisponderebbe alle esochinasi di ahri tessuti animali. La seconda avrebbe un aho coefficiente per il glucosio e potrebbe essere attivata dal glucosio-6-fosfato. L.R. Tema:

Ulteriori stud2 sugli asperti della liberazione insulinica in vitro con prove di un sistema bicompartimentale di immagazzinamento.

R e l a t o r i : GRoI)sI(Y G. M., CURRY D . , LANI~AW. H . , BENN~TT L. - San Francisco Un modello bicompartimentale è stato impiegato per spiegare i fenomeni muhifasici nella liberazione insulinica in vitro durante una stimolazione continua del pancreas. Si presume che esistano almeno due compartimenti principali. I1 piü piccolo rappresenta almeno il 2 076 del contenuto insulinico del pancreas ed è particolarmente labile di fronte agli stimoli rappresentati, per esempio, dal glucosio o dalla tolbutamide. L'ahro compartimento, quantitativamente piü importante, può essere pure stimolato da questi agenti, ma la sua sensibilitä in tal senso è diverse vohe inferiore. Ottenuta la liberazione del compartimento minore e piü labile, il glucosio può stimolare il suo rifornimento a spese sia della neosintesi ormonale, sia di un precursore, lotse la proinsulina, sia dell'insulina presente nel compartimento piü stabile. In ogni caso le esperienze e la loro interpretazione matematica permettono di porre una nuova ipotesi, cioè che l'insulina neosintetizzata, o il suo precursore, entrino preferenzialmente nel pool labile, da cui piü facilmehre e piü precocemente saranno liberate. L'insieme delle esperienze suggerisce che gli agenti capaci di liberare insulina agiscano a livelli differenti tra foto. L.A. 412

3 rd CAPRI CONFERENCE

T e m a : Regolazione della liberazione insulinica in tessuto pancreatico periJuso. R e l a t o r i : BURR I. M., STAUI~FACHER W . , BALANT L., R~NOLI) A. E., GRODSKr G . M. - S a n Francisco Gii OO. riferiscono sopra i risuItati di una Iunga serie di esperimentazioni condotte su pancreas di ratti che, dopo la loro rimozione sotto anestesia, sono stati posti in una particolare camera di microperfusione fornita di una coppia di pompe capaci di mantenere un costante flusso di liquido di incubazione. Nell'eluato sono stare studiate le wriazioni della concentrazione di insulina (IRI) allorchè nel liquido di perfusione veniva aggiunta, in quantitä nota e per periodi ben &terminati, una delle seguenti sostanze: glucosio, glucagone, arginina, leucina, tolbutamide, glibenclamide. A1 mezzo di incubazione è stato costantemente aggiunto del Trasilol per impedire l'autolisi dell'organo e la degradazione dell'insulina. GIi OO. i11ustrano con numerosi grafici la risposta della secrezione insulinica ai vari stimoli in rapporto alla durata dell'infusione ed alla coneentrazione della sostanza. Sulla base di questi risultati gli OO. avanzano l'ipotesi che le sulfaniluree possano agire con doppio meccanismo: stimolando direttamente le ceIIule B e potenziando il glucosio nello stimolo della secrezione di insulina. S.M. T e m a : Regolazione dei livelli di ATP in cellule B pancreatiche stimolate. ReIatori: HELLMAN B., IDAHL L.-Ä - U m e ä Gli OO. hanno studiato da! punto di vista istochimico le cellule B de1 pancreas stimolate, con particolare riguardo ai livelli di ATP. In assenza di substrato esogeno è stato considerato un livello basale di 5 mM di ATP per kg netto di peso. Tale Iivello si raddoppiava se le isole venivano esposte a concentrazioni fisiologiche di glucosio. Le cellule B contenenti ATP rimanevano indifferenti in presenza di composti che influenzano la secrezione dell'insulina, alterando il livello del Y,5'-AMP. Ciò starebbe ad indicare che le cellule B contenenti ATP non rifletterebbero necessariamente la quantitä di insuiina secreta. L'ATP contenuto neIIe cellule B era ridotto in maniera significativa dai derivati ipoglicemizzanti delle sulfaniluree. Ciò è probabilmente dovuto ad un'alterazione della fosforilazione ossidativa, e potrebbe portare ad un aumentato flusso glicolitico, che potrebbe fornire i metaboliti del glucosio che possono influenzare la liberazione di insulina. L.R. T e m a : Vedute attuali sul meccanismo di azione delle biguanidi ipoglicemizzanti. R e ] a t o r e : S~GRE G . - Siena Scoperte nel 1957, la metformina e la fenformina, e successivamente la buformina, incertezze sussistono ancora circa il toto meccanismo d'azione. Differenze notevoli appaiono da una specie all'aItra: uomo, scimmia e cavia essendo le specie piü sensibili. Nella massima parte degli esperimenti non si sono rilevati effetti ipoglicemizzanti ne1 soggetto sano. I 1ivelli insulinici non sono incrementati, anzi vengono &presse le abnormi risposte dei diabetici obesi. Gli studi su11'avambraccio isolato dimostrano che Ie biguanidi aumentano la clearance del glucosio e de11'insulina e riducono l'assimilazione gluddica. Molte esperienze in vitro portano a concludere che si verifichi una inibizione dei processi mitocondriali associati al trasferimento della energia sui legami fosforici. Specificamente bloccata appare la decarbossilazione de1 piruvato, donde minore produzione di acetato e quindi ridotte sintesi lipidiche e steroliche, nonchè rallentamento della interconversione verso i pentosi. La complessitä dell'effetto farmacologico è aumentata uheriormente dalle esperienze che rivelano un'azione delle biguanidi capace di rallentare l'assorbimento enterico del glucosio esogeno. L.A. T e m a : Riduzione dell'assorbimento intestinale del glucosio ad opera delle biguanidi. R e l a t o r e : CZY2YK A. - W a r s z a w a In 18 ammalati di diabete mellito non sottoposti a trattamento insulinico, 1'O. ha studiato gli effetti della somministrazione della fenetilbiguanide sutla curva glicemica da carieo orale di glucosio e sulla curva glicemica da carico endovenoso di glucosio. La dose di fenetilbiguanide è stata di 150 mg~die per 3 giorni: la stessa dose è stata somministrata 1 h prima del test. E' stato visto che la curva glicemica da carico orale era molto piü modificata dalla somministrazione della biguanide: la glicemia era piü bassa e la curva pih corta. A1 contrario il coef413

3rd CAPR1CONFERENCE ficiente di utilizzazione deI glucosio, calcolato sulla base dei valori del carico endovenoso, non ebbe variazioni significative ( K = 0,80 +_ 0,11 prima del trattamento, contro K = 0,75 ! 0,07 dopo la biguanide). Questi risultati richiedevano ulteriori ricerche che sono state eseguite nell'intestino di cane utilizzando una doppia fistola intestinale che, praticamente, isolava un'ansa intestinale. In essa veniva perfusa una soluzione glucosata al 10 % studiando, attraverso la glicemia, il suo assorbimento. A distanza di qualche giorno I'esperimento veniva ripetuto facendo precedere l'infusione di glucosio dalla somministrazione intraintestinale di butilbiguanide (10 mg/kg). Si vide cosi che la biguanide determinava una sicura riduzione dell'assorbimento intestinale di glucosio, confermando in tal modo i dati dell'esperimentazione umana. L'O. ritiene che le biguanidi, concentrandosi nella parete intestinale, impediscano l'assorbimento di ATP e che la carenza di questa sostanza determini un diminuito assorbimento del glucosio a livello intestinale. S.M. Tema:

Effetti delle biguanidi sui tessuti peri/erici.

Relatore:

BUTTERFIELD W . J. I-I. - L o n d o n

L'O. ha riferito sul]e sue esperienze che durano da 12 anni, riguardanti gli effetti della fenformina sui tessuti periferici. Sono stati affrontati vati problemi fra i quali quello della diminuzione della glicemia a digiuno e del miglioramento della curva di tolleranza al glucosio per os. Quest'ultimo evento si associa ad un aumento dei livelli ematici di piruvato. I risultati ottenuti con diversi esperimenti hanno dimostrato che, nei diabetici, la fenformina, sia per via orale che per perfusione intraarteriosa, sarebbe capace di potenziare l'azione dell'insulina endogena liberata in risposta al carico orale di glucosio e che il farmaco, per via orale, sarebbe in grado di aumentare l'azione dell'insulina esogena iniettata sia per via endovenosa per il test di tolleranza al glucosio-insulina, che per via intraarteriosa nell'avambraccio. L'O. ha prospettato pol varie ipotesi per spiegare l'azione della fenformina sull'amnento della clearance dell'insulina e sull'assunzione di glucosio nei tessuti periferici. L.R. T e m a : Azione delle biguanidi ipoglicemizzanti sul metabolismo epatico. Relatore:

SÖLING H . - D . - G ö t t i n g e n

Le biguanidi, somministrate oralmente, si accumulano dapprima nello stomaco e nel tenue, ma giä nella i a h compaiono a livello epatico. Qui l'effetto noto da maggior tempo riguarda la riduzione del contenuto glicogenico. I dati in vitro parlano a favore di una aumentata glicolisi, con un drammatico incremento del lattato. Dal punto di vista enzimologico, accanto alla dimostrata inibizione sulla succinodeidrogenasi, sono state denunciate successivamente azioni inibitrici nei confronti di tutte le deidrogenasi del ciclo di Krebs, probabilmente in rapporto con una primitiva alterazione nella rigenerazione dei coenzimi piridinici necessari. Inoltre si ha una riduzione nella capacitä di trasferimento dell'energia con diminuzione del rapporto P/O. Di estremo interesse il fatto che sia la fenformina che la metformina inibiscono la gliconeogenesi epatica indotta nell'animale dal cortisone o dal digiuno. L'enzima specificamente bloccato in questo caso sembra essere la fosfogliceratochinasi, dato che l'equilibrio piruvico-fosfoenolpiruvico non sembra modificato. L.A. Tema:

Modalitä d'azione delle biguanidi ipoglicemizzanti: aspetti clinici.

R e l a t o r e : MEHNERT H . - M ü n c h e n L'O. prende in considerazione i dati sperimentali riguardanti l'azione ipoglicemizzante delle biguanidi confrontandoli con gli dementi che affiorano dalla clinica. Certamente le biguanidi, anche se non necessitano per la loro azione di un pancreas efficiente, richiedono però una certa quantitä di insulina esogena o endogena e ciò parla per una loro azione periferica. Ma le modalitä di questa azione non sono state cbiarite. E' stato infatti confermato l'aumento dell'assimilazione del glucosio e la diminuzione della neoglucogenesi, ma non è stato notato alcun effetto sulla lipolisi di tipo insulinico. Secondo 1'O. le biguanidi da sole sarebbero indicate nel diabete obeso, associate all'insu!ina nel diabete instabile, mentre associate alle sulfaniluree troverebbero iI piü ampio campo di applicazione. S.M. 414

3 rd CAPRI CONFERENCE

T e m a : Sintesi della III Capri Con/erence. Relatore: RENOLI) A. E. - G e n è v e L'O. ha sintefizzato moIto brillantemente, commentando a volte argutamente, i dati emersi dalle relazioni e dalle discussioni sui principali temi trattati helle due giornate di lavoro, soffermandosi soprattutto sull'interesse prafico suscitato dalle osservazloni sull'HB 419, una nuova sulfanilurea, paragonata alla tolbutamide. Di grande rilievo l'ipotesi scaturita di un possibile meccanismo d'azione del farmaco, sulla base della distribuzione del farmaco stesso, che è diversa se viene somministrato per os o invece per via endovenosa, ed il suo possibile accumulo nell'intestino, se assunto per os, il che potrebbe suggerire l'idea che il suo meccanismo d'azione sia basato sulla stimolazione degli ormoni che si possono liberare dall'apparato gastro-enterico. Parlando poi delle singole relazioni, 1'O. ha richiamato l'attenzione sull'importanza delle tesi svolte e degli esperimenti condotti, che portano a formulare sempre nuove suggestive ipotesi di lavoro per il futuro. L.R. C o m e di consueto, alla chiusura dei lavori d d l e Capri Con/erences fa seguito u n a parficolare m a n i f e s t a z i o n e ne1 corso della quale u n illustre studioso intrattiene l ' u d i t o r i o su di u n t e m a generale. C o m e lo scorso a n n o F . G . Y o u N c di C a m b r i d g e parlò su Ormoni e biochimica. Sviluppi e prospettive ]uture, cosl q u e s t ' a n n o G. EHRHART di H o e c h s t / M e n o ha parlato su Aspetti chimici della ricerca /armaceutica del /uturo. P u b b l i c h i a m o qui u n r i a s s u n t o della C o n f e r e n z a del Prof. Ehrhart. I progressi degli ultimi 60 anni sono dovuti in gran parte al fatto che la ricerca chimica ha potuto procedere parallelamente ad un affinamento medico e biologico. E' di grande importanza per il farmacologo poter verificare le differenze di concentrazione di un farmaco in distretti esplorabili nel vivente con tecniche particotari: il cateterismo cardiaco o l'osservazione microscopica in contrasto di fase su cellule viventi, etc. D'altro lato fondamentali conoscenze sono emerse dalla comparazione delle differenze chimiche sottili tra componenti normali de1 regno animale ed analoghi vegetali. Le differenze di struttura tra adrenalina, propria deI regno animale, ed efedrina, propria del regno vegetale, hanno aiutato a sviluppare il concetto farmacologico di provocare artificiosamente piccole alterazioni nella struttura chimica di farmaci nofi o di metaboliti naturali allo scopo di posse&re composti con azioni nuove o quantitativamente diverse. Interessanti risultati in tal senso sono stati perseguiti ed ottenuti nel campo dei derivati della cocaina come anestetico locale e n d campo della morfina. Lo stesso significato hanno avuto gli studi che dal rilievo deII'azione ipoglicemizzante di certi chemioterapici hanno portato all'elaborazione della tolbutamide e poi della glibenclamide. In futuro le modificazioni di strutture naturali porteranno a sempre piü interessanti risultati nel campo degli ormoni steroidei (contraccettivi orali); dei polimerisati (sostitutivi plasmatici per trasfusioni); delle stesse plasmaproteine a funzioni complesse esistenti solo in tracce nei liquidi biologici e rivelate dalle analisi piü sofisticate. Un futuro estremamente interessante, infine, deve essere atteso per quanto riguarda gli enzimi e gli inibitori che si comportano come antitumorali ed immunosoppressivi. L.A

L'Editore è lieto di comunicare ai lettori che, di concerto con la Segreteria della 3 r« Capri Conference, ha giä pubblicato gli Atti. Il volume è stato inviato in omaggio ai soli abbonati di Acta D i a b e t o l o g i c a L a t i n a per il 1969, ed è in vendita presso la stessa Sede della Casa Editrice e presso le maggiori librerie specializzate. T h e P u b l i s h i n g H o u s e « I1 P o n t e » is pleased to i n f o r m the reader that, in accordance w i t h the Secretary's office of the 3 ra Capri Conference, it has already p u b l i s h e d the Proceedings. T h e v o l u m e has b e e n seht, free of charge, o n l y to the subscribers of Acta Diabetologica Latina for 1969, a n d it is o n sale b y the P u b l i s h i n g H o u s e itself a n d the major specialised booksellers.

415

3 ° SIMP. INT. S U I FARMACI CHE INFLUENZANO IL METABOLISMO LIPIDICO

Nei giorni 9, 10 e 11 s e t t e m b r e 1968 si è svolto in M i l a n o il 3 ° Simposio Internazionale sui ]armaci che influenzano il metabolismo lipidico. I l Simposio è stato organizzato d a l l ' I s t i t u t o di Farmacologia de11'Universitä di M i l a n o e dall'American Heart Association, Council on Atherosclerosis. Tema:

Effetto dei ]armaci sulla mobilizzazione dei FFA nel tessuto adiposo bianco

e brl~1"lo. Relatore: DORIGO P. - P a d o v a

Tema:

Ridotta risposta lipolitica in vitro alle catecolamine e all'ACTH nel grasso bruno di ratti acclimatati al /reddo.

Relatore: B l z z i A. - M i l a n o Tema:

Prove dirette di un controllo ormonale dell'attivitä lipasica del tessuto muscolare.

Relatore: CHMELAR M. - Praha L'O. è riuscito a dimostrare a ]ivello cardiaco, scheletrico e della muscolatura liscia d'el ratto una lipasi ormonosensibile che è ampiamente simile alla lipasi del tessuto adiposo ormonosensibile nota da lungo tempo. Questa lipasi può essere sfimolata soprattutto dalle catecolamine, ma scarsamente dall'ACTH e dal TSH. Tema:

La regoIazione deU'AMP ciclico e della lipolisi nel tessuto adiposo da parte di ormoni ed altri agenti.

ReIatore: BUTCHER R. - Nashville L'O. ha passato in rassegna in forma riassunfiva l'importanza deII'AMP ciclico come regolatore centrale della lipolisi del tessuto adiposo. Secondo le sue parole, il meccanismo che conduce all'aumento dell'AMP ciclico, ad opera di stimolatori della lipolisi, è largamente chiarito (e precisamente si tratta di una attivazione della adenilciclasi o rispettivamente un'inibizione della fosfodiesterasi). A1 contrario il meccanismo d'azione che conduce alla riduzione dell'AMP ad opera di inibitori della lipolisi (insulina, prostaglandina, acido nicotinico) è stato chiarito meno bene. Soltanto il meccanismo dei ~-bloccanti è stato chiarito in misura soddisfacente. T e m a : Il 3,5-AMP ciclico e la regolazione della lipolisi nel tessuto adiposo di ratto. Relatori: MOSlNCER B. - P r a h a ; VAUGnAN M. - Bethesda Gli OO. hanno riferito sulle loro osserv~.zioni relative all'influenza sulla lipolisi del tessuto adiposo da parte di ioni. I1 calcio, il magnesio ed il potassio rinforzano la lipolisi stimolata dalla noradrenalina nel tessuto epididimale isolato di ratto. Invece la lipolisi stimolata dall'aggiunta di AMP ciclico esogeno viene inibita dagIi stessi ioni. I1 fosfato inorganico si comporta in maniera opposta. Si suppone che una modificazione degli influssi ormonali sul tessuto adiposo da parte d'i ioni possa svolgere anche da1 punto di vista fisiologico un ruolo importante. T e m a : Effetti di agenti bloccanti adrenergici sulla mobilizzazione di FFA. Relatore: W E S T E R M A N N E . - H a n n o v e r Tema:

Correlazione tra la dilatazione coronarica, l'inibizione della lipolisi e della conduzione atrioventricolare da parte di un derivato adenosinico.

Relatori: DIETMANN K., SCHAUMANN W . - M a n n h e i m T e m a : Derivati adenosinici come inibitori della lipolisi; studi in vivo. ReIatore: W E S T E R M A N N Fù - H a n n o v e r T e m a : Derivati adenosinici come inibitori della lipolisi; studi in vitro. Relatori: STOCK K., WESTE~MANN E. - H a n n o v e r 416

3 ° S I M P . INT. SUI FARMACI CHE INFLUENZANO IL METABOLISMO LIPIDICO

T e m a : Azione della norepinefrina edel propranololo sulla velocitä di turnover degli

acidi grassi liberi e sulla velocitä di esterificazione degli acidi grassi liberi a trigliceridi plasmatici. Relatori: Tema:

SAILER S., SANDHOFER F., BOLZANO K. - I n n s b r u c k

Effetti dell'acido 5-metilpirazolo-3-carbossilico, U-19425, sulla mobilizzazione dei FFA.

Relatore: G~~RITSEN G. - Kalamazoo Tema:

Gli effetti dell'acido 5-metilpirazolo-3-carbossilico (U-19425) e dell'acido nicotinico (NA) sugli acidi grassi liberi (FFA), sui trigliceridi e sul colesterolo nell' uomo.

Relatore: GUNDERSEN K. - Kalamazoo Tema:

Confronto dell'effetto antilipemico dell'acido nicotinico (NA) e dell'acido 3-metilpirazolo-5-carbossilico (MPC) nei ratti.

ReIatore: TAMASI G . - B u d a p e s t Tema:

Effetto dell'acido 5-metilpirazòlo-3-carbossilico (MPC) sulla mobilizzazione dei grassi, sulla chetogenesi e sul metabolismo del glucosio durante l'esercizio fisico nell' uomo.

Relatore: HaVEL R. J. - San Francisco L'O. ha dimostrato, in soggetti giovani sani di sesso maschile, l'importanza degli acidi grassi liberi per il fabbisogno energetico allorchè esso viene acutamente aumentato. Persone, che nell'esercizio fisico dimostravano un forte aumento di con¢entrazione degli acidi grassi Iibed, in una seconda ricerca con contemporanea somministrazione di mg 10-30 di MPC, presentarono marcate diminuzioni degIi addi grassi Iibed e della glicemia. Evidentemente ii glucosio non era sufficiente per il maggior fabbisogno di substrato energetico se si impediva la mobilizzazione degIi acidi grassi Iibed. Tema:

Depressione del colesterolo da parte del ~-piridil-carbinolo senza relazione con la lipolisi ed il bilancio dell'azoto.

Relatore: GEY K. F. - Basel Tema:

L'effetto dell'acido nicotinico (NA) e d e l pentaeritritol4etra-nicotinato (8 AL) sull'aterosclerosi sperimentale nel coniglio.

Rdatore: Tema:

BRATTSAND R. - M o l n d a l

Studi sull'effetto di abbassamento dei FFA del ~-piridil-carbinolo relazione con la tolleranza al glucosio in diversi tests.

e sua

Relatori: BOBER V., VANNOTTI A. - L a u s a n n e Gli OO. hanno dimostrato il miglioramento delIa tolleranza al glucosio alIorchè si verifica un abbassamento acuto degli acidi grassi libed ne1 plasma (in questa ricerca mediante infusione di Ronicol). L'aumento ddl'insulina durante ii carico di gIucosio era ugualmente scarso in presenza di un abbassamento degli acidi grassi liberi. Tema:

Trattamento protratto di pazienti con acido nicotinico e suoi effetti sui lipidi ematici, serici ed epatici.

Relatore: G~KALOVOVA I. - O l o m o u c Tema:

Effetti antilipemici del Ronicol-retard nell'iperlipemia: studio al doppio cieco.

Relatore: HOUTSMULLER A. J. - R o t t e r d a m

417

3 o SIMP. INT. S U I FARMACI CHE INI~LUENZANO IL METABOLISMO LIPIDICO

Tema:

Effetto del trattamento con acido nicotinico sulla composizione chimica di classi di lipoproteine plasmatiche nell' uomo.

R e l a t o r e : CARLSON L. A. - S t o c k h o l m T e m a : Studio dei /armaci che influenzano R e l a t o r e : SCHOCH H . K. - A n n A r b o r Tema:

L'effetto di diversi /armaci ipolipemizzanti sui parametri dei lipidi ematici.

Relatore: Tema:

i lipidi.

FROM HANSEN P. - C o p e n h a g e n

Il meccanismo d'azione di agenti anti-lipolitici: confronto tra gli effetti della PGE1, dell'insulina, della tolbutarnide, della /en/ormina edei salicilati sulla lipolisi indotta dal dibutiril AMP ciclico.

R e l a t o r i : STONE D. B., BROWN J. D. - I o w a C i t y Gli OO. hanno trattato l'effetto antilipoIifico dell'insulina, delle prostaglandine, d'ella tolbutamide, della fenformina e d e l salicilato di sodio su cellule adipose isolate di ratto. L'insulina e la prostaglandina El inibivano solo la lipolisi stimolata da scarse concentrazioni di dibutiril AMP ciclico e di teofillina. Una stimolazione della lipolisi da parte d'i elevate concentrazioni di AMP e di teofillina non veniva inibita. Poichè la velocitä della ]ipolisi a basse concentrazioni di AMP ciclico (esogeno come dibutiril AMP ciclico o mediante teofillina) è probabilmente limitata dall'atfivitä della adenilciciasi, si suppone che l'insulina e la prostaglandina esercitino la loro azione su questo enzima. Invece la tolbutamide, la fenformina ed il salicilato di sodio inibiscono la lipolisi anche quando questa è stata stimolata da elevate concentrazioni di dibutiril AMP cicIico e dalIa teofillina. Si conclude quindi che queste sostanze esercitano la loro azione dopo lo sviluppo delI'AMP ciclico (inibizione della attivazione od azione della lipasi triglicerica). Tema:

L'effetto di agenti ipoglicemizzanti sulla biosintesi del colesterolo.

R e l a t o r e : DEMPSEY M. ]~. - M i n n e a p o l i s L'O. ha riscontrato un'inibizione della 8-7-colesterol-reduttasi ad opera della fenformina. Tema:

Ossidazione del colesterolo da parte dei mitocondri di fegato di ratto: influenza dell' etil-p-cloro/enossi-isobutirrato.

Relatore: KRITCHEVSKY D. - P h i l a d e l p h i a T e m a : L'effetto del Clofibrat sui lipidi serici e/ecali. Re]atori: MIT¢HELL W . D., MU~CHISON L. E. - G l a s g o w Gli OO. hanno riscontrato in 21 pazienfi che non esisteva alcun punto di appoggio per la teoria di un aumento del metaboIismo del colesterolo ad opera de] C1ofibrat. Nonostante una diminuzione della coIesterolemia, ]'eliminazione fecale degli acidi biliari era ridotta. L'eliminazione fecale di grassi e steroidi neutri non aumentava, per cui viene a mancare anche un punto di appoggio per la teoria di una maggiore eliminazione o di un'inibizione de1 riassorbimento del colesterolo ad opera del Clofibrat. Tema:

L'efficacia del Clofibrat nelle iperlipoproteinemie /amiliari.

R e l a t o r e : L~vY R. I. - B e t h e s d a L'O. riferisce gli ottimi risultati ottenuti con il Clofibrat neIl'iperlipoproteinemia tipo III, situazione metaboIica molto rara e di difHcile diagnosi. I trigliceridi ed il colesterolo si sono normalizzati al massimo entro 18 mesi e si è avuta scomparsa degli xantomi. L'O. ha inoltre riferito sugli effetti collaterali de1 Clofibrat: nell'8 % dei suoi pazienti sono comparsi disturbi sotto forma di debolezza e di crampi muscolari. In parecchi casi aumentava il CPK. In almeno un caso erano comparsi disturbi del ritmo cardiaco, che erano regrediti dopo sospensione del fflrmaco.

418

3 ° S l M P , INT. S U I FARMACI CHE INFLUENZANO IL METABOLISMO LIPIDICO

Tema: L' effetto del Clofibrat sui quadri lipoproteici nelle iperlipemie primarie, sulla

base di una misurazione mediante elettro~oresi su gel di agarosio. Relatore: KAHLKE W. - Heidelberg Tema: L'effetto del cloro/enossi-isobutirrato (Clofibrat) in diversi tipi di iperli-

pemia primaria. Relatore: SCHtlERF G. - Heidelberg Tema: L'effetto del Clofibrat sui lipidi plasmatici e sulle lipoproteine in diversi

tipi di iperlipemie. R elatore: KHACHADURIANA. K. - Beirut L'O. si è occupato della diversa influenzabilitä di svariati tipi di iperlipoproteinemia ad opera del Clofibrat. Ha riscontrato che il farmaco non dimostra alcun effetto nel tipo I (forma pura indotta dai grassi). Anche il tipo II (ipercolesterolemia familiare) non viene praticamente influenzato. I1 risultato era variabile nei tipi frequenti IV e V. In molfi casi, con una dieta appropriata, si poteva registrare un risultato per lo meno altrettanto buono.

Tema: Un tentativo di prevenzione primaria mediante Clofibrat. Relatore: OLIWR M . F . - Edinburgh Questo O., prendendo in considerazione parecchie migliaia di pazienti trattati con Clofibrat, ha potuto confermare che il CPK può aumentare per effetto del farmaco. I1 valore di un trattamento protratto con Clofibrat è ancora incerto. L'O., che ha controllato circa 4.500 uomini clinicamente sani, in una ricerca prospettica che dura dal 1964, non ha potuto rare alcuna dichiarazione sulla sperata riduzione di frequenza dei casi di infarto con il trattamento con Clofibrat.

Tema: Terapia con il Clofibrat in pazienti affetti da arteriopatia periferica. Un

tentativo per impedire la cardiopatia ischemica. Relatori: BEGc T. B., RIFKIND B. M., MORNA ORR, HUTTON [[.

-

Glasgow

Questi OO. hanno trattato 155 pazienti di sesso maschile, affetti da claudicatio intermittens con e senza iperlipemia, con il Clofibrat, per un periodo di tempo fino a 4 anni. Allo stato attuale delle ricerche, il numero di attacchi stenocardici, di insulti cerebrovascolari ed il progredire delle occlusioni periferiche nel gruppo trattato non risulta inferiore a quello del gruppo di controllo. I1 numero di infarti miocardici sembrerebbe inferiore.

Tema: Alterazioni dei lipidi lipoproteici con la colestiramina. Relatori: JONES R. J., LjtmlCA DOBRItOVlC - Chicago Tema: Trattamento di stati iperlipemici con colestiramina, una resina sequestrante

gli acidi biliari. Relatore: CASDORPH H. R. - Long Beach Questo O. ha riferito la sua esperienza con questa sostanza. Con una posologia giornaliera di 8, al massimo 36 g/die, in 50 e rispettivamente 20 pazienti la colesterolemia risultava chiaramente diminuita nel tipo I I e III.

Tema: Studio dei farmaci ad azione sul metabolismo lipidico nella divisione di

cardiologia dell'Amministrazione dei Veterani degli Stati Uniti. Relatore: SCHOC~ H. K. - Ann Arbor Ne1 suo studio 1'O. ha preso in considerazione 570 pazienti, ciascuno dei quali aveva sublto almeno un infarto miocardico ed era stato trattato per oltre tre anni con 4 mg~die di ormone tiroideo (D-T4); in confronto a questi si era effettuato inoltre un trattamento con 1,25 mg~die di estrogeni e g 6 di acido nicotinico/die. Gli estrogeni non avevano alcun influsso sulla colesterolemia, ma in molti casi provocavano ginecomastia ed impotenza. L'acido nicotinico determinava una diminuzione del colesterolo in media del 20 %, ma ne1 30 % dei pazienti esso

419

13°

CONGR. SOC. ITAL. PER LO STUDIO DEL M E T A BO L I SM O

provocava effetfi collaterali gastrointesfinali ed epatici. Con il D-T4 si otteneva una diminuzione media del colesterolo del 7 %. In questi pazienti non si osservava un aumento dei disturbi stenocardici. T e m a : L'effetto di diversi /armaci ipolipemizzanti sui parametri dei lipidi ematici. R e l a t o r e : FROM HANSEN P. - C o p e n h a g e n Questo O. ha posto a confronto, in 30 pazienti iperlipemici, periodi di trattamento di 6 settimane con il Clofibrat (g 2,25), con ii D-T4 (mg 6), con il L-T4 (mg 0,12) e con l'acido nicotinico (g 1,5), separati da periodi di trattamento di 3 settimane con placebo. Inoltre sono state somministrate associazioni di questi preparafi. Gli ormoni tiroidei non esercitavano alcuna influenza sui trigliceridi, ma determinavano una chiara diminuzione del colesterolo. La pih netta riduzione deI colesterolo è stata ottenuta con l'associazione di Clofibrat + L-T4. Tema:

Effetto ipocolesterolemizzante delle sulfaguanidine nei topi e nei ratti.

R e l a t o r i : VAN DEN BOSCH J. F., E Y s s E a H . J., JANSSEN G. A. - L e u v e n GIi OO. hanno studiato l'effetto ipocotesterolemizzante delle sulfaguanidine nei topi e nei ratti con una dieta priva di colesterolo e una ricca di colesterolo. Secondo le Ioro ricerche, Peffetto di questa sostanza dipende dalla inJbizione dell'assorbimento dei colesterolo (aumento della eliminazione degli steroidi neutri helle feci, ridotto assorbimento de1 colesterolo radioattivo). L'effetto è indipendente dalla flora intestinale poichè si può osservare anche in topi allevati

germ-/ree. Tema:

Farmaci anti-infiammatori nell'aterosclerosi sperimentale.

ReIatori: BAItEY J. M., BUTLER J., MAcNAMARA T., ROE N. - W a s h i n g t o n Tema:

Regolazione della biosintesi della lipasi lipoproteica del tessuto adiposo e della sua attivitä.

R e l a t o r i : NIKKILä E. A., PYKäCISTö O. - H e l s i n k i Gli OO. hanno osservato in ratti, a digiuno ed alimentati, un aumento dell'attivitä della lipasi lipoproteica del tessuto adiposo di 5-10 volte dopo 1-2 h dalla somministrazione di mg 50 di acido nicofinico/kg per via i.p. Si suppone che la sintesi della lipasi lipoproteica del tessuto adiposo sia dipendente dal contenuto intracellulare in acidi grassi. La riduzione degli acidi grassi ad opera del glucosio, de1 fruttosio, dell'insulina e dell'acido nicotinico induce la sintesi della lipolisi lipoproteica. Questa sintesi viene invece impedita da sostanze lipolitiche come la noradrenalina e la teofilIina. Tema:

La tipizzazione dell'iperlipoproteinemia; rapporto della situazione.

R e l a t o r e : FRED•ICKSON D. S. - B e t h e s d a L'O. ha riferito suIIa tipizzazione delle iperlipoproteinemie ed ha sostenuto che, con la determinazione della trigliceridemia e della colesterolemia, il tipo di iperlipemia anche senza metodi dietetici ed elettroforetici, in oltre il 90 % dei casi, può essere esattamente determinato. Lo schema di suddivisione non deve essere adottato troppo rigidamente, poichè in molti casi sono stati osservati anche dei passaggi da un tipo in un altro, soprattutto helle iperlipemie seeondarie, per esempio il tipo IV ed il tipo V ne1 diabete mellito. M.H,

N e i giorni 5 e 6 o t t o b r e 1 9 6 8 si è s v o l t o a M i l a n o il 13 ° Congresso della Societä Italiana per lo studio del metabolismo normale e patoIogico. Tema:

Recenti acquisizioni in tema di sfingolipidosi.

R e l a t o r i : C o P P o M., VENTURa E. - M o d e n a Le sfingolipidosi o glicolipidosi sono malattie dovute ad errori congeniti de1 metabolismo di lipidi complessi con struttura-base denominata ceramide e da altri costituenti variabili da molecola a molecola. Queste malattie sono di competenza prevalentemente pediatrica e neuro420

13°

CONGR. SOC. ITAL. PER LO STUDIO DEL METABOLISNIO

logica e raramente interessano l'adulto. Esse sono di notevole rilievo internistico in quanto determinano quadri clinici di notevole gravitä. Per spiegare l'errore metabolico possono essere avanzate essenzialmente tre ipotesi: 1) alterazioni del ricambio dei carboidrati e soprattutto del fruttosio, ipotesi oggi non piü sostenuta; 2) iperproduzione di sfingolipidi nei vari tessuti; 3) disturbo nel catabolismo degli sfingolipidi. Quest'ultima tesi ha ottenuto negli ultimi anni numerosi avalli sperimentali, tanto che Brady ha recentemente espresso l'opinione che tutte le sfingolipidosi dipendano da una difettosa degradazione enzimatica di normali composti precursori o di metaboliti intermedi. Tratterebbesi quindi non di un fenomeno quantitativo di accumulo (cioè di una tesaurismosi), ma di un'anomalia qualitativa di cui l'accumuIo è solo un'espressione. Sulle cause deIl'enzimopatia sono state avanzate alcune interpretazioni genetiche: si tratterebbe, secondo alcuni, di un gene soppressore capace di bloccare l'enzima specifico o di una malformazione nella sequenza degli aminoacidi dell'enzima che riflette un'alterazione ereditaria del DNA genico. Trattando della diagnosi di queste malattie, viene fatto cenno alI'utilitä della biopsia rettale con la quale è possibiIe esaminare frammenti di tessuto nervoso, della biopsia del nervo surale, della cultura di fibroblasti da biopsia cutanea. Anche lo studio dei linfociti con ricerca della loro vacuolizzazione può riuscire di notevole utilitä, come anche Io studio EEGrafico durante il sonno. Naturalmente grande valore diagnostico hanno i metodi biochimici che permettono determinazioni quantitative di diversi indici tessutali e bioumorali, particolarmente degli enzimi specifici oggi riconosciuti come interessati neI catabolismo di questi complessi molecolari. La terapia di queste malattie è oggi praticamente inesistente. Sarä possibile forse in futuro mediante l'apporto dell'enzima carente o la somministrazione appropriata di RNA messaggero. Tema:

Chimica e metabolismo dei glicolipidi.

R e l a t o r i : ZAMBOTTI

V.,

TETTAMANTI G . - M i l a n o

I glicolipidi sono lipidi costituiti da una porzione lipidica ed una saccaridica. Le differenze piü significative tra i vari glicolipidi risiedono nella parte saccaridica della molecola. Si distinguono cosi due gruppi: i glicolipidi neutri che contengono solo saccaridi neutri (mono-, dl-, tri-, tetra-glicosilceramidi), ed i glicolipidi acidi in cui almeno un saccaride ha una funzione acida. I glicolipidi sono contemporaneamente lipofili ed idrofili: quando prevale l'idrofilia le molecole formano, in soluzione acquosa, aggregati micellari. La loro via biosintetica principale è costituita prima dall'unione de1 galattosio alla sfingosina, pol de11'acido grasso. La demo~izione avviene per distacco prima del galattosio, poi dell'acido grasso. Vi sono differenze però nella biosintesi e nella demolizione tra i solfatidi ed i gangliosidi. Tema:

Le sfingolipidosi cerebrali come errori congeniti del metabolismo.

R e l a t o r e : JATZKEWITZ H . - M ü n c h e n Le sfingolipidosi cerebrali sono malattie ereditarie dovute all'accumulo di uno sfingolipide con corrispondenti alterazioni di determinate strutture. Talora il quadro patologico sconfina dal tessuto nervoso e interessa anche organi viscerali. L'accumulo dello sfingolipide è dovuto alla mancanza dell'enzima catabolizzante che nelle varie forme è differente: nella malattia di Gaucher v'è carenza di glucocerebrosidasi, nella leucodistrofia metacromatica manca la fosfatasi specifica, mentre nella malattia di Niemann-Pick manca la sfingomielinasi. Per quanto riguarda la malattia di Tay-Sachs il problema è controverso e complesso. T e m a : Nuovi criteri per la classificazione R e l a t o r e : SVENN~RHO5M L. - G ö t e b o r g

delle sfingolipidosi.

L'O. propone una classificazione delle sfingolipidosi basata sopra criteri biochimici. Cosl distingue tre gruppe le glicosilceramidosi, le galattosilcerebrosidosi e le fosforilceramidosi. Tra le glicosilceramidosi 1'O. riconosce i t r e seguenti gruppi: 1) le gangliosidosi suddivise in gangliosidosi Gin, G~~2 (0 malattia di Tay-Sachs) e G~~3; 2) le gIucosiIcerebrosidosi (0 malattia di Gaucher), che possono esser divise in forme infantili, giovanili e de11'adulto; 421

1 3 ° CONGR. SOC. ITAL. PER LO STUDIO DEL METABOLISMO

3) le digalattosillipidosi o malattia di Fabry. Delle galattosilcerebrosidosi fanno parte la sclerosi cerebrale diffusa di Krabbe e le lencodistrofie metacromatiche infantile e dell'adulto. Tema:

Anatomia patologica e biochimica delle glicolipidosi.

Relatori:

ALLEGRANZA A. - M i l a n o ; BO~RI P. - P e r u g i a

Gli OO. hanno proposto una propria classificazione nosologica che tenga conto del criterio eponimico nella denominazione di queste malattie. Successivamente hanno trattato le diverse forme dal punto di vista sia morfologico, compreso quello ultrastrutturale, sia biochimico, ufilizzando in parte la propria casistica ed' i propri dafi sperimentali. Tema:

Meccanismi di controllo della biosintesi dei gangliosidi e malattia di TaySachs.

R e l a t o r e : D A I a J. - K i n g s t o n Alcune entitä enzimatiche necessarie per la sintesi in vitro dei gangliosidi abbisognano detla presenza di cationi bivalenti come il Mg ++ ed il Mn +~. Inoltre i gangliosidi cosi formatisi sono capaci di legare ambedue questi cationi. Ciò fa pensare ad un meccanismo di regolazione feed back, per cui, quando il ganglioside neoformato raggiunge una concentrazione critica, sottrae al mezzo il catione bivalente inibendo cosl ]'enzima della biosintesi. Su questa base 1'O. ritiene possibile che la lesione metabolica dei gangliosidi consista in un deficiente meccanismo di regolazione della biosintesi del ganglioside che in tal modo si accumula. S.M. T e m a : Problemi diagnostici in alcune glicolipidosi di interesse neurologico, R e l a t o r e : CANaL N. - M i l a n o Dopo aver rilevato che i progressi della neurologia nel campo delle lipidosi cerebrali sono dovuti soprattutto agli apporti della biochimica e della neuropatologia, I'O. si chiede se anche la clinica, intesa nel senso classico del termine, possa oggi contribuire a risolvere i problemi diagnostici differenziali posti da queste forme. Sotto questa prospettiva viene discussa la diagnosi differenziale tra la forma infantile subacuta della malattia di Gaucber e la malattia di Niemann-Pick: i quadri clinici, ematologici e midollari delle due forme vengono confrontati. Vengono inoltre indicate alcune caratteristiche diagnostiche nei confronti della malattia di Wollman e della gangliosidosi generalizzata. Infine si elencano tutte le prove di laboratorio utili per porre diagnosi intra vitam (e senza ricorrere a biopsia cerebrale) di leucodistrofia metacromatica. Speciale rilievo è dato al dosaggio della arilsolfatasi-A nei gIobuli biancbi del sangue circolante: nei soggetti affetti dalla malattia l'enzima appare abnormemente basso, Viene da ultima proposta e commentata una check list per la diagnosi delle lipidosi cerebrali. (autoriassunto) Tema:

Aspetti psichiatrici e sociali delle glicolipidosi.

R e l a t o r e : VIANI F. - M i l a n o Le glicolipidosi presentano un quadro psichico variabile dalla normalitä al piü o meno rapido deterioramento intellettivo fino a giungere alla demenza. Naturalmente è importante l'etä alla quale la malattia esordisce, per cui si può dire che esistano &le modelli di patologia mentale: quello delle glicolipidosi ad esordio precoce e quello ad esordio tardivo. L'O. d'escrive il quadro psichico nei due tipi di lesioni. S.M. Tema:

Le cerebrolipidosi di interesse pediatrico.

R e l a t o r e : CaREDDU P. - M i l a n o Secondo uno schema recente, le cerebrolipidosi sono classificate in base a criteri di genefica e biochimica oltre che di morfologia e clinici. Sono incluse in questo gruppo le gangliosidosi (distinte in 4 forme ben definite): la malattia di Gaucher (glicocerebrosidosi), la malattia di 422

13°

CONGR. SOC. ITAL. PER LO STUDIO DEL METABOLISMO

Fabry (ceramide-esosidosi), la Ieucodistrofia metacromatica (cerebrosulfatidosi) e la malattia di Refamrn (da äccumulo di acido fitanico). Non sono invece incluse altre forme di idiozia amaurotica familiare tardiva, giovanile o dell'adulto, che alcuni AA. tendono a classificare come forme di degenerazione cerebroretinica familiare (malattia di Batten) nè la malattia di Hurler e le sue varianti caratterizzate anch'esse da un accumulo di gangliosidi a livello cerebrale, ma con discussa primitivitä o meno di queste alterazioni. Di particolare interesse è il problema diagnostico delle forme di cerebrolipidosi in etä pediatrica. L'esordio infatti può essere molto precoce, giä nel primo anno di vita, ma il quadro clinico in questi casi è largamente incompleto. I dati clinici sono inoltre raramente patognomonici e insufficienti si sono dimostrate anche le indagini che riguardano il quadro ematologico, il dosaggio delle frazioni lipidiche plasmatiche e tessutali, la morfologia delle cellule istiocitarie con accumulo di lipidi e I'indagine bioptica dei nervi periferici. Di maggiore utilitä per la diagnosi differenziale di queste malattie sono i dosaggi enzimatici a livello tessutale, in alcuni casi a livello urinario e, come è stato recentemente descritto, nei leucociti circolanti. (autoriassunto) T e m a : Ricerche su due /ratelli affetti da probabile malattia di Tay-Sachs. R e l a t o r i : NORDIO S., FREGONESE B., BERIO A. - G e n o v a (autoriassunto non pervenuto) Tema:

Localizzazione subcellulare dei gangliosidi nel cervello di ratto.

R e l a t o r i : BONALI F., PRETI A., DI DONATO S. - M i l a n o La presenza dei gangliosidi nei neuroni e la loro localizzazione nelle membrane sinaptiche e nella frazione mi¢rosomale è giä stata accertata. Con la presente ricerca ci siamo proposti di studiare la distribuzione dei singoli gangliosidi nelle diverse frazioni subcellulari. Da un omogenato di cervello di ratto in sac¢arosio M 0,32 sono state ottenute: una frazione mitocondriale (tra 900 x g e 11.500 x g) e due frazioni microsomali (tra 11.500 x g e 20.000 x g e tra 20.000 x g e 150.000 x g). Dalla frazione mitocondriale, mediante centrifugazione su gradiente continuo di saccarosio M 0,8qd,2-1,4, secondo De Robertis, si sono ottenute cinque subfrazioni: una contenente mielina, tre contenenti terminazioni nervose ed una contenente mitocondri. Sono stati isolati e determinati i singoli gangliosidi presenti in dette subfrazioni. I1 quadro qualitativo dei gangliosidi nelle diverse subfrazioni è costante mentre sono state rilevate notevoli differenze quantitative. Infatti i gangliosidi piü ricchi di acido sialico erano piü abbondanti helle subfrazioni contenenti terminazioni nervose, mentre i monosialogangliosidi erano presenti in maggior quantitä nella subffazione mielinica. La frazione microsomale, non ulteriormente subfrazionata, presentava un quadro qualitativo e quantitativo molto simile a quello dell'omogenato di partenza. (autoriassunto) Tema:

Citochimica delle cellule schiumose nelle lipidosi di Gaucher e di Niemann. Pick.

R e l a t o r i : MAURI C., SILINGARDI V. - M o d e n a Gli OO. hanno condotto ricerche citotopochimiche sistematiche sulle cellule schiumose (strisd e sezioni di milza e di midollo osseo) di 5 casi di malattia di Gaucher (G.) e di 2 casi di mälattia di Niemann-Pick (N. P.). Sono state impiegate numerose tecniche per l'evidenziazione citotopochimica dei lipidi, dei polisaccaridi, delle proteine, dell'emosiderina, di alcune attivitä enzimatiehe (varie ossido-reduttasi e idrolasi). Per gli opportuni conffonti, analoghe ricerche sono state effettuate sugli istiociti di milze normali o patologiche non lipidosiche. Gli OO. sono pervenuti alle seguenti conclusioni: 1) sia nelle cellule di Gaucher che in quelle di Niemann-Pick esiste un accumulo di lipidi di varia natura e almeno in parte Iegati a substrati proteici, come si può desumere dai tests di « smascheramento ». Tra i lipidi sono identificabili, in ambedue le situazioni morbose, glicoproteine, sfingomielina, acetalfosfatidi, esteffosfatidi, ma in misura notevolmente diversa nelle due lipidosi: predominano nel G. i glicolipidi PAS-positivi, nel N.P, le sfingomieline Bakerpositive, mentre le restanti ffazioni sono presenti in assai piccola quantitä in ambedue i tipi 423

1 3 ° CONGR. SOC. ITAL. PER LO S T U D I O DEL M E T A B O L I S M O

cellulari e oltretutto non sono evidenziabili con metodi istotopochimici in tutte le cellule schiumose. Tali reperti sono in buon accordo con i risultati delle indagini chimico-analitiche su omogenati di milza G. e di milza N.P., riferiti nella letteratura; 2) proteine sono presenti nelle cellule schiumose sia nel G. sia nel N.P., e prevalentemente nel reticolo citoplasmatico intervacuolare e interlamellare; 3) in una piccola aliquota di cellule schiumose del G. è dimostrabile emosiderina, non invece nelle cellule del N.P.; 4) i reperti citochimici concernenti le attivitä enzimatiche indagate (perossidasi, G-6-P-D, succinico deidrogenasi, fosfatasi alcaline, fosfatasi acide, ATPasi, 5-nucleotidasi, naftolAS-acetato esterasi) non si discostano sensibilmente dalla norma, nè appaiono sostanzialmente diversi nei due tipi cellulari, per quanto alcune reazioni (ATPasi, naftol-AS-acetato esterasi) risultino piü intense nel N.P. che nel G. In definitiva, l'indagine citotopochimica costitu{sce un utile, e spesso indispensabile, ausilio per la diagnosi citologica delle lipidosi e fornisce reperti in armonia con quelli desumibili dalle indagini chimico-analitiche, e con tecniche ben piü facilmente accessibili che non siano queste ultime, anche se necessariamente i dati rilevabili sono meno completi. E' necessario sottolineare che in ogni caso di lipidosi l'iudagine citotopochimica deve essere applicata con sistematicitä, seuza indulgere a eccessivi schematismi e semplificazioni, come proposto da alcuni AA. che, per la discriminazione tra malattia di Gaucher e malattia di Niemann-Pick, tendono ad impiegare due soll tests, il PAS e la reazione di Baker. (autoriassunto) Tema:

Nuovi metodi per lo studio della struttura dei gangliosidi e glicolipidi.

Relatore:

WI~GANDT H . - M a r b u r g

L'O. descrive un metodo per lo studio della struttura chimica dei gangliosidi. Esso si articola sulle tre seguenti fasi: 1) conferma dell'omogeneitä della porzione oligosaccaridica della molecola; 2) identificazione dell'oligosaccaride neutro contenuto nel ganglioside; 3) determinazione del punto di attacco del residuo, o dei residui, di acido sialico sull'oligosaccarid'e neutro. Tema:

Studio cromatografico quantitativo dei lipidi cerebrali in alcune glicolipidosi umane.

Relatori:

G a L L I C. - M i l a n o ; PAOLETTI R. - Cagliari

Gli OO. riferiscono sull'utilitä della cromatografia su strato sottile a due dimensioni per evidenziare le alterazioni specifiche dei lipidi del sistema nervoso nelle sfingo- e glico-lipidosi. Dopo averne descritta la tecnica, gli OO. ne hanno iIIustrato i risultati. T e m a : Lisosomi e glicolipidosi, R e l a t o r i : BACCINO F. M., DIANZANI iVL U. - T o r i n o Gli OO. considerano l'apparato lisosomale come il punto ove avviene il primitivo difetto metabolico caratteristico delle lipidosi. Come numerose ma]attie metaboliche con deposito intracellulare (tesaurismosi), le lipidosi sono caratterizzate da una degenerazione ctell'apparato vacuolare, dovuta a deficienza di un'idrolasi lisosomale e conseguente accumulo intravacuolare di una varietä di metaboliti derivanti da errori congeniti della sequenza degradativa dei glicolipidi. La degradazione dei glicolipidi, infatti, è normalmente assicurata da un sistema multienzimatico lisosomale. T e m a : La /ucosidosi. R e l a t o r i : DURAND P., BORRONE C., DELLA C E L L A G . - G e n o v a La fucosidosi è malattia determinata da deficit della ~-L4ucosidasi e caratterizzata da accumulo nei tessuti, soprattutto nel fegato e in minor quantitä nell'encefalo, di ceramidi tetrae penta-esosidi contenenti fucoso. Gli OO. descrivono 3 casi, giunti die loro osservazioni, ad esito letale. 424

1 1 ° CONGR. NAZ.

SOC. B I O L .

E MED.

NUCLEARE

T e m a : Proprietä della neuraminidasi cerebrale particolata e solubilizzata. R e l a t o r e : TETTAMANTI G . -

Milano

Ne1 cervello sono presenti almeno due tipi di neuraminidasi, una legata a strutture della subfrazione mielinica, l'altra legata alle membrane sinaptiche. L'O. descrive le loro caratteristiche e funzioni. S.M.

I1 4 e 5 n o v e m b r e 1968 si è t e n u t o in S a n r e m o I'll «' Congresso Nazionale della Societä di Biologia e Medicina Nucleare. T r a le relazioni p r e s e n t a t e r i f e r i a m o su quelle di interesse d i a b e t o l o g i c o . MILES L. E. M. e HaI~Es C. N. (Cambridge) hanno presentato alcune considerazioni generali relative ai metodi di determinazione degli ormoni polipeptidici effettuati con anticorpi marcati anzichè con ormone marcato. Secondo gli OO. questa raetodica consente una maggiore precisione e una piü atta sensibilitä. Se si utilizzano anticorpi marcati con 12sj per formate complessi ormoneanticorpo rivelabili per la Ioro radioattivitä e si rimuove l'eccesso di anticorpi marcati, la misurazione diretta della raäioattivitä del preparato consente il facile calcolo. Questo metodo, che gli OO. propongono di chiamare immunoradiometrico, consente infatti di ottenere una correlazione lineare tra la concentrazione ormonale del campione e il complesso « ormone:12SJ-anticorpo ». Altri vantaggi del metodo sono costituiti da una tecnica di purificazione e iodazione che contemporaneamente seleziona anticorpi ad alta affinitä, garantisce la protezione dei punti di legame e seleziona per eluzione gli anticorpi dopo la marcatura. E' possibile anche la selezione degli anticorpi in relazione alla loro reattivitä crociata. Sono stare suggerite anche tecniche riferibili a diversi livelli di iodazione dell'anticorpo, passibili di date origine a metodiche sempre piü sensibili. In particolare per quanto riguarda l'insulina questo metodo ha dimostrato notevoli vantaggi. BIZOLLON Ch. A. (Lyon) ha fatto anzitutto una serie di considerazioni generali sulle determinazioni radiometriche dell'insulina che lui stesso ha qualificato « filosofia della radioimmunologia ». Ha poi ricordato i tratti piü salienti delIa sua sperimentazione, giä resa nota altrove, sulla insulinemia in varie condizioni: I) le alterazioni della risposta insulinemica al glucosio nei figli « sani » di diabetici; 2) la conferma del dato giä noto di diabetici grassi ma con iporesponsivitä insulinica al glucosio; 3) la fugacitä della risposta insulinemica alla tolbutamide nei casi di nesidioblastoma. MOLINATTI G. M., MASSARAF., PENNISI F., SCASSELLATIG. A., STRUMIA E. e VANCHERIL. (Torino, Pisa) hanno riferito sui metodi radioimmunologici di determinazione dell'ormone somatotropo, ed in particolare su quello che utilizza la tecnica dei due anticorpi, giä largamente sperimentato per quanto riguarda l'insulina. Sono stati pol riportati i valori riscontrati con questo metod'o in soggetti normali, acromegalici e ipopituitarici, e gli effetti stimolanti della ipoglicemia nonchè quelli della iperglicemia. COVELLI I. (Napoli) ha richiamato Ie difficoltä concettuali e pratiche in tema dl iodazione delle proteine ai fini analitici ormonali. In genere la iodazione si propone Io scopo sia di marcare una molecola che ancora conserva le sue proprietä biologiche, sia di seguire con una piü spinta iodazione il declino dell'attivitä biologica e la reattivitä selettiva di diversi gruppi funzionali.

LAURENT J., MEJEAN L., CHERRIER P. e DEBRY G. (Nancy) hanno riferito sulla insulinemia determinata col metodo radioimmunologico in corso di tumori ipoglicemizzanti. Sono stati studiati 8 casi di tumore pancreatico e 1 di tumore extra-pancreatico. Si rilevano alcune difficoltä interpretative, legate al fatto che !'insulina di origine tumorale non sempre è immunologicamente reattiva, e che il tumore non sempre risponde ai normali processi eccitosecretivi. In particolare si fa notare in un caso la mancata inibizione da diazossido sulla increzione tumorale. Inoltre i soddisfacenti risultati ottenuti con le sulfonamidi sulla glicemia di questo stesso paziente pongon'o problemi nuovi. 425

l l ° CONGR. NAZ. SOC. BIOL. E MED. NUCLEARE

TURCO G. L., PAGANOP. G., VERCELLONEG., DAVID O. e SEGRE G. (Torino, Siena) hanno studiato l'omeostasi reciproca d el glucosio e dell'insu]ina, prima e dopo la perturbazione del sisterna, indotta attraverso o una infusione continua di glucosio alla velocitä di 0,5 g/min o attraverso una sornrninistrazione impulsiva unica di 0,33 g/kg di glucosio. I dati della glicernia e della IRI sono stati introdotti nel noto rnodello bicornpartirnentale adottato da SEGRE e Coll. e questo fu cornpletarnente risolto con la tecnica del computer digitale. L'analisi rnaternatica cos1 ottenuta perrnise di identificare quattro d iversi patterns di regolazione orneostaticä tra insulina e glucosio. GIORDANI R., NAVALESI R., PENNISI F., GIAGNONI P. e DONATO L. (Pisa) hanno condotto interessanti indagini sul catabolisrno della radioinsulina nell'uorno. L'elevata velocitä di degradazione del•'insulina in vivo cornporta serie difficoltä nello studio del tempo di rinnovarnento di questo orrnone. In parte tali difficoltä sono state superate utilizzando la rnetodica della doppia rnarcatura. Il rnetodo è basato sulla sirnultanea iniezione di due radioisotopi traccianti insulina-12sJ e Na 13~j. Con tale rnezzo è possibile valutare attraverso l'eliminazione urinaria del secondo la cinetica dello ioduro, che sarä rappresentativa anche di quello liberato dall'orrnone rnarcato; con ciò è possibile correggere i valori dello ~»Lj elirninato. ADEZATI L., PERRONI G. L., PRANDO R., PAGLIAINI R. e FERRINI O. (Genova) banno presentato ulteriori applicazioni del test al glucagone, corne proposto da ADEZATI e PRANDO, nella discrirninazione tra vati stati diabetici. Questa complessa prova funzionale è costituita dalla deterrninazione conternporanea del glucosio, dei NEFA e dell'IRI ad intervalli di tempo rnolto frequenti, fino a 3 h dopo ]a sornrninistrazione di mg 1 di glucagone i.v. I nuovi elernenti acquisiti sono costituiti dalla evidenziazione di particolari cornportarnenti della insulinernia nelle fasi piü tarde del test (dalla i a alla Y' h) non facilmente e direttamente correlabili alla contemporanea situazione di livello e di tendenza d el glucosio e dei NEFA. Si tratta particolarmente di brusche variazioni del coefficiente di decremento, rnolto costante nei soggetti normali, fino alla realizzazione di significativi picchi insulinici soprannumerari. La curva assurne quindi l'aspetto tipico delle oscillazioni non smorzate. Sono cost identJficati, oltre a quello della pura iporesponsivitä al glucagone, almeno altri tre tipi di risposta ben differenziabili tra loro. Anche in casi di diabete latente si è verificata l'anorrnalitä tipica nella rase discendente della curva insulinemica. FERRINI O., PRANDO R., PAGLIAINI R., FRESCO G., AMORE R. e ADEZATI L. (Genova) hanno ulteriorrnente indagato sul rneccanismo del contatto tra insulina e recettore. Nella presente nota è stato preso in considerazione il tessuto epatico, interposto tra il cornpartirnento della biosintesi insulinica e i rirnanenti tessuti sensibili all'orrnone. L'entitä della captazione di insulina, da parte di fettine di fegato in vitro, varia significativarnente nelle condizioni di digiuno protratto dell'anirnale donatore. La conternporanea presenza d'i glucagone nel rnezzo (6 rn~g/rnl) rnodificä pure sostanzialrnente l'entitä del legarne « insulina:recettore ». Crescenti quantitä di alburnina nel mezzo sono pure in grado di inibire progressivarnente la captazione epatica dell'insulina. Questo dato acquista suggestivitä se si fa riferirnento alla inibizione dell'attivitä insulinica ad opera del cornplesso sinalburninico di Wallance-Owen. SCANDELLARI C., FEDERSPIL G., TRISOTTO A., TIENGO A., MUGGEO M. e CREPALDI G. (Padova) hanno riportato un'analisi rnetodologica di rnodificazioni effettuate al rnetodo irnrnunoradiologico di Hales e Randle per la deterrninazione delI'insulina. Si sono ottenuti risultati di maggiore accuratezza. Con il rnetodo della diluizione isotopica hanno pol deterrninato il põol dell'insulina scarnbiabile dell'organisrno. CREPALDI G., TIENGO A., MUGGEO M., TRISOTTO A., FEDERSPIL G. e SCANDELLARI C. (Padova) hanno condotto studi col rnetodo radioirnrnunologico rnodificato negli iperinsulinisrni primitivi e secondari. Hanno seguito la distinzione tra iperinsulinisrni idiopatici, dovuti a prirnitiva iperfunzione delle cellule ~, e casi secondari, dovuti a fattori extra-insulari. Nel prirno gruppo sono cornpresi il nesidioblastorna e la ipoglicernia funzionale. In due casi di adenorna di Langerhans sono stati osservati valori abnorrni in risposta allo stirnolo glucagonico e glucidico. Piü frequenti appaiono i casi di iperinsulinernia indotta da orrnoni antiinsulari o da antagonisti plasrnatici dell'insulina. Col carico orale di glucosio è stato possibile differenziare gli iperinsulinisrni spuri, caratterizzati da elevati rapporti IRI/glicernia, da quelli veri, caratterizzati da bassi rapporti IRI/glicernia. L'acrornegalia e la rnalattia di Cushing rappresenterebbero condizioni in cui l'iperinsulinemia è secondaria ad uno stato di insulino-resistenza indotta. L.A.

426

STRUTTURA E METABOLISMO DELLE ISOLE DEL PANCREAS

N e i giorni 17, 18 e 19 f e b b r a i o 1969 si è s v o l t o ad U m e ä (Svezia) u n C o n g r e s s o sul t e m a : Struttura e metabolismo delle isole del pancreas. T e m a : Fosforilazione del glucosio nelle isole del pancreas di topo. R e l a t o r e : ASUCROFT S. J. H . - Bristol I1 glucosio, a concentrazioni superiori di quelle a digiuno, stimoIa la secrezione di insulina. Questo effetto è stato attribuito ad un glucorecettore. Le ricerche eseguite con mannoeptulosio e florizina hanno fatto ritenere che gli enzimi che regolano la veIocitä di fosforilazione del glucosio possano fornire la base biochimica del meccanismo dei glucorecettori. Matschinsky e Ellerman (1968) hanno fornito la prova che Ia fosforilazione del glucosio da parte degli enzimi intracellulari può limitare l'assunzione del glucosio nelle isole di topi obesi-iperglicemici. Le proprietä cinetiche delle attivitä glucosio-fosforilante e glucosio-6-fosfatasica sono state studiate in estratti (preparati per disintegrazione con gli uItrasuoni) di isole di topi normali separate con il metodo ddla collagenasi. L'attivitä glucosio-fosforilante è stata determinata mediante misurazione della formazione di glucosio-6-fosfato radioattivo da1 glucosio radioattivo, impiegando la cromatografia a scambio ionico o la glucosio-6-fosfato-deidrogenasi e la 6-fosfogluconato-deidrogenasi. L'attivitä della gIucosio-6-fosfatasi è stata determinata mediante misurazione spettrofotometrica della produzione di fosfato dal glucosio-6-fosfato adottando il metodo del verde di malachite. L'attivitä glucosio-fosforilante totale delle isole di topo era di 0,63 ! 0~017 U/g di isola umida. Sono state accertate due attivitä che corrispondevano, come proprietä, alla esochinasi ed alla glucochinasi. I1 V ...... dell'esochinasi a 37 °C era di 0,54 ± 0,05 U/g di isola umida e quello della glucochinasi era di 0,17 ± 0,06. ll Km (per il glucosio) dell'esochinasi a concentrazione fisiologica di ATP (2,5-5 mM) era di 0,075 _+ 0,01 mM; quello della glucochinasi era di 22 mM. L'esochinasi era inibita in maniera non competitiva (per quanto riguarda il glucosio) dal glucosio-6-fosfato (Kl 0,22 mM) ed in maniera competitiva dal mannoeptulosio (Kl 0,25 mM). La glucochinasi era inibita meno intensamente dal mannoeptulosio. Per I'attivitä della glucosio-6-fosfatas{ il V .... a 37" C era di 0,70 ! 0,10 U/g di isola umida. Il Km per il glucosio-6-fosfato era di 1,0 i- 0,14 mM. L'attivitä enzimatica era inibita dal glucosio. L'inibizione era mista e seguiva l'equazione Vm,,x/V = Km/s (1 + i/K,) + (1 + i/K2) con K1 ~ 9 mM e K 2 - - 3 8 mM. Anche il mannosio-6-fosfato era idrolizzato dagli estratti insulari. L'attivitä della glucosio-6-fosfatasi non era inibita dal mannosio, dal citrato o dalla tolbutamide; l'inibizione d'el glucosio non era invertita dal mannoeptulosio. T e m a : Il significato delle cellule insulari agranulari e ciliate. R e l a t o r i : BOQUIST L., FALKMER S. - U m e ä Oltre ai tre tipi di cellule parenchimali la cui presenza è nota nel tessuto insulare dei mammiferi, vale a dire le cellule ¢~1, c~2 e l~, esiste un quarto tipo cellulare, che risulta agranulare sia al microscopio ottico che a quello elettronico. Esso non fornisce le reazioni caratteristiche con i consueti procedimenti di colorazione differenziale tipici delle isole del pancreas. Nei mammiferi questa cellula è presente talvolta nelle isole normali, ma può essere il tipo cellulare predominante negli insulomi. Nelle isole dei ciclostomi e d e i teleostei le ce!lule agranulari si riscontrano frequentemente ed i risultati di ricerche precedenti eseguite dagli OO. hanno confermato la vecchia ipotesi che queste cellule siano dei precursori delle cellule granulate. Le cellule parenchimali ciliate erano stare osservate precedentemente nelle isole di mammiferi ed anche in altri organi endocrini. Non è completamente conosciuto il significato di queste cellule endocrine ciliate. Si afferma che esse siano numerose nei tessuti embrionali ed anche negli stati in cui si verifica un aumento del fabbisogno funzionale. In quest'ultima condizione sono stare osservate ciglia ed alterazioni morfologiehe delle ciglia associate a divisione cellulare amitotica. I1 significato delle cellule insulari agranulari e ciliate nei mammiferi è stato studiato contro questo sfondo, sia dal punto di vista morfologico che da quello funzionale, con particolare riferimento alla loro presenza in vari stati di aumentato fabbisogno funzionale e heile neoplasie. Gli OO. hanno eseguito studi morfologici sopra vari tipi di tessuto insulare. 1) Isole pancreatiche in criceti cinesi non diabetici. 2) Isole pancreatiche in cricefi cinesi spontaneamente diabetici. 427

S TRUTTURA E METABOLI SMO DELLE ISOLE DEL PANCREAS

3) Parenchima insulare rigenerante in: a) criceti cinesi trattati con allossana; b) ratti a cui è stata praticata la legatura del dotto; c) conigli sottoposti a pancreatectomia subtotale. 4) Tessuto insulare neoplastico: a) adenoma insulare che produce insulina nell'uomo; b) carcinoma insulare trapiantabile insulino-produttore nel criceto siriano. Per quanto riguarda i tessuti relativi ai punti 1° e 2 ~', gli OO. hanno visto che nelle isole di animali normali e spontaneamente diabetici la frequenza delle celIule agranulari e ciliari era bassa. Le ciglia venivano osservate sohanto nelle celIule ~ e nelle cellule dell'epitelio dei piccoli dotti pancreatici. In tutti i tre tipi di neoformazione insulare indotta sperimentalmente (punto 3°), sia nella rase precoce che in quella tardiva, le cellule agranulari erano presenti in abbondanza. Veniva osservato anche un marcato aumento della frequenza di cellule ciliate, ma si è visto che ciò si limitava aI periodo di rigenerazione dopo la somministrazione di allossana. Le ciglia erano ancora presenti nelle cellule [~ e nelle cellule dell'epitelio dei dotti. Nei due tipi di tessuto insulare neoplastico (punto 4°) erano presenti cellule tumorali agranulari mescolate con cellule contenenti granuli secretori di tipo ~. Ne1 carcinoma insu!are quasi anaplastico deI criceto le cellule agranulari costituivano il grosso del parenchima. Nel tessuto insulare neoplastico non si riscontravano cellule ciliate. Per controllare la possibilitä che le ceIlule agranulari possano produrre ormoni gastrointestinali, gli OO. hanno controllato l'eventuale presenza di gastrina e secretina in estratti d'i parenchima insulare normale e neoplastico contenenti una grande percentuale di cellule agranulari. I1 tessuto insulare normale impiegato era quello del teleosteo di mare Cottus scorpius edel ciclostoma Myxine glutinosa. Il tessuto tumorale insulare impiegato era rappresentato dal carcinoma insulare inoperabile deI criceto. Nessuno di questi estratti dimostrava prove di attivitä gastriniche o secretiniche quando veniva saggiato nel gatto e nel coniglio. I risuhati degli OO. confermano l'ipotesi che le cellule agranulari siano precursori immaturi delle cellule parenchimali granulate e che le cellule ciliate siano cellule ~ di recente formazione e/o cellule ~ mature capaci di rnoltiplicarsi per divisione cellulare amitotica in risposta ad una accresciuta richiesta funzionale. Tema:

L'attivitä di enzimi associati al metabolismo del glicogeno nelle isole di Langerhans.

R e l a t o r e : BROLIN S. E., BERN C. - U p p s a l a E' nota l'importanza del glicogeno nel metabolismo glucidico delle isole pancreatiche, e pertanto merita attenzione il complesso di enzimi deputati alla sua formazione ed alla sua degradazione. In campioni preparati con la microtecnica di Lowry è stata determinata l'attivitä di quattro enzimi nella catena del metabolismo del glicogeno. La determinazione è stata eseguita in ciascun caso mediante accoppiamento con una reazione deidrogenasica ed una misurazione fluorometrica del pirJdinnncleotide convertito in questa. L'andamento dell'attivitä era simile in linea di massima per il fegato, le isole e gli acini pancreatici, n d qual caso la glicogeno-sintetasi e la glicogeno4osforilasi costituivano gli enzimi limitatori della velocitä. Le isole sembravano dotate meglio degli acini per il metabolismo del glicogeno, ma le attivitä erano ovviamente basse in confronto a quelle epatiche. La bassa attivitä glicogeno-sintetasica può essere considerata un indice della limitata capacitä delle isole ad accumulare glicogeno. Un sostanziale accumulo richiederebbe perciò che questo processo venga favorito per lungo tempo da fattori di regolazione. I tentativi di esaltare l'attivitä enzimatica mediante un'iperglicemia indotta dal cortisone non hanno sortito risultati di rilievo. I1 livello di attivitä della glicogeno-fosforilasi era compatibile con i dati disponibili sulla velocitä di degradazione del glicogeno nelle isole, purchè la capacitä di conversione dell'enzima venga utilizzata per un'ampia estensione. T e m a : Meccanismi monoaminergici delle cellule Œ del pancreas. R e l a t o r e : CEGRELL L. - L u n d Mediante il metodo istochimico della fluorescenza di Falck e Hillarp, che consente la dimostrazione di certe monoamine biogene (dopamina, noradrenalina, adrenalina e 5-idrossitriptamina) e di alcune sostanze strettamente affini a livello cellulare, I'O. ha visto che le isole di Langerhans in mohe specie animali immagazzinano le monoamine. Sono state eseguite 428

STRUTTURA E METABOLISMO DELLE ISOLE DEL PANCREAS

anaIisi chimiche e microspettrografiche per stabilire l'identitä delle sostanze fluorogene. A questo scopo sono stati studiati il feto umano, la scimmia, il maiale, il cane, il gatto, il coniglio, la cavia, il criceto dorato, il ratto, il topo, l'oca, il piccione ed il pulcino. Un accumulo di monoamine helle cellule ~ è stato riscontrato nella scimmia, nel cane, neI gatto e n e l l e specie aviarie, ed inoltre nel coniglio e nel topo giovane pigmentato, ma non nel tipo albino o nell'adulto pigmentato. Le cellule c~, come pure le celIule ~, nel maiale e nella cavia fetale e neonata accumulano le monoamine. Nel feto umano e nella cavia adulta è stato finora riscontrato un accumulo soltanto nelle cellule fJ. Nelle cellule del pancreas endocrino di ratto e di criceto dorato non è stata riscontrata alcuna quantitä, istochimicamente dimostrabile, di monoamine. L'assenza di quantitä apprezzabili di monoamine nelle cellule insulari è stata sottoposta a ricerche istochimiche e farmacologiche nel topo albino adulto ed è stato visto che le cellule endocrine possiedono proprietä enzimatiche che indicano che i meccanismi monoaminergici possono operare anche in queste cellule. Oltre ad analisi della presenza di monoamine nelle cellule insulari sono stati studiati i nervi adrenergici contenenti adrenalina che innervano le isole. Una fitta rete di questi nervi è apparsa nel criceto dorato ed in misura alquanto inferiore nel cane e nel gatto, mentre in altre specie erano presenti solo di tanto in tanto alcune fibre. Le analisi chimiche e microspettrografiche del pancreas di cavia neonata hanno dimostrato la presenza di noradrenalina, di dopamina e di 5-idrossitriptamina. La concentrazione di noradrenalina corrisponde bene al numero di nervi adrenergici per lo piü riscontrati nel tessuto esocrino. Le cellule endocrine accumulano dopamina, una monoamina che si riscontra raramente nel tessuto periferico di mammifero, e/o 5-idrossitriptamina. La concentrazione di dopamina nel pancreas di cavia neonata ha dimostrato maggiori variazioni inter-individuali ed un reperto inatteso è stato rappresentato daI fatto che gli animali albini ne eontenevano una concentrazione significativamente minore degli animali pigmentati. Nel periodo post-natale la concentrazione di dopamina helle cavie pigmentate diminuiva e negli animali adulti si riscontrava una concentrazione molto scarsa. Nel maiale la maggior parte delle cellule del pancreas endocrino accumula le monoamine, alcune cellule contengono dopamina, mentre altre sembrano contenere sia dopamina che 5ddrossitriptamina. Le cellule contenenti monoamine nel feto umano, nella scimmia, nel coniglio giovane pigmentato e nel topo giovane pigmentato, e cosi pure nel piccione, presentano caratteristiche spettrali che indicano un accumulo di dopamina. Nel cane e nel gatto le caratteristiche spettrali delle cellule ~ indicano un accumulo di dopamina, che è talvolta concomitante con quello della 5-idrossitriptamina. La funzione di queste sostanze nella produzione ormonale è finora sconosciuta, ma un anelIo nel processo di comprensione di questo problema è stato ottenuto in un rumore trapiantabile delle cellule insulari del criceto dorato. Questo tumore contiene elevate concentrazioni di dopamina e di 5-idrossitriptamina, ma le cellule insulari degli animali portatori del tumore non contengono quantitä dimostrabili di monoamine. Cos L sotto l'aspetto delle monoamine, questi animali, almeno quantitativamente, possiedono due « sistemi di cellule insulari » molto diversi. Oltre alla dopamina e alla 5-idrossitriptamina le cellule tumorali contengono Dopa ed anche una sostanza finora non identificata, capace di produrre un derivato fluorescente sotto trattamento secondo il metodo di Falck e HilIarp.

Tema:

Le cellule ~ del pancreas nella patogenesi del diabete mellito umano.

R e ! a t o r i : CERASI E., L u F T R. - S t o c k h o l m Nella loro relazione gli OO. discutono il significato della diminuita liberazione insulinica che precede l'intolleranza al glucosio nell'insorgenza del diabete nell'uomo. I reperti ottenuti, impiegando un calcolo analogico dell'interrelazione tra glicemia ed insulinemia, concordano bene con l'ipotesi che l'insulina sia liberata da due diversi settori della cellula ~: un settore capace di operare una liberazione rapida ed un altro settore capace di operare una liberazione lenta. Sia i fattori genetici (diabete, prediabete) che i processi infiammatori (pancreatite cronica) influenzano primitivamente la capacitä della cellula ~ di operare una liberazione rapida dell'insulina, mentre il compartimento a liberazione lenta sembra piü resistente. In nessuna fase dello sviluppo deI diabete mellito, dal prediabete passando per la diminuzione della tolleranza al glucosio fino al diabete manifesto, è stato riscontrato un iperinsulinismo: neanche nell'obesitä connessa con diminuita tolleranza al glucosio. Perciò l'iperinsulinismo rilevabile in qualche animale da esperimento nei primi stadi del diabete sembra specifico di queste specie. Gli OO. presentano i dati ottenuti nei bambini, i quali confermano la suddetta ipotesi. Gli sforzi per modificare l'anormale liberazione di insulina nei soggetti prediabetici con ormoni ed agenti farmacologici verranno illustrati successivamente. 429

STRUTTURÄ E METABOLI SMO DELLE ISOLE DEL PANCREAS

Tema: Sintesi insulinica e secrezione di insulina da parte di isole di Langerhans

iso&te da criceti cinesi spontaneamente diabetici. Re]atore: CHANG A. Y. I criceti cinesi spontaneamente diabetici sono stafi selezionati sulla base dei valori glicosurici determinati con Test-Tape. Le isole di Langerhans isolate da questi animali contenevano una minore quantitä di insulina rispetto agli animali di controllo e le loro cellule ~ apparivano degranulate. Isole isolate da criceti diabetici e normali digiunanti, della stessa etä e dello stesso sesso, sono state utilizzate per studiare la velocitä di secrezione insulinica. In presenza di elevate concentrazioni di glucosio, si osservavano due fasi distinte di liberazione dell'insulina: I1 primo picco di liberazione si verificava anche in assenza di glucosio e sembra non fisiologico, probabilmente un artefatto che si verifica durante l'isolamento delle isole. La seconda fase di liberazione insulinica stimolata dal glucosio era inibka dall'epinefrina e dalla puromicina. Sia le isole di criceti normali che quelle di cricefi diabetici dimostravano la stessa risposta al glucosio per quanto riguarda la velocitä della secrezione insulinica. Tuttavia la quantitä di insulina liberata è inferiore nel caso delle isole di criceti diabetici. Isole isolate da criceti nutriti, che avevano ricevuto il 10 % di saccarosio nell'acqua da bere, sono state impiegate nelle ricerche sulla biosintesi dell'insulina. La miscela di incubazione conteneva leucina-14C e metionina-3H. L'insulina di nuova sintesi veniva rintracciata su una colonna di Sephadex G50 dopo parziale purificazione. Nelle prime 2 h di incubazione si è Iiberato pochissimo materiale radioattivo. Dopo 4 h una considerevole quanfitä di proteine marcate si è liberata nel mezzo ambiente, comparendo nella frazione proinsulinica nella filtrazione su gel. Tuttavia all'interno delle isole vi era pochissima proinsulina marcata. La maggior parte delle proteine marcate entro le Jsole appariva come insulina e materiaIi di dimensioni comprese fra quelle dell'insulina e della proinsulina. L'entitä dell'incorporazione degli aminoacidi radioattivi da parte delle isole di criceti diabetici era molto minore di quella delle isole di criceti normali.

Tema: Preparazione e proprietä dei granuli di deposito di insulina isolati da

mammi/eri. Relatori: COORE H. C., HELLMAN B., PIHL ]~., TÄLJEDAL I.B. - Umeä Granuli di deposito di insulina sono stati isolati da isole microdissezionate di topi obesiiperglicemici. I granuli sono stati separati mediante centrifugazione differenziale comprendente, nello stadio finale, la sedimentazione attraverso saccarosio 1,6 M. I1 preparato granulare veniva sottoposto ad un controllo della purezza con la determinazione delI'insulina, delle proteine e degli enzimi, unitamente all'esame al microscopio elettronico. I mitocondri ed i lisosomi erano in gran parte eliminati dal preparato finale, ma il reticolo endoplasmatico era un contaminante persistente. Una proporzione variabile di granuli insulinici rimaneva inclusa nelle vescicole membranose. Un metodo istochimico ha rivelato la presenza di un metallo pesante, probabilmente lo zinco, nei granu]i isolati. La stabilitä dei granuli, secondo quanto si poteva giudicare dalla proporzione di insulina sedimentabile nei preparati, è stata studiata in diverse condizioni. La stabilitä ottimale si osservava in mezzi di sospensione a pH 6 ed a bassa concentrazione ionica. La pressione osmotica del mezzo poteva variare largamente senza effetto sulla stabilitä dei granuli. A pH 7,4 i granuli erano piü stabili a 4 °C che a 37 °C. I granuli erano solubilizzati in condizioni di pH assai lontane da 6, in mezzi di elevata forza ionica ed in presenza di ATP 1 mM, citrato 2 mM e 1'1% di desossicolato. GIi OO. pensano che l'accumulo di zinco helle vescicole delle cellule possa contribuire alla stabilizzazione dei granuli di insulina.

Tema: Il ruolo dei composti sulfidrilici e dei metalli pesanti nella sintesi e nel-

l'accurnulo di insulina. Relatori: FALKMER S., HAVU N., BOQUIST L. - Umeä Benchè ricerche comparative sull'immunologia, la biologia e la biochimica dell'insulina abbiano dimostrato grandi variazioni tra le specie, si ritiene generahnente che i tre ponti - - S S - cisteinici siano comuni a tutti i tipi di insulina biologicamente atfiva. Dal momento che la biosintesi di quesfi ponti - - S S - - richiede un adeguato apporto helle cellule ~ di composti sulfidrilici (SH), come la cisteina ed il glutatione (GSH), si può supporre che quesfi ultimi composfi svolgano una parte importante nella sintesi di insulina in vivo. Analogamente ricerche comparative sulla presenza di metalli pesanti nelle isole pancreatiche, hanno dimostrato che le cellule lJ della maggior parte delle specie animali contengono metalli pesanti e che il Inetallo è

430

STRUTTURA E METABOLISMO DELLE ISOLE DEL PANCREAS

localizzato nei granuli di secreto. Queste osservazioni, come pure la ben nota affinitä chimica dell'insulina con i metalli pesanti nella sua cristallizzazione, particolarmente con Io zinco ed il cobalto, fanno pensare che i metalIi pesanfi siano importanti per l'accumulo dell'insulina. Contro questo sfondo gli OO. hanno controllato: 1) se il tessuto insulare con variabili quantitä di cellule ~ dimostrasse qualche significativa variazione del loro contenuto in GSH che potesse fornire un'idea sul livello di GSH nelle cellule ~; 2) se il tessuto insulare isolato contenga elevate concentrazioni di metalli pesanti; 3) se le prove eseguite per indurre una carenza dietetica di SH e di Zn possano determinare lesioni insulari e un diabete manifesto; 4) se gli inibitori mono- e di-tiolici possano influenzare il contenuto in GSH e Zn del tessuto insulare e determinare la necrosi delle cellule ~ con diabete; 5) se i tentativi di indurre uno « squilibrio di SH » n e l l e isole con la somministrazione di metionina in eccesso possano provocare alterazioni morfologiche delle cellule ~. I risultati ottenuti finora indicano che: 1) il contenuto in GSH era di 20-30 mg/100 g, senza tener conto dei fatto che il materiale studiato era costituito da tessuto insulare mescolato microdissezionato proveniente da topi obesi-iperglicemici con circa il 90 % di cellule ~ o da singole isole di sculpina con circa il 25 % di cellule ~. In tutte le specie studiate il contenuto in GSH del tessuto alveolare era solo circa la metä del valore delle isole; 2) non solo Zn (16 mg/100 g), ma anche Co (1,5 p.g/100 g) è stato riscontrato con determinazioni dell'assorbimento atomico su tessuto insulare sculpinico. Questi valori erano marcatamente piü elevati che a livello epatico, miocardico e sanguigno; 3) nel criceto cinese sia la carenza di Zn che quella di SH determinavano nna alterazione della tolleranza al glucosio nel 90 % degli animali e segni istochimici di una diminuzione del contenuto insulinico nelle cellule IS. In 2 criceti (su 38) nutriti con una dieta carente di cisteina-metionina si osserva in qualche isola una marcata degranulazione e necrosi, che colpiva selettivamente le cellule ~; 4) quando si controllavano con una DLs0, l'allossana e l'allil-isofiocianato determinavano una rapida e marcata diminuzione deI contenuto sia di GSH che di Zn delle isole di sculpina, mentre gli inibitori del ditiolo CoC12, CdC12 e NaAsO2 non determinavano alcuna marcata modificazione dell'uno e dell'altro. Nonostante queste differenze, tutti i tre inibitori ditiolici, ma non l'allil-isofiocianato, erano in grado di determinare necrosi selettive nella regione delle cellule ~ ed iperglicemia; 5) iniezioni intraperitoneali di 0,5 g/kg per 2 settimane hanno prodotto una atrofia del parenchima del pancreas esocrino nel criceto cinese ed in 2 animali (su 42) anche necrosi delle cellule insulari, influenzando selettivamente le cellule [2. Da questi risultati appare evidente che le cellule ~ reagiscono piü prontamente di altre cellule insulari a variazioni del contenuto di composti SH e di metalli pesanti. Questa osservazione sottolinea inoltre il ruolo principale svolto dai composti SH e dai metalli pesanti nella sintesi e nell'accumulo dell'insulina.

Tema: Aspetti quantitativi del carattere enzimatico e del contenuto insulinico delle isole umane. Relatori: G E P T S W . , GRÉGOIRE F., VAN ASSCHE A., DE GASPARO M. - Antwerp L'attivitä enzimatica ed il contenuto insulinico del tessuto insulare umano sono stati misurati con microtecniche quantitative. E' stato studiato materiale proveniente dai seguenti gruppi: 1) adulti non diabetici, 2) adulti diabetici, 3) neonati di madre che presentava una normale tolleranza ai carboidrati, 4) neonati di madre con ridotta tolleranza ai carboidrafi o diabete franco, 5) tumori delle cellule insulari insulino-secretori. Sono stati controllati i seguenti enzimi: lattico-deidrogenasi, isocitrico-deidrogenasi, glucosio-6-fosfato-deidrogenasi, transaminasi glutammico-ossaloacetica o fosfatasi acida. Gli OO. presentano inoltre i dati preliminari relativi all'adenosin-trifosfato. Differenze quantitative nel carattere degli enzimi del tessuto insulare sembrano esistere sia tra gli esseri umani e gli animali da Iaboratorio che tra uomini adulti e neonati. Nessuna differenza tra diabetici e non diabetici è stata finora riscontrata. Isole di diabetici e di neonati contengono meno insulina delle isole di adulti non diabetici. L'intolleranza materna ai carboidrati determina un aumento del contenuto insulinico delle isole fetali.

431

STRUTTURA E METABOLISMO DELLE ISOLE DEL PANCREAS

Tema:

Biosintesi della proinsulina e dell'insulina nel tessuto insulare di pesce.

R e ] a t o r i : GRANT P. T., REID K. B. M., COOMUS T. L., YOWNaSON A., THOMAS N. W . Preparati insulari di tumori umani e di pancreas di ratto (Steiner, 1967), o l'isola separata del merluzzo (Grant e Reid, 1968) sintetizzano un precursore a catena polipeptidica singola dell'insulina (proinsulina) dal quaie l'insulina può essere tratta mediante proteolisi. La distribuzione e la radioattivitä sia della proinsulina che dell'insulina sono state ora studiate in frazioni subcellulari preparate dopo aver marcato in vitro le isole di merluzzo con [U-~4C] fenilalanina per 45 min, e dopo ulteriore incubazione per 3 h in mezzo contenente fenilalanina non marcata. Dopo incubazione le isole sono state omogeneizzate in saccarosio 0,25 M contenente un inibitore tripsinico ovomucoide o il 0-p-nitrofenil-0-etil-fenilpropilfosfonato. Le frazioni microsomiche non contenevano quantitä apprezzabili di insulina e, dopo 45 min di incubazione, l'attivitä specifica delIa proinsuIina microsomica era circa 10 volte quella presehte in altre frazioni. Con uIteriore incubazione si aveva una rapida diminuzione della radioattivitä della proinsulina microsomica ed il '4C era presente principalmente in frazioni di « granuli » che sedimentavano a 130.000 g/min e a 225,000 g/min. In entrambe le frazioni « granulari » si aveva dapprima un aumento e quindi una progressiva diminuzione nel tempo deI1'attivitä spedfica della proinsulina insieme ad un concomitante aumento di quella dell'insulina. A1 contrario la frazione microsomica di tessuto insulare, che era stata incubata con [U-~4C] fenilalanina per 6 h, conteneva sempre materiale radioattivo corrispondente alla proinsulina, ma non all'insulina. Inibitori delle proteasi « seriniche » sono stati nsati in questi esperimenti, dal momento che ricerche al microscopio ottico ed elettronico indicavano che il tessuto insulare di merluzzo conteneva quantitä variabili fino a circa il 30 oB di cellule esocrine principalmente unite alla capsuIa di tessuto connettivo che circondava la massa di cellule ~. Sospensioni di cellule ~ preparate mediante rimozione della capsula, hanno dimostrato un contenuto solo di un quinto della attivitä chimotriptica ed ~-amilasica di isole intere; solamente tracce di cellule esocrine sono state osservate in preparati colorati. Frazioni granulari contenenti principalmente proinsulina marcata sono state ottenute da una sospensione di cellule ~ dopo incubazione con [U-14C] fenilalanina e la conversione del precursore nel prodotto è stata studiata mediante ulteriore incubazione delle frazioni granulari isolate a 15 °C. Questi risultati indicherebbero una sintesi microsomica della proinsulina e la sua successiva conversione ad insulina nei granuli citop]asmatici probabilmente mediante una proteolisi limitata. In questo senso la formazione, l'accumulo e la liberazione di insulina possono essere una forma di pinocitosi invertita. Tema:

Ricerche in vitro che suggeriscono un modello bi-compartimentale per la secrezione insulinica.

Relatori:

GRODSKY G . , LANDAHL H . , CURRY D . , BENNETT L. - S a n

Francisco

La liberazione di insulina è il risultato finale di nmnerosi fenomeni contemporanei e sequenziali. Gli OO. hanno studiato la proiezione nel tempo di questi fenomeni nel pancreas di ratto perfuso in vitro. In questo sistema la velocitä della liberazione di insulina è aumentäta ad intervalli di 30 sec durante un solo passaggio deI perfusato attraverso il pancreas. Come gli OO. hanno precedentemente dimostrato, la liberazione di insulina è multifasica. II pancreas libera prontamente insulina 30 sec dopo somministrazione di glucosio o di tolbutamide; la liberazione non è influenzata dal•a puromicina. Però nonostante il mantenimento di una concentrazione costante di sfimolazione, la velocitä di liberazione insulinica diminuisce nel giro di alcuni minuti. In quest'ultima rase il pancreas è comparativamente refrattario ad un'ulteriore stimolazione. Dopo 15 min il glucosio, ma non la tolbutamide, determina un secondo aumento della velocitä di liberazione di insulina, che aumenta durante la successiva perfusione. La seconda rase è inibita parzialmente, ma non completalnente dalla puromicina. Quando, dopo una prolungata stimolazione glucidica, il pancreas viene fatto riposare e pol ristimolato da un carico di glucosio, si verifica una secrezione insulinica superiore alIa norma. Cosi il glucosio produce nel pancreas uno stato refrattario o uno stato di ipersensibilitä che dipende dalla rase studiata. E' stato elaborato un modello matematico che riproduce strettamente le varie caratteristiche multifasiche della liberazione di insulina. I1 modello suppone due compartimenti di insulina di deposito che sono in relazione con la sua concentrazione. I1 compartimento labile piü piccolo è piü sensibile ad agenti che stimolano la Iiberazione di insulina e costituisce il luogo in cui avviene primitivamente la secrezione di insulina. I1 modello comprende anche un'azione di agenti come il glucosio per aumentare la produzione di un potenziatore teorico, che a sua volta attiva I'apporto di nuova insulina disponibile aI compartimento piccolo. L'esame delle costanti derivate dal modello per il pancreas di ratto perfuso dimostra: 1) il compartimento piccolo rappresenta circa il 25 oB de]l'insulina totale estraibile; 2) le velocitä di scambio tra il eompartimento grande e 432

S T R U T T U R A E M E T A B O L I S M O DELLE I S O L E DEL PANCREAS

quello piccolo sono lente, per cui una rapida stimolazione della Iiberazione di insulina determina un temporaneo esaurimento del comparfimento piccolo; 3) il glucosio e la tolbutamide agiscono probabilmente suUo stesso compartimento, benchè non necessariamente con Io stesso meccanismo; 4) la velocitä di dissipazione aspecifica deI potenziatore è lenta, per cui dopo aver sospeso il glucosio per un certo tempo continua l'aggiunta di insulina al compartimento piccolo (che produce un pancreas ipersensibile). I1 modello suggerisce, ma non può dimostrare, la nuova ipotesi che I'insulina prodotta di recente entri nel compartimento piccolo labile e costituisca l'insulina escreta di preferenza.

Tema: Consumo di ossigeno delle cellule 13 in rapporto alla liberazione insulinica. R e l a t o r i : HELLERSTRöM C., WESTMAN S. - Uppsala I1 consumo di ossigeno e la produzione di ~4CO2 sono stati studiati su isole di Langerhans isolate e sopravviventi di topi obesi-iperglicemici. E' stata raggiunta una sufficiente sensibilitä analiticä incubando le isole in recipienti in cui si potevano misurare le variazioni del volume dei gas nell'ordine di m~l 0,5. Perciò 1-5 isole microdissezionate corrispondenti ad un peso secco totale di ~g 1-20 sono stare sufficienti per un esperimento. Poichè in topi obesi-iperglicemici le isole sono composte per oltre il 90 % da cellule ~, ciascun Ixg di peso secco di tessuto insulare contiene circa 5.000 cellule ~. La frequenza respiratoria endogena di isole incubate in tampone fosfato di Krebs-Ringer è risultata costante per parecchie ore. L'aggiunta di glucosio ha determinato un'elevazione rapida e pronunciata della respirazione; un grado minore di stimolazione si osservava con il mannosio ed il fruttosio. Non è stato osservato alcun effetto con il galattosio, il L-glucosio, il 2-deossiglucosio, l'allosio, l'altrosio, il tagatosio, il talosio, lo xilosio, il lixosio, il L-arabinosio, il fucosio o lo xilitolo. Una lieve inibizione veniva registrata con il mannoeptulosio e la glucosamina. Anche queste ultime sostanze, come il 6-deossiglucosio, l'altrosio, il talosio, il malonato e lo iodoacetato sopprimevano la respirazione di isole pre-incubate con glucosio. Fra i metaboliti intermedi del ciclo di Krebs controllati, solo il citrato, il succinato e l'ossalacetato esaltavano la frequenza respiratoria. L'aggiunta di aminoacidi dimostrava che la valina e l'arginina non influivano sul consumo di ossigeno, mentre si otteneva una significativa stimolazione sia con l'alanina che con la leucina. Con il glucagone e l'epinefrina sono stati dimostrati effetti sulla respirazione insulare in quanto entrambe le sostanze inibivano l'assunzione di ossigeno. Esperimenti preliminari fanno pensare che il dibutiril-adenosin-3',5'-monofosfato ciclico possieda un'azione simile. Una modifica della tecnica äell'immersione ha reso possibile la determinazione contemporanea della produzione di ~4COz da precursori marcati con ~4C e della frequenza respiratoria insulare. La produzione di 14CO2 dal glucosio-U-14C aumentava con l'aumentare della concentrazione di glucosio ed era soppressa dal mannoeptulosio. I1 14CO2 prodotto dalla L-leucina-l-14C era di 2-3 volte superiore a quello prod'otto dalla L-leucina-U-~4C, il che indica una transaminazione ed una decarbossilazione di questo aminoacido da parte delle cellule ~ del pancreas. Gli OO. discutono i dati con riferimento alle conoscenze attuali dei meccanismi cellulari della liberazione di insulina.

Tema: Sul significato /unzionale del glicogeno delle cellule ~~ del pancreas. Relatori: HELLMAN B., IDAHL L.Ä. Umeä -

Si sa che il glicogeno è un costituente normale delle cellule [~ del pancreas di rnammifero. Secondo le ricerche degli OO. queste riserve di glicogeno non rappresentano metabolicamente dei depositi inerti, ma vengono rapidamente mobilizzate durante l'ischemia. Nell'esperimentazione esisteva una stretta correlazione tra il contenuto di glicogeno ed i livelli di glucosio ai quali venivano esposte le cellule ~. Le isoIe di topi obesi-iperglicemici contenevano per esempio 10 mmoli di residui glucosidici ( ~ 1,6 g di glicogeno) per kg di peso secco, il che equivale a circa 3 volte la quantitä riscontrata nei compagni di figliata magri. Un basso livello di glucosio era incompatibile con la creazione di riserve di glicogeno piü consistenti. I1 dibufiril derivato del 3,5-AMP ciclico ed anche i composti (glucagone e teofillina), che notoriamente aumentano la quantitä di questo nucleotide nelle isole pancreatiche, riducevano i livelli di glicogeno quando venivano controllati in un sistema in vitro con isole microdissezionate. L'epinefrina, che inibisce la sintesi del 3,5-AMP dclico mediante stimolazione dei loci recettori ~-adrenergici, aumentava, d'altra parte, il livello di glicogeno insulare. Si aveva una ri&azione del contenuto in glicogeno quando le isole microdissezionate venivano esposte alla glibenclamide, un potente composto ipoglicemizzante sulfanilureico. La mobilizzazione del glicogeno da parte della sulfanilurea si può spiegare in termini di un modificato « potenziale fosfato » che rende disponibile maggiori quantitä di AMP e di fosfato inorganico a spese dell'ATP.

433

S T R U T T U R A E N I E T A B O L I S M O DELLE I S O L E DEL PANCREAS

Tema:

U n possibile ruolo delle cellule pancreatiche ŒI e o:2 come regolatori locali della secrezione di insulina.

Rdatori:

HELLMAN B., LERNMaRK Ä. - U m e ä

In aggiunta ad una grande maggioranza di cellule ~ insuEno-produttrici, le isole pancreafiche di mammiferi contengono un considerevole numero di cellule ~~ e ~2. MeDtre le cellule ~2 rappresentano I'origine cellulare de1 glucagone, il prodotto di secrezione immagazzinato nei granuli ddle ceIlule ~~ rimane da idenfificare. Parecchi AA. hanno riferito che il glucagone stimoIa la Eberazione di insuEna. Quesm effetto de1 gIucagone risuha dipendere dalla presenza di quanfitä adeguate di gIicogeno neIle cellule ~. La risultante insensibilitä delle cellule ~ al glucagone in condizioni di ipoglicemia concorda con i precedenti concetti de1 glucagone come un regolatore Iocale ddla funzione delle cellule ~. Anche le celIule ~1 si potrebbero considerare dei possibili regolatori ddla secrezione di insuIina dalle cdIule ~ adiacenti. Le cellule ~~ sono morfologicamente pi~ strettamente affini alle cellule ~ che aIIe cellule ~2. Dopo aver misurato la quantitä di insulina secreta da isole di topo microdissezionate in diverse condizioni sperimentali, si potrebbe concludere che esiste almeno un inibitore della liberazione di insulina nelle isole de1 pancreas. Questo inibitore è probabilmente localizzato nelIe cellule ~~, come è dimostrato da1 fatm che un estratto acquoso di ceIlule ~~ de1 piccione riduce significativamente la quanfitä di insulina secreta in vitro. I1 supposto inibitore della Eberazione di insulina neIle celiule ~~ d d pancreas potrebbe essere identico dia gastrina, che inibisce la liberazione di insulina stimolata da1 glucosio alla concentrazione di soll 0,15 !~g/ml. T e m a : Netabolismo del R N A e sintesi dell'insulina. R e l a t o r i : JARRETT R. J., TRACK N. S., KEEN H . - L o n d o n Sono state condotte ricerche mediante un preparato in vitro di isole microdissezionate di pancreas di ratto dopo legatura del dotto pancreafico. L'incorporazione dei precursori de1 RNA si è verificata durante l'incubazione ddle isoie ed era aumentata quando il glucosio, o il mannosio, veniva aggiunto al mezzo di incubazione. L'anaIisi dei nucleotidi ottenuti per idrolisi de1 RNA estratto dimostrava che la maggior parte della radioatfivitä incorporata daIFacido orotico-6['4C], da1 glucosio-U-[~4C]-D o da11'ortofosfato-[32P] si trovava nella frazione uridinica. L'analisi del RNA estratto, usando uhracentrifugazione graduata de1 saccarosio ed elettroforesi deI gel di poEacrilamide, dimostrava che il grosso della radioattivitä era incorporato nella frazione a basso peso molecolare che conteneva sia il RNA messaggero (mRNA) che il RNA vettore (tRNA). Quando si incubavano le isole con metilmetionina-[3H] la radioattivitä si riscontrava di nuovo neHa frazione a basso peso molecolare, facendo pensare che il tRNA fosse marcato. L'incorporazione della parte marcata nel RNA in presenza di glucosio era inibita dall'actinomicina D; tuttavia l'antibiofico non inibiva l'incorporazione degIi aminoacidi marcafi neiia (pro)insulina. Questi esperimenti suggeriscono che, oltre ad operare sulla regolazione (trascrizione DNA ---> mRNA) della sintesi deI1a (pro)insulina, esistono almeno altri due meccanismi di controlIo: uno che implica la « modulazione » del tRNA (trasporto - mRNA -+ proteine) ed un altro, sensibiIe alla concentrazione de1 glncosio, che invece non impEca una nuova sintesi di RNA. Tema:

La fine struttura delle cellule ~ in condizioni normali e sperimentali.

Rdatore:

KERN H . F. - H e i d e l b e r g

Ricerche ultrastmtturali sulle isole di Langerhans in tre specie di ucceIE (piccione, pulcino, oca), helle cavie e in 3 pazienfi portatori di insuEnoma, hanno rivelato diversi gradi di densitä dei granuli delle cdlule ~. Questi andavano da granuli meno densi elettronicamente (ahrimenfi indicati come granuli 8) sino a forme osmofiliche intense (caratteristiche dei granuli ~) con stadi intermedi nella stessa cdIula ~. L'ipotesi che Ie differenze di densitä dei granuli ~ possano essere espressione di un ciclo secretore sconosciuto delle cellule ~, è stata controllata nella cavia sotto l'influenza delle cosiddette sostanze ~-citotossiche (COC12, sintalina A) ed in condizioni di iperglicemia protratta. I1 COC12 agisce primifivamente sul tessuto pancreafico esocrino conducendo ad una completa degranulazione e, dopo trattamento continuato, alla distruzione deIle cdlule esocrine. Nelle isole di Langerhans dopo 2-3 iniezioni di 15-20 mg/kg di COCI2 si possono riscontrare tutfi gE stadi di degranulazione e di progressiva vacuoEzzazione dei1e cellule ~. I1 trattamento cronico con piccole dosi di CoC12 (10 mg/kg) determina un maggior numero di gramlli meno densi 434

S TRUTTURA E METABOLISMO DELLE ISOLE DEL PANCREAS

elettronicamente in cellule ~ altrimenti tipiche. La sintalina A (2-3 mg/kg) in esperimenti acuti dimostra lo stesso effetto sulle cellule ~ senza influenzare il tessuto pancreatico esocrino. La prolungata iperglicemia, indotta nelle cavie mediante iniezioni giornaliere di prednisolone, o la distruzione delle cellule ~J con una dose singola di streptozotocina determinano un progressivo aumento di granuli meno densi elettronicamente nelle cellule ~ dopo parecchi mesi di condizioni diabetiche. Negli animali diabetici non esistono segni di degranulazione o di distruzione delle cellule c~. Tema:

Il meccanismo di secrezione insulinica emiocitica.

R e l a t o r i : LACY P. E., HOWELL S. L. - St. L o u i s Gli OO. passano in rassegna precedenti ricerche ultrastrutturali sulle cellule ~ stimolate

in vivo, che indicano che i granuli ~ sono liberati, per emiocitosi. Lo sviluppo del metodo della collagenasi per l'isolamento di isole da1 pancreas di mammifero ha reso possibile studiare in vivo !'effetto diretto di certi agenti sulla secrezione di insulina, la formazione di granuli (2 con l'autoradiografia al microscopio elettronico e l'isoIamento dei granuli secretori dalle isole. I1 destino intracellulare della leucina e della tirosina marcate con tritio è stato studiato con la autoradiografia al microscopio elettronico di isole isolate di ratti. La distribuzione dei grani d'argento nei diversi organuli è stata determinata a diversi intervalli dopo una marcatura pulsatoria di 5 min con gli aminoacidi marcati. La distribuzione percentuale dei grani d'argento era massima nel reticolo endoplasmafico dopo 5 min e quindi diminuiva gradualmente nell'arco di 1 h, mentre la percentuale di grani d'argento nei granuli ~ aumentava gradualmente in questo intervallo. Dopo 15 e 30 min si osservava un aumento della percentuale di grani d'argento nell'apparato di Golgi. Questo reperto indica che l'appar~to di Golgi è interessato in apparenza nella sintesi dei granuli ~. Gli OO. non sono riusciti ad identificare i granuli marcati specifici o i vacuoli condensanti nelFapparato di Golgi. Questo reperto è in contrasto con le ricerche originali in vivo eseguite dagli OO., che indicavano che l'apparato di Golgi non era interessato nella formazione dei granuli l~. Impiegando la centrifugazione differenziale ed un gradiente discontinuo di saccarosio è stata messa a punto una tecnica per l'isolamento di granuli di secreto da isole isolate di ratto. Ndla frazione erano presenti anche granuli ~, come è stato evidenziato dalla microscopia elettronica e dalla determinazione del glucagone. Nonostante la contaminazione con granuli ~, è stato possibile determinare l'effetto diretto di numerosi agenti sulla produzione di solubilizzazione dei granuli ~. Dei diversi agenti controllati solo il deossicolato produceva una solubili> zazione dei granuli. Quesfi reperfi hanno rafforzato il concetto che i granuli ~ sono Iiberafi da un processo di secrezione attiva e non da una semplice interazione fisicochimica con i granuli. Viene avanzata un'ipotesi sulla secrezione delle cellule ~, che si basa sopra l'esistenza di un sistema microtubulare nelle cellule ~. I microtubuli sono stati dimostrati in molti tipi celluIari diversi con metodi avanzati di fissazione. Gli OO. fanno una rassegna delle recenti ricerche, che indicano che la coIchicina lega con i microtubuli e provoca una rottura dei tubuli. Microtubuli sono stafi dimostrati helle cellule ~ ed in un caso è stato osservato un microtubulo che passava tra ]a membrana citoplasmatica ed il sacco membranoso che rivestiva un granulo ~. L'aggiunta di colchicina (10 6M) in vitro inibisce la stimolazione della secrezione di insulina da parte de! gIucosio (300 mg oB) su isole isolate di ratto. Gli OO. ritengono che il sistema microtubulare convogli i granuli ~ alla superficie cellulare, dove i granuli sono liberati per emiocitosi. Lo stimolo al sistema microtubulare può essere il risultato del metabolismo del glucosio con formazione di ATP e contrazione dei microtubuli. Tema:

Controllo della /unzione endocrina in culture d'organo di pancreas /etale di ratto.

R e l a t o r i : LAMBERT A. E., O R ¢ I L., KANAZAWA Y., RENOLD A. E. - G e n è v e Pancreas ottenuti da feti al 18 ° giorno dopo il concepimento sono stati mantenuti in cultura d'organo per periodi di tempo fino a 15 giorni. La cultura veniva eseguita di routine in un mezzo contenente una elevata concentrazione di glucosio (16,5 mM). Veniva analizzato l'aspetto morfologico degli espianfi coltivati al microscopio elettronico e se ne misurava il contenuto insulinico ogni 2 giorni. Fino ad 8 giorni di cultura lo stato di conservazione dei pancreas fetali sembra ottimo. I1 loro aspetto è paragonabile a quello che si osserva normaImente ne1 pancreas adulto. Il tessuto endocrino occupa una parte relafivamente grande della superficie totale e contiene almeno 2 tipi di cellule: cellule ~ numerose e moko granulate e alcune cellule contenenti tipici granuli ~. Se la cultura veniva protratta oltre gli 8 giorni, comparivano segni di degenerazione tissutale che aumentavano con l'andar del tempo. La biosintesi ddl'insulina sembra molto attiva per tutto il periodo di cultura: il contenuto insulinico aumentava linearmente con il tempo da 0,25 m U / m g aIl'inizio della cuItura fino a 13 taU/mg dopo 15 giorni. 435

S T R U T T U R A E M E T A B O L I S M O DELLE I S O L E DEL PANCREAS

Ricerche eseguite in vivo ed in vitro fanno ritenere che, ontogeneticamente, la capacitä di sintesi dell'insulina appare piü precocemente (prima de1 14° giorno di gestazione) di quella della secrezione dell'ormone (2 giorni dopo la nascita). In pancreas coltivati, la velocitä di biosintesi deIl'insulina è in relazione con la concentrazione di glucosio ne1 mezzo cuIturale, ma la liberazione di insulina non è stimolata dal glucosio, a meno che si aggiunga al mezzo di incubazione un altro agente stimolatore (glucagone, tolbutamide, caffeina). Questi reperti confermano ie precedenti osservazioni che la differenziazione endocrina costituisce un evento precoce nel pancreas fetale di ratto e suggeriscono che la differenziazione endocrina si possa verificare in culture d'organo in vitro. T e m a : Rigenerazione delle cellule delle isole pancreatiche di topo. R e l a t o r i : LOGOTHE'roPouLos J., BROSKY G . , KERN H . - H e i d e l b e r g Gli OO. riassumono brevemente le ricerche eseguite sull'attivitä mitotica delle cellule ~ in topi iniettati con anticorpi anti-insulina. La risposta mitotica era limitata, in apparenza per le seguenti ragioni: a) le cellule ~ che sintetizzano l'insulina ad elevate velocitä potrebbero essere incapaci di dividersi frequentemente; b) le cellule ~ neoformate potrebbero dimostrare una diminuita responsivitä mitotica alla stimolazione; c) le cellule ~ ad~lte potrebbero posse&re una Iimitazione intrinseca per cMi mitotici sequenziali multipli nel corso della Ioro vita. Quando la popolazione di cellule ~ veniva severamente ridotta dall'allossana o daIIa streptozotocina, le cellule ~ sopravvissute all'effetto citotossico presentavano un'onda mitotica heile prime settimane, che diminuiva ai livelli riscontrati nei controlli normoglicemici nel primo mese. In accordo con queste osservazioni, in gruppi di topi tenuti per 10 mesi con o senza trattamento insulinico si riscontrava una bassa percentuale di guarigioni da1 diabete. Non si otteneva nessuna prova che suggerisse una trasformazione delle cellule de1 dotto o delle celIule degli acini in cellule ~. Le cellule ~ non dimostravano una definita attivitä mitotica in alcun momento dopo Piniezione dei composti diabetogeni. Nelle prime due settimane dopo allossanizzazione si osservavano aumenti transitori dell'attivitä mitotica delIe celiule degli acini e dei dotti, che erano attribuiti allo stimolo delI'iperalimentazione e non erano in relazione con la formazione di nuove cellule ~. I1 fatto che il potenziale della divisione delle cellule f~ sia determinato daIla storia remota della popolazione celhalare, è stato dimostrato in topi obesi4perglicemici di etä evanzata. Contrariamente ai compagni di figliata magri, non si osservava alcuna significativa risposta mitotica ad uno stimolo standard da parte di anticorpi anti-insulina. Tema:

Paul Langerhans.

R e l a t o r e : LOUBATIÈRES A. - M o n t p e l l i e r L'O. ha commemorato ii centenario della scoperta delle isole deI pancreas da parte di Paul Langerhans. La sua conferenza era costituita da due parti. La prima è dedicata aIla vita di Paul Langerhans, alle sue origini, ai suoi genitori, ai suoi studi scolastici ed universitari, ai suoi lavori scientifid ed ai suoi interessi. Quindi 1'O. ha descritto la malattia di Langerhans e le cause della sua morte. La seconda parte si è occupata piü dettagliatamente delle circostanze in cui Paul Langerhans preparò la sua tesi di laurea in medicina. L'O. ha analizzato i passaggi essenziali del suo lavoro ed anche gli dementi di istologia pancreatica che attrassero in particolare l'attenzione di Paul Langerhans. I1 problema delle cellule centro-acinose è stato trattato particolarmente ed estesamente, mentre il problema delle cellule delle isole viene affrontato con semplicitä, non essendo possibile definime il ruolo. L'O. ha terminato definendo il posto occupato da Paul Langerhans nelle moderne ricerche sul diabete mellito. T e m a : L'origine cellulare del glaucoma pancreatico. R e l a t o r i : LUNDQUIST

G.,

BROLIN S. E., UNGER R.

H.,

]~ISENTRAUT A. - U p p s a l a

Sezioni criostatiche di pancreas sono state poste in una camera refrigerata fornita di una base trasparente, esaminate con illuminazione in campo scuro ed infine sezionate a mano libera. Nella cavia e neI cavallo gruppi di cellule ~2 sono stati riconosciuti in base alla refrigerazione del loro granuli isolati, liofilizzati e pesati. Con la stessa tecnica sono stati preparati per controllo acini pancreatici e campioni composti da cellule ~ e ~1. I1 glucagone è stato determinato mediante un metodo radioimmunochimico. Dai confronti tra i componenti del pancreas di cavia sembrerebbe che le cellule ~2 siano il luogo di formazione del glucagone. I bassi valori riscontrati in questa specie animale, però, 436

STRUTTURA E METABOLISMO DELLE ISOLE DEL PANCREAS

sembravano renderlo inadatto per una valutazione quanfitativa. Nel cavallo il contenuto ormonale di cellule ~2 isolate risultava nell'ambito del 2-3 oB di peso secco, mentre il glucagone era assente o presente solo in tracce negli altri campioni. Queste caratteristiche e la capacitä di deposito delle cellule ~2 hanno portato alla conclusione di una lnro specifica funzione ormonale. Poco si sa sulla velocitä dei processi interessati nelIa liberazione deI glucagone, ma il deposito cellulare sembra abbastanza elevato per rar fronte alle richieste di una veloce risposta secretrice. Tema:

Aspetti biochimici, /armacologici e fisiologici del sistema ~-cellulare adenilciclasi4osfodiesterasi.

Relatori:

MALAISSE W . , MALAISSE-LAGAE F. - B r u x e l l e s

L'attivazione del sistema [~-cellulare adenilciclasi ad opera del glucagone, dell'ACTH o del TSH, e l'inibizione della fosfodiesterasi da parte della caffeina o della teofillina hanno determinato un potenziamento dell'azione stimolante del glucosio, del mannosio o della leucina sulla secrezione di insulina. Il ribosio, il ribitolo e lo xilitolo non stimolavano la secrezione di insulina in assenza di glucosio e, pertanto, non venivano utilizzati come substrati per l'effetto di potenziamento degli agenti ormonali e farmacologici. Nessuno dei potenziali inibitori della adenilciclasi (insulina, prostaglandina, acido nicotinico, acido 5-metilpirazolo-3-carbossilico, acido 3-metil-5-isossazolo-carbossilico) riduceva l'azione stimolante del glucosio, del glucagone o della teofillina. Tuttavia l'imidazolo (1 mg/tal) sopprimeva l'effetto di potenziarnento del glucagone e riduceva sia l'azione stimolante del glucosio che l'effetto potenziatore della teofillina. L'effetto inibitore dell'imidazolo sulla secrezione indotta dal glucosio era superato ad elevate concentrazioni di glucosio. L'imidazolo non riusciva ad influenzare l'azione stimolante della glicodiazina e della glibenclamide. Un fattore digiunale, probabilmente l'enteroglucagone, potrebbe essere l'attivatore fisiologico del sistema adenilciclasico. Questo fattore agiva sulla secrezione di insulina esattamente co*ne il glucagone pancreatico: esaltava I'azione stimolante del glucosio e della leucina, ma era inattivo in assenza di substrato o con la contemporanea presenza di glucosio e di mannoeptulosio. Questo effetto di potenziamento non si osservava con estratti duodenali o cardiaci. Tema:

Attivitä elettrica nelle cellule insulari del pancreas.

R e l a t o r i : MATTHEWS E. K., DEAN P. M. - Sheffield Le cellule insulari di topo possiedono normalmente un potenziale di membrana di - 2 0 mV in confronto ad un valore di - - 4 1 mV registrato nelle cellule acinose circostanti (Dean e Matthews, 1968 a, b). Sono stare eseguite in vitro misurazioni in segmenti di pancreas di topo; le isole di Langerhans venivano esposte mediante microdissezione e si re~istravano i potenziali transmembranosi con microelettrodi di vetro, con metodica personale. Si suppone che le ce]lule insulari fissate fossero costimite in prevalenza da ceIIule ~, dal momento che il rapporto ~/~ nelle isole di topo è circa 1:9. Aumentando la concentrazione del D-glucosio ne1 mezzo di Krebs-Henseleit da 2,7 mM a 16,6 mM, o esponendo le cellule al D-mannosio 20 mM, alla Ieucina 10 mM o alla tolbutamide sodica 0,7 mM, si determinava la comparsa di fluttuazioni spontanee caratteristiche de1 potenziale di membrana delle cellule insulari: quesfi potenziali d'azione avevano un'ampiezza di 1-4 tuV. La variazione sistemafica della concentrazione del D-glucosio rivelava una notevole sensibilitä de11'atfivitä elettrica helle cellule insulari al D-glucosio. Ciò era molto evidente nell'ambito di 5,6 mM-8,4 mM, il che è partico]armente interessante, dato che ]a glicemia normale nel topo (5,6-6,7 mM) si trova entro questo ambito. La curva dei rapporti tra attivitä elettrica (inddenza del potenziale d'azione) e concentrazione del glucosio era sinusoidale. Essa dimostrava una soglia a circa 4 mM ed~un massimo a circa 28 mM; il valore di mezzo massimo era all'incirca di 7 mM. CosL mentre nessuna cellula presentava potenziali d'azione ad una concentrazione de1 D-glucosio di 2,8 mM, nel 68 oB delle celluIe si osservava l'attivitä quando la concentrazione era aumentata a 8,4 mM. A1 di sopra ddl'ambito pih vasto di concentrazione de] D-glucosio, da 0 a 27,7 mM, il potenziale di membrana appariva glucosio-dipendente. I1 rapporto era tale, che un aumento di 10 volte della concentrazione del D-glucosio extracellulare d'iminuiva il potenziale di membrana di 6 tuV. Contrariamente al D-glucosio e al D-mannosio, che inducevano potenziali d'azione helle cellule insnlari, ii L-glucosio 16,6 mM, il D-galattosio 50 mM, la D-glucosamina 20 mM, il 2-deossi-D-glucosio 20 mM, il 3-0-metil-~-D-glucosio 25 mM, il D-mannoeptulosio 24 mM, il D-fruttosio 50 mM, il D-ribosio 20 mM, il D-xiIitolo 50 mM e il n-octanoato sodico 10 mM non determinavano alcun potenziale d'azione. L'allossana dava inizio ad una rapida d'epolarizzazione irreversibile delle cellu]e insulari; il L-glucosio 16,6 mM, il D-galattosio 50 mM, la D-glucosamina 20 mM, il 2-d'eossi-D-glucosio 437

STRUTTURA

E METABOLISMO

DELLE

ISOLE

DEL

PANCREAS

20 mM, il 3-0-metil-~-D-glucosio 25 mM, il D-mannoeptulosio 24 mM, il D-fruttosio 50 mM, il D-ribosio 20 mM, il D-xilitolo 50 mM e il n-octanoato sodico 10 mM non determinavano alcun potenziale d'azione. L'allossana dava inizio ad una rapida depolarizzazione irreversibile delle cellule insulari di topo, da --20 mV a - 1 0 mV. Le cellule acinose non erano influenzate e rimanevano ad un potenziale stabile di circa - 4 0 mV per tutto il tempo. Il pre-trattamento con D-glucosio 16, 6 mM proteggeva le cellule insulari dall'effetto depolarizzante dell'alIossana. Mentre il topo è suseettibile alI'azione diabetogena delI'allossana, la cavia ne è resistente. I risultati degli OO. banno confermato ciò. I1 potenziale medio di membrane delle cellule insulari di cavia era di circa - 2 0 mV e queste cellule non si depolarizzavano anche quando la concentrazione di alIossana aumentava a 15 mM. L'induzione di potenziali d'azione nelle cellule insulari ad opera di stimolanti della secrezione insulinica è indicativa di un effetto selettivo sulla permeabilitä della membrana cellulare. Tenendo conto deI fabbisogno ionico per la Iiberazione di insulina, un tale effetto biofisico avrä probabilmente una importanza fondamentale nel processo di accoppiamento stimolo-secrezione.

Tema: II ruolo della via del pentosoffos/ato nella secrezione insulinica. Relatori: MONTACUE W., TaYLOR K. W. - London E' noto da tempo che i tessuti endocrini come l'ipofisi, il surrene, la tiroide o le celIule del pancreas sembrano possedere una via attiva del pentoso-fosfato, ed ora molti ricercatori hanno ipotizzato che l'attivitä di questa via sia in relazione con l'attivitä secernente. Sono stare intraprese ricerche, con l'impiego di isole di Langerhans isolate, preparate per digestione collagenasica dal pancreas di ratto, allo scopo di studiare il ruolo della via del pentoso-fosfato nella secrezione di insulina. Le prove che la via deI pentoso-fosfato può essere associata alla secrezione derivano in primo luogo dallo studio dell'effetto sulla liberazione di insulina dei pentosi e d e i derivati dei pentosi, come il ribosio, lo xilitolo ed il ribitolo, che notoriamente vengono facilmente metaboIizzati attraverso questa via metabolica. Tutti promuovono la liberazione di insulina dalle isoIe di mammifero con la stessa efficacia del glucosio. Questi risuItati sono stati confermati da molti altri studiosi. Inoltre sono stati misurati Iivelli intracellulari di 6-fosfogluconato ed è stato dimostrato che essi aumentavano in concomitanza con la secrezione di insulina, quando l'isola viene stimolata da un diverso gruppo di agenti come il glucosio, la tolbutamide, il citrato, l'octanoato e la teofillina. Con una crescente concentrazione extracellulare di glucosio non si ha alcun aumento del 6-fosfogluconato delle cellule insulari o della secrezione di insulina fino a 5 mM; al di sopra di questa concentrazione sia la secrezione che il livello di 6-fosfogluconato aumentano paralIelamente. GIi OO. forniscono le prove che fanno pensare che il metabolismo del glucosio attraverso la glicolisi ed il ciclo di Krebs non sia direttamente in relazione con la secrezione di insulina. I1 possibile ruolo della via del pentoso-fosfato nella liberazione di insulina è stato discusso criticamente.

Tema: L'attivitä di liberazione insulinica di estratti di intestino suino. Relatori:

MOODY A. J., MARKUSSEN FRIES A . - Copenhagen

J.,

SUNDBY

F.,

STEENSTRUP

C.,

SCHAICH

Sono stati preparati estratti etanolici acidi di cuore, duodeno ed ileo piü digiuno (TOT) di maiale. L'estratto TOT è stato frazionato su Sephadex e su DEAE Sephädex. L'immunoreattivitä glucagone-simile (GLA) è stata determinata mediante radio-immunodeterminazione. La secretina nelle frazioni è stata misurata con il metodo di Jorpes e Mut di determinazione in vivo nel gatto. L'attivitä della pancreozimina è stata valutata in alcune delle frazioni con la determinazione in vivo sul gatto e con una radioimmunodeterminazione per una sequenza parziale della molecola deIla pancreozimina. Le attivitä di liberazione dell'insulina (IRI) di questi materiali sono stare determinate usando isole di ratto isolate in vitro. Gli estratti di cuore e di duodeno (50 I~g/mI) erano inattivi sulla liberazione di insulina; alla stessa concentrazione il glucagone pancreatico ed il TOT aumentavano significativamente (P = 0,01) la liberazione insulinica. Alcune delle frazioni derivate dal TOT erano prive di IRI, se saggiate ad una concentrazione di 50 I~g/ml. Quattro delle frazioni derivate dal TOT mediante cromatografia su DEAE Sephadex aumentavano la Iiberazione di insulina da parte delle isole isolate. La concentrazione minima attiva era di 0,5 ~g/ml e l'effetto di queste frazioni aumentava con l'aumentare della concentrazione nell'ambito di 0,5-250 !tg/ml.

438

S T R U T T U R A E M E T A B O L I S M O DELLE I S O L E DEL PANCREAS

Il contenuto degli ormoni conosciuti in questi materiali è stato confrontato con il loro contenuto di IRI. La secrezione di IRI non è provocata dalla secretina e probabilmente non è provocata dalla pancreozimina. In tutti gli stadi di purificazione I'IRI segue la GLA. Non esiste una correlazione quantitativa tra il contenuto di GLA delle frazioni e la loro IRI. Si conclude che, benchè la GLA sia associata alla IRI, non esistono ancora prove che le &ae attivitä siano provocate dalla stessa molecola. Tema:

Con/ronto /ra isole coltivate e trapiantate di cavia.

Relatore:

MOSKAL~WSKI S.

Isole isolate da pancreas di cavia adulta mediante digestione collagenasica sono state mantenute in cultura d'organo. Le cellule ~ di isole coltivate nell'ambito fisiologico della concentrazione di glucosio erano considerevolmente degranulate. Questa degranulazione era ancora piü avanzata nelIe isole coltivate ad elevata concentrazione di glucosio. Per confronto sono stare trapiantate isole appena isolate, insieme con sospensione di inchiostro di china, nel pancreas, nei testicoli, nei muscoli o aI di sotto della capsula renale. Le cellule ~ di isole trapiantate in tutti gli organi erano degranulate nella stessa misura. Questa degranulazione era iieve in confronto alle celIule /~ del ricevitore e molto meno pronunciata che nella cultura. Isolotti con cellule che si erano degranulate durante la cultura, dopo il trapianto hanno recuperato un grado di granulazione simile a quello che si aveva nelle isole trapiantate subito dopo l'isolamento. Le ragioni possibili della degranulazione delle cellule l~ in vitro ed in vivo sono stare d'iscusse dagli OO. T e m a : Ricerche sopra le cellule miste endocrine ed esocrine. Relatori:

O R c I L., ReNOLD A. E., ROUILLeR CH. - G e n è v e

Con il microscopio ottico parecchi AA. hanno descritto la trasformazione delle cellule acinose in cellule endocrine in diverse specie animali ed in diverse condizioni sperimentali. Tuttavia altri AA. hanno recisamente affermato che questa trasformazione non si può verificare. Finora non sono state presentate prove irrefutabili nè daII'uno nè dall'altro gruppo di ricercatori. Precedentemente sono state presentate prove di trasformazione di cellule acinose-insulari nel topo spinoso, l'Acomys cahirinus, specialmente in animali che avevano sviluppato di recente una sindrome diabetica. GIi OO. si sono dedicati ad un nuovo studio di questo problema nel topo spinoso, con particolare riferimento ad animali con diabete conclamato di parecchi mesi di durata. E' stata di nuovo confermata la presenza di una trasformazione delle cellule acinose insulari nel pancreas del topo spinoso diabetico e questo reperto è stato esteso fino ad includere l'accumulo di glicogeno, tipico delle cellule ~ end'ocrine entro « cellule intermedie » prevalentemente esocrine. Sembrerebbe, pertanto, che le cellule <
Isolamento e caratterizzazione istochimica delle cellule ~ insulari.

Relatore:

PETERSSON B. - S w e d e n

Cellule isolate sono stare preparate da isolotti pancreatici microdissezionati di cavia e di topi obesi-iperglicemici. Le cellule isolate sono stare colorate con metodi di colorazione differenziale cos~ da classificare le cellule ~~, ~2 e iS. La massa secca delle singole cellule insulari è stata determinata al microinterferometro. Nelle cavie la massa secca delle cellule ~2 era quasi doppia di quella delle cellule ~. La deplezione dei depositi di insulina nelle cellule ~ di topi obesi con siero anti-insulina e la somministrazione di glucosio riducevano il peso secco di queste cellule di circa il 15 oB in confronto alle cellule non deplete. Le cellule insulari libere sembravano perfettamente adatte per studi citochimici. La localizzazione intercellulare di alcuni enzimi ossidativi ed idrolitici è stata cosl dimostrata distintamente. Dopo iniezioni intraperitoneali di streptozotocina nelle cavie, la maggior parte degli animali presentava una iperglicemia transitoria ed un ritardo della crescita corporea. Un mese d~opo le iniezioni, le analisi ist01ogiche dimostravano che le isole pancreatiche erano composte quasi esclusivamente da cellule ~1 e ~2 con una predominanza dell'ultimo tipo cellulare. Studi preIiminari del consumo di ossigeno di isole isolate da questi animali dimostravano che l'aggiunta di D-glucosio determinava una lieve inibizione della frequenza respiratoria. A1 contrario, le cellule insulari d i cavie normali rispondevano alla somministrazione di glucosio con un marcato aumento d d consumo di ossigeno. I risultati suggeriscono che il metabolismo del glucosio dei due tipi di cellule c~ sia diverso da quello delle cellule ~. 439

S T R U T T U R A E M E T A B O L I S M O DELLE ISOLE DEL PANCREAS

Tema:

Istochimica comparativa delle isole di Langerhans nel pancreas di mammiferi.

R e l a t o r e : P~TKOV P. E. L'O. ha compiuto lo studio istochimico comparativo su enzimi, Zn e lipidi nelle isole di Langerhans dei seguenti mammiferh uomo, pecora, bovini, maiale, cane, gatto, coniglio, criceto, ratto bianco e cavia. Le cellule insulari nei mammiferi manifestano una maggiore atfivitä in confronto alle cellule acinose per i seguenti enzimi: G-6-PDH, ISDH, NADPTR, G-6-P-asi, ATP-asi e AcP-asi. Inoltre si rivela in queste cellule un maggiore deposito di Zn. I due principali tipi cellulari nelte isole d1 Langerhans, le cellule ~ e ~, presentano anch'esse delle differenze. Le cellule ~ manifestano una maggiore attivitä per gli enzimi indicati in confronto alle cellule ~. Nella maggior parte degli animali le cellule ~ contengono solo G-6-P-asi e Zn. Nel pancreas endocrino di mammiferi si rivelano alcune differenze istochimiche a seconda della specie animale. Per esempio: la G-6-P-asi si rivela nelle cellule ~ delIa cavia, deI maiale, del cane, deI gatto, del coniglio e dei bovini, ma non è presente nelle stesse cellule dell'uomo, del ratto bianco e del criceto. L'AcP-asi compare sono nelle cellule ~ del criceto, del ratto bianco e del topo bianco, ma manca nelle cellule insulari del maiale, delI'uomo, del coniglio e della cavia. Nel pancreas di pecora, di bovini e d e l gatto è presente sia nelle cellule ~ che in quelle ~. Lo Zn è scoperto istochimicamente nelle cellule ~ di parecchi animali: criceto, uomo, maiale, cane, coniglio, topo e gatto. Nel ratto bianco lo Zn è Iocalizzato in maggiore quantitä heile cellule ~, ma non si riscontra nella cavia, nella pecora e nei bovini. Le reazioni dei fosfolipidi e degli acetalfosfatidi presentano una maggiore quantitä di lipidi nelle cellule ¢~ della cavia, del coniglio e d e l criceto in confronto alle cellule ~. Le reazioni sopra indicate sono però dello stesso grado per le cellule 0t e ~ neI ratto bianco e nel topo bianco. I risultati dimostrano che le isole di Langerhans del pancreas in ciascuna specie di mammiferi hanno un loro « profilo istochimico » peculiare. Tema:

Il metabolismo del glucosio delle isole del pancreas.

R e l a t o r e : RANDLE P. J. - Bristol I1 metabolismo del glucosio è stato studiato in isole preparate da pancreas normale di topo mediante digestione collagenasica. Finora è stato possibile misurare soltanto l'ossidazione del glucosio in base alla produzione di anidride carbonica marcata con 14C proveniente dal glucosio marcato in posizione 1 o 6 o uniformemente marcato. I1 rapporto tra la quota di ossidazione de1 glucosio e la concentrazione del glucosio è sinusoidale; la soglia era aU'incirca di 80-100 mg/100 tal, la Km era all'incirca di 120-140 mg/100 rel. I1 V ..... dell'ossidazione de1 glucosio era di 4,2 I~moli di glucosio/g di isola umida/h. L'ossidazione del glucosio è inibita dal mannoeptulosio, ma non dalIa florizina, dalla N-acetilglucosamina o daI 2-deossiglucosio. L'inibizione da parte del mannoeptulosio era del 50 °76 a 0,2 mg/tal e virtualmente del 100 076 con 3 mg/tal (conc. glucosio 1,74 mg/mI). Anche il [1-~4C]-mannosio era ossidato in maniera dipendente dalla concentrazione. La quota di ossidazione de1 glucosio è perfettamente entro la capacitä degli enzimi fosforilatori del glucosio helle isole di topo ( < 10 oB) e può essere responsabile del 50 oB del consumo di ossigeno secondo la misurazione di Hellerström. Gli effetti di questi vari fattori sull'ossidazione del glucosio si correIano qualitafivamente con i loro effetfi sulla liberazione di insulina, che è inibita dal mannoeptulosio, ma non dalla florizina, daI 2-deossiglucosio o dalla N-acetiI-glucosalnina. L'ossidazione deI glucosio e d e I mannosio dipendente dalla concentrazione è parimenti correlata con effetti dipendenti dalIa concentrazione di questi zuccheri sulla liberazione. L'ossidazione de! glucosio, a concentrazioni che stimolano la liberazione di insulina, non è inibita dall'adrenalina o dalPomissione di Ca++, i quali inibiscono entrambi la liberazione di insulina. Questi reperti concordano con l'opinione che gli effetti de1 glucosio sulla liberazione siano secondari al suo metabolismo nella cellula ~. G1i aspetti quantitafivi delPossidazione del glucosio non si correlano bene con le proprietä cinetiche della glucochinasi e delPesochinasi nelle isole di topo. Queste ultime non possono essere responsabili della forma sinusoidale della curva di ossidazione nè possono essere completamente responsabili della marcata inibizione dell'ossidazione del glucosio da parte deI mannoeptulosio. Se la glucosio-64osfatasi opera entro le isole, allora l'azione combinata delle chinasi e della fosfatasi può essere responsabile della curva sinusoidale. Tentativi di dimostrare l'attivitä della fosfatasi helle isole (misurando Ia produzione di glucosio dal mannosio) sono stati finora negativi. Deve esser ancora fornita una risposta alla questione se le proprietä della glucochinasi, dell'esochinasi e d'ella glucosio-6-fosfatasi siano responsabili del meccanismo glucorecettore. Ciò richiede misurazioni delPassunzione del glucosio, che si sono dimostrate irrea]izzabili, e la conoscenza delIa biochimica de1 sistema di liberazione dell'insulina. 440

STRUTTURA E METABOLISMO DELLE ISOLE DEL PANCREAS

Tema:

Le cellule ~ pancreatiche nel diabete spontaneo e sperimentale del topo.

Relatori:

R~NOLD A. E., ORCI L., STAUF»ACHER W . , JUNOD A., ROUILLE~ CH. Genève

In una recente rassegna sono stare prese in considerazione le sequenze metaboliche, che sembrano in relazione con l'evenienza spontanea del diabete nei roditori di laboratorio. Si suggeriva che la diminuita responsivitä all'insulina potesse essere l'evento primario, sia spontaneo (come in ob o in dbdb) che indotto dalla dieta (come nei ratti delle sabbie o negli ibridi di C3Hf e I). Ahneno in qualche caso questa diminuita responsivitä all'insulina sembrerebbe piü marcata in certi tessuti, nella muscolatura striata nel caso di obob o nei topi NZO, nel tessuto epatico ne1 caso di dbdb. La diminuita efficacia dell'insulina è associata ad iperinsulinemia, transitoria o permanente, e ad ipertrofia ed iperplasia delle cellule I~ delle isole di Langerhans. Le prove attuali suggeriscono che qualora l'ipertrofia e l'iperplasia siano di enfitä sufficiente e si possano protrarre senza esaurimento o degenerazione, si raggiunge un nuovo equilibrio, e ne deriva una quasi-normalizzazione od un diabete compensato. Se è limitato il potenziale per l'ipertrofia e l'iperplasia, sia in entitä che in durata, il diabete progredisce e si verifica Io scompenso. Gli OO. hanno studiato in particolare le caratterisfiche ultrastrutturali dell'iperplasia delle cellule ~ de! pancreas nei topi spinosi (Acomys cahirinus) prima e durante lo sviluppo della sindrome diabefica. La piü sorprendente generalizzazione che deriva da questo studio è costituita dall'evidente conservazione del numero e dall'apparente capacitä di sintesi delle cellule ~ per tutta la durata deIle fasi di iperglicemia intermittente e persistente, con o senza l'associazione di chetoacidosi. Anche allo stadio di iperglicemia prolungata, con un notevole accumulo di gEcogeno ~-cellulare, le prove ultrastrutturali parlano per un aumento e non per una diminuzione della sintesi proteica. Un carattere insolito che si osserva in questo stadio è quello de11'accumulo di materiale interamente simile a quello dei granuli ~ entro le membrane endoplasmafiche granulate. La frequente presenza di cellule eso-endocrine « intermedie » negli animali diabetici è descritta altrove. Quando si studiava la risposta delle cellule ~ di topi spinosi normoglicemici alla streptozotocina è stata dimostrata facilmente la distruzione uniforme e seletfiva di queste cellule. Una caratteristica particolare era data dal danno precoce delle strutture nucleari. Però, sorprendentemente, la somministrazione di streptozotocina a topi spinosi spontaneamente diabetici rivelava una completa protezione delle cellule ~ contenenti glicogeno anche in casi in cui alcune cellule ~ non evidenziavano un deposito di glicogeno ed erano gravemente danneggiate dall'agente B-citotossico. Tema:

Regolazione a «/eed-back » della secrezione di insulina da parte della insulina stessa.

R e l a t o r i : SODOYEZ J.-C., SODOYEZ-GoFFAUX F., FoX P. P. - Liège In un precedente rapporto gli OO. hanno dimostrato che l'insulina, aggiunta al mezzo di incubazione, non influenza la liberazione basale di insulina da parte di isole di Langerhans isolate messe ad incubare in presenza di glucosio alla concentrazione di 100 mg %, ma diminuisce significafivamente la secrezione di insulina da parte delle isole stimolate dal glucosio. La concentrazione di insulina esogena necessaria per esercitare un effetto di inibizione aumenta con la concentrazione deI glucosio nel mezzo e, pertanto, con l'intensitä della stimolazione delle cellule I~- In presenza di glucosio alla concentrazione di 100 mg %, le isole pancreatiche erano stimolate in maniera significativa dal glucagone (5 l~g/ml) e dal dibutiril AMP cicEco (DBcAMP: 0,5 e 1 mM), ma non dalla teofillina (1 mM). I1 DBcAMP era e~cace ad una concentrazione molare almeno 10 volte inferiore a quella riferita per il 3',5'-cAMP da Malaisse e Coll. L'azione de1 DBcAMP non era potenziata dalla teofillina (1 mM), il che fa pensare che il DBcAMP non sia inattivato daIla fosfoßiesterasi delle celIule ~. L'aggiunta di insulina (250 BU/ml) al mezzo di incubazione riduceva significativamente l'effetto sfimolatore del glucagone, ma non modificava la liberazione di insulina stimolata da1 DBcAMP. Questi risultati confermano l'ipotesi che l'insulina abbassi il livelIo di cAMP helle cellule ~, probabilmente inibendo l'adenilciclasi e/o sfimolando la fosfodiesterasi. Esperimenfi per chiarire questo punto sono in corso di svolgimento. Tema:

Proinsulina e biosintesi dell'insulina.

R e l a t o r i : STEINER D. F., CLARK J. L., MACKENZIE J. L., RUBENSTEIN A. H . , OYER P . - L o n d o n Le isole di Langerhans isolate dai ratti sintetizzano entrambe le insuline caratteristiche di questa specie. La proinsulina può essere rintracciata dopo 30 sec dalla esposizione delle isole ad 441

STRUTTURA

E METABOLISMO

DELLE

ISOLE

DEL P A N C R E A S

aminoacidi radioattivi. L'insulina comincia ad apparire dopo circa 15 min di incubazione e con il passare del tempo la quantitä di radioattivitä incorporata nelIa frazione proinsulinica tende ad un plateau, mentre la radioattivitä deli'insulina aumenta graduahnente in modo da superare quelia della proinsulina. La conversione della proinsulina ad insulina entro le ceIIule ~ si verifica con una semivita di circa 1 h. Questi ed altri reperti suggeriscono che la conversione della proinsulina ad insulina si verifichi nell'apparato di Golgi o durante i primi stadi di formazione dei granuli di secreto. Le proinsuline sono state ora isolate da preparati cristallini di insulina di bovini, maiali, uomo e ratto. Si tratta in tutti i casi di proteine a catena singola, che iniziano alle loro estremitä amino-terminali con la sequenza della catena B di aminoacidi unita con un segmento di unione peptidico di circa 30 residui alla catena A, che forma la regione carbossilica terminale. La proinsulina subisce la riossidazione spontaneamente, con una resa fino al 70 % o piü dopo riduzione completa, il che indica che il ruolo della forma a catena singola può essere quello di facilitare la corretta formazione del legame disolfurico della molecola insulinica. Verranno discusse le ricerche sull'isolamento, la struttura, la trasformazione triptica e le proprietä delle proinsuline e delle forme intermedie provenienti da parecchie specie animali. Tema:

Respirazione delle cellule ~ in presenza di sulfaniluree.

R e l a t o r e : STORK H . - M a n n h e i m Le sulfaniluree ipoglicemizzanti, tolbutamide e glibenzciclamide (HB 419), stimolano il consumo di ossigeno in vitro di isole pancreatiche isolate di topi obesidperglicemici. La frequenza respiratoria delle isole aumenta con l'aumentare della concentrazione di HB 419 nell'ambito 0,001-0,1 I~g/ml, ma non supera il 120 % della respirazione endogena. In un mezzo di incubazione contenente glucosio a concentrazione elevata (3 mg/ml) l'assunzione di ossigeno è leggermente inibita dall'aggiunta di tolbutamide o di HB 419. L'aggiunta di questi farmaci inibisce inoltre fortemente l'assunzione di ossigeno delle isole incubate in presenza di L-leucina. Osservazioni preliminari suggeriscono che la decarbossilazione ossidativa della leucina-l-~4C o della leucinaU-~4C non è però influenzata dall'aggiunta di sulfaniluree. Analogamente l'ossidazione dei D-glucosio-U)4C rimane invariata se si aggiunge la tolbutamide ad isole incubate in un mezzo contenente 3 mg/tal di glucosio. I risultati sono considerati rappresentativi delle cellule IJ, dal momento che questo tipo celIulare comprende oltre il 90 % del pancreas endocrino di topi obesi-iperglicemici. Le osservazioni confermano l'opinione che le sulfaniluree stimolano l'ossidazione del substrato endogeno delle cellule ~. L'O. pensa inoltre che questi farmaci inibiscano Ia degradazione della Ieucina in un passaggio al di lä della decarbossilazione ossidativa di questo aminoacido. Tema:

Presenza, caratteristiche e possibile ruolo della glucosio-6ffos/atasi nelle cellule ~~ del pancreas.

R e l a t o r e : TXLJEDAL I.-B. - S t o c k h o l m Sulla base di ricerche eseguite su sistemi enzimatici grezzi, come sezion~ criostatiche od omogenati di tessuti in toto, è stata precedentemente postulata la presenza dl glucosio-6fosfatasi nelle isole de1 pancreas. Tenendo conto dell'elevata attivitä di fosfatasi non specifiche nelle cellule ~ insulari di molte specie animali, 1'O. ha intrapreso ricerche a11o scopo di chiarire la vera natura degli enzimi interessati ed anche la validitä dell'ipotesi che una glucosio-6fosfatasi specifica possa servire da glucorecettore fisiologico. A pH 6,7 si aveva una maggiore percentuale di liberazione di P~ daI glucosio-6-fosfato che dal ~-glicerofosfato in omogenati insulari preparati da topi e da cavie. In queste due specie il trattamento cortisonico ha esaltato l'attivitä enzimatica verso il glucosio-6-fosfato, ma non quella verso il /J-glicerofosfato. Iniezioni contemporanee di etionina o di puromicina hanno bloccato questo effetto di stimolo del cortisone. Con omogenati in toto di isole dl topo la rappresentazione grafica inversa della relazione tra la concentrazione di glucosio-6-fosfato e l'attivitä enzimatica suggeriva la contemporanea azione di due enzimi a diversa K .... Dopo frazionamento di isole di topi obesi-iperglicemici mediante centrifugazione differenziale, uno di questi enzimi risultava localizzato nella frazione microsomica. Esso possedeva una Km per il glucosio-6-fosfato di circa 0,5 mM ed un pH ottimale a 6,7. Esso scindeva il glucosio-6-fosfato a preferenza rispetto aI ~-glicerofosfato, al glucosio-l-fosfato, al fruttosio-6-fosfato ed al fruttosio-l,6-difosfato. L'incubazione dei microsomi a pH 5,0 a 37 °C per 15 min riduceva l'attivitä enzimatica di circa 1'80 %. I1 glucosio era un potente inibitore e l'inibizione non era strettamente competitiva nè non competitiva. L'O. ritiene che questi risultati indichino la presenza di glucosio-64osfatasi nel pancreas endocrino di topo e di cavia. La questione se le proprietä osservate per i microsomi 442

STRUTTURA

E METABOLISMO

DELLE

ISOLE

DEL

PANCREAS

isolati corrispondano alle effettive caratteristiche della glucosio-6-fosfatasi in situ è stata affrontata mediante una tecnica istochimica quantitativa applicata alIe sezioni in criostato di pancreas. I1 pH ottimale era di 6,7, la labilitä in mezzo acido, la specificitä del substrato e la sensibilitä al glucosio sono stare riprodotte con quest'uhima tecnica. I dati, però, differivano dai risultati biochimici neI senso che v'era una minore interferenza da parte di fosfatasi non specifiche. Con la tecnica istochimica è stata anche osservata la tendenza ad una Km, che sembrava un poco piü elevata per il glucosio. La presenza di glucosio-6-fosfatasi nelle cellule ~J sembrerebbe confermare un modello a due comparfimenti de1 metabolismo del glucosio-6-fosfato in queste cellule. In questo modello i depositi di glicogeno, rapidamente mobilizzabili, dimostrati da HelIman e Idahl, possono essere la fonte fisiologica del substrato per l'enzima. Poichè la cellula ~ sembra liberamente permeabile al glucosio, la Kj osservata, di circa 14 mM, fornisce una possibiIitä di regolazione del metabolismo deI glucosio-6-fosfato mediante la semplice inibizione della glucosio-6-fosfatasi.

Tema:

Sintesi di R N A e sintesi proteica in isole dl merluzzo isolate.

Relatori:

TRACK N . S., JARRETT R. J., K~EN H . - L o n d o n

Gli OO. si sono proposti di accertare se vi sia qualche somiglianza fra i meccanismi di sintesi delle proteine ne1 tessuto insulare di ratto e di merluzzo mediante ricerche in vitro sulla sintesi delle proteine e di RNA nel tessuto insulare di merluzzo. Le isoIe sono state incubate con acido orotico-6-[~4C] o ortofosfato-[32P] per marcare ii RNA, che veniva quindi estratto in fenolo. Questo materiale marcato era caratterizzato mediante uhracentrifugazione in gradiente di saccarosio ed eIettroforesi su geI di poliacrilamide; le ricerche dimostravano che esso aveva un basso peso molecolare. Nel tentativo di distinguere le specie di RNA marcate, le isoIe sono state incubate con metil-metionina-[H]. La radioattivitä dovuta alla metilazione del RNA risuhava prevalentemente nella frazione a basso peso molecoIare, il che forniva la prova che il materiale marcato era il RNA vettore (tRNA). L'incubazione de1 tessuto insulare in mezzi contenenti glucosio non determinava alcun aumento dell'assunzione di radioattivitä nè nell'RNA nè nella frazione proteica solubile in etanolo (ASP). La puromicina, mentre non aveva alcun effetto sulIa sintesi del RNA, inibiva l'assunzione della radioatfivitä nell'ASP. L'actinomicina D non inibiva nè la sintesi del RNA insulare di merluzzo, nè la sintesi proteica. Dai risuhati ottenuti con l'actinomicina sembra che il nuovo RNA messaggero (pro)insulinico non sia essenziale per la produzione di (pro)insuiina in un breve periodo di incubazione. Dalla considerazione dei risuhati riferiti, gli OO. pensano che la « modulazione » del tRNA sia uno d'ei fattori implicati nella regolazione della velocitä di biosintesi delia (pro)insulina.

Tema:

L'effetto degli ormoni intestinali sulla liberazione e sulla sintesi di insulina in vitro.

Relatore:

TURNER D . S. - L o n d o n

Impiegando frammenti di pancreas isolato di coniglio, 1'O. ha dimostrato che il glucagone ed un estratto ottenuto dalla mucosa duodeno-digiunale di maiale (DJE) sono capaci di stimolare la liberazione di insulina in vitro indotta dal glucosio, mentre la secretina e la pancreozimina non dimostrano questo effetto. La stimolazione della liberazione d'i insulina da parte della L-leucina è stata anch'essa dimostrata in vitro ed il gIucagone, il DJE e specialmente la pancreozimina, sono risultati in grado di stimolare la liberazione di insulina in vitro indotta dalla leucina. E' stato dimostrato che il D-mannoeptulosio blocca il potenziamento della Iiberazione di insulina indotta dal glucosio da parte del glucagone e deI D JE in vitro. I1 mannoeptulosio non inibiva la liberazione di insulina in risposta alla leucina od il potenziamento della liberazione di insulina indotta dalla leucina da parte del glucagone, de1 DJE e della pancreozimina. Si ipotizza che il DJE possa contenere un ormone intestinale finora non identificato I'« incretina », che può essere il principale fattore responsabile de1 controllo intestinale della liberazione di insulina in risposta alla somministrazione orale di gIucosio. La pancreozimina può svolgere un ruolo simile n d controllare la liberazione di insulina in risposta ad aminoacidi somministrati per via orale. Ricerche preliminari sulI'effetto dell'ormone intestinale sulla sintesi dell'insulina e del RNA, in isole preparate da ratfi con il metodo della legatura del dotto pancreafico, sono in corso di svolgimento. I risultati preliminari indicano che gli ormoni intestinali possono essere capaci di regolare la sintesi dell'insulina. 443

STRUTTURA E METABOLISMO DELLE ISOLE DEL PANCREAS

Tema:

Secrezione pancreatica di glucagone.

R e l a t o r i : UNGER R.

H.,

EISENTRAUT A. M. - Dallas

Gli OO. hanno studiato i fattori che controllano la secrezione di glucagone in vivo in gruppi di cani svegli in cui erano stafi precedentemente inseriti dei cateteri neIla vena pancreaticoduodenale (PV) e nella vena mesenterica. In tal modo era possibile distinguere il glucagone pancreatico dall'immunoreattivitä glucagono-simile extra-pancreatica (GLA). Inoltre la disponibilitä di un antisiero che dimostra una scarsa reazione crociata con la GLA extra-pancreatica permette ora la determinazione spedfica del glucagone pancreatico nel sangue periferico di soggetti umani. Le ricerche eseguite nel cane indicano che un'eIevata concentrazione di prodotti di reazioni enzimatiche stimolate da1 glucagone, cioè ii glucosio (reazione glicogenoIitica e gluconeogenica) ed i NEFA (reazione lipolitica), retroagiscono negativamente sulla secrezione de1 glucagone, mentre una bassa concentrazione di quesfi prodotfi sfimola Ia secrezione; l'iperglicemia oltre i 160 mg % abbassa uniformemente il glucagone ddla PV, come fa l'iperNEFAemia, mentre i iivelli glicemici inferiori a 50 mg % provocano una pronta iperglucagonemia, rapidamente soppressa dall'ipergiicemia. Esiste una correlazione significativamente negativa tra glucosio e glucagone. Un'elevata concentrazione di precursori ddle reazioni enzimatiche stimolate dal glucagone, come gli aminoaddi (reazione gluconeogenica), sfimola Ia secrezione di glucagone. Gli aminoacidi ind~cono una marcata iperglucagonemia parallela all'iperinsulinemia; ricerche successive indicano che l'iperglucagonemia aminogenica è necessaria per impedire l'ipogIicemia durante l'iperaminoacidemia. Inoltre Ia pancreozimina è un potente ormone che stimola il glucagone e l'insulina, e che può svoIgere un ruolo secondario nella risposta biormonale delle cdIule insulari aI1'ingesfione di proteine. Per quanto riguarda l'uomo, tutti i soggetfi normali e tutfi i diabetici genetici finora controliafi presentano un aumento del glucagone durante l'infusione di arginina. Alcuni diabetici genefid presentano un'eccessiva risposta glucagonica, ma nei casi di diabete secondario a pancreatite il glucagone non aumenta la marcata iperglicemia, che l'arginina induce nei diabefid genetici. Gli OO. concludono che tanto ii glucagone che l'insulina sono dei fattori attivi nella rego!azione, momento per momento, dell'omeostasi glicemica. IJ glucagone impedisce l'ipogIicemia, parficolarmente durante I'iperaminoacidemia. Una forte carenza di glucagone in relazione a11a risposta insulinica aItera la normale glicoregolazione nell'uomo. Tema:

Misurazioni ]otocinetiche dei livelli di ATP e di ADP nelle isole di Langerhans isolate.

Relatori:

WETTERMARK G . , TEGN£R L , BROLIN S., BORGLUND E. - U p p s a l a

Frammenti di pancreas di topo sono stati congeIafi rapidamente in isopentano a --160 °C. Quindi sono stati isolati campioni di isole e di acini daIIe sezioni liofilizzate in criostato e sono stati inseriti in microprovette contenenti NaOH 0,02. Dopo riscaldamento e neutraIizzazione, aliquote di !d 10 sono state iniettate in soluzioni tamponate di luciferina-luciferasi impiegando un dispositivo che produceva una completa mescolanza in 20 secondi. La determinazione deII'ATP si basava sulla risposta luminosa specifica d d sistema. La stima deII'ADP veniva conseguita mediante conversione enzimafica ad ATP. Il lampo luminoso veniva registrato su un tubo fotomoltiplicatore a 10 stadi posto di fronte, EMI 9552 A, collocato vicino al vaso di reazione. I1 tubo molfiplicatore era collegato ad un osciIIoscopio attraverso un collegamento catodico. Usando un resistore da carica di 5 MG, un campione contenente 125 picogrammi di ATP provocava uno spostamento di cm 2 suIlo schermo dell'oscilloscopio con un livello segnale/rumore di 10:1. La massima ampiezza veniva raggiunta dopo 1 sec e l'intensitä luminosa scendeva a metä de1 suo va!ore massimo in 2 sec. La costante di tempo de11'apparecchio era regolata a 0,05 sec. Le altezze di picco erano proporzionali alle quantitä iniettate di ATP. Nelle isole il contenuto di ATP risuItava nell'ambito di 10-15 millimoli/kg di peso secco. La quantitä di ADP era circa da 3 a 4 voIte inferiore. I1 livello di ATP delle isole era molto pik: elevato di quello degli acini pancreatici e di quello dei campioni di fegato che erano inseriti per conffonto. La sensibiIitä permetteva determinazioni fino a campioni di peso di t~g 0,03 di tessuto insulare, che corrispondevano a circa 150 cellu]e. Tema:

Aspetti ultrastrutturali della /unzione delle cellule ~.

R e l a t o r i : VOLK B. W . , LAZaRUS S. S. - F o r e s t H i l l s Numerose ricerche citologiche hanno suggerito che, in generaXe, i prodotfi d'i secrezione cellulare si formano nei ribosomi, vengono trasferiti nelle cisterne d d reticoIo endoplasmatico e 444

STRUTTURA

E METABOLISMO

DELLE

ISOLE

DEL PANCREAS

da qui si spostano nell'apparato di Golgi, dove si formano granuli di secreto per separazione delle distensioni dei sacculi di Golgi. D'altra parte si pensa che i granuli si sviluppino dalla formazione vescicolare del reticolo endoplasmatico che perde i ribosomi incrostati, mentre il contenuto pallido si condensa a formare il nucleotide denso. Le cellule ~J del pancreas di coniglio contengono, ultramicroscopicamente, due tipi di granuli: il primo consiste in un granulo denso formato da un corpo centrale, separato dalla membrana limitante, da uno spazio luminoso al microscopio elettronico; l'altro tipo, il granulo pallido, consiste di una membrana che circonda un materiale a bassa densitä. Inoltre sono stati dimostrati nelle cellule ~ del coniglio corpi granulari legati alla membrana i quali hanno origine dalle lamelle interne delI'apparato di Golgi e contengono fosfatasi acida. Poichè è stata ottenuta la prova che entrambi i tipi di granuli delle cellule ~, denso e pallido, derivano dal reticolo endoplasmatico, è stata intrapresa una ricerca al microscopio elettronico ed istochimica per determinare se entrambe contengano insulina ed, inoltre, per chiarire la morfologia del processo di secrezione della cellula ~ studiando la fine alterazione strutturale degli organelli delle cellule ~ che derivano dalla stimolazione da parte dell'iperglicemia indotta dal cortisone e dalla somministrazione di sulfaniluree, in confronto alla distribuzione dell'insulina, visualizzata in via immunoistochimica. Queste ricerche hanno dimostrato che i granuli pallidi e scuri originano direttamente dal reticolo endoplasmatico e svuotano il loro contenuto nello spazio extracellulare. Le cellule ipersecernenti stimolate contengono un numero molto maggiore di granuli pallidi, il che indica che la forma di insulina nei granuli di secreto differisce helle cellule ~ a riposo e stimolate. Benchè le cellule ~ iperfunzionanti contengano un apparato di Golgi ipertrofico, non si è potuta dimostrare alcuna relazione tra il complesso di Golgi ed i granuli che secernono insulina. I corpi granulari che derivano dal complesso di Golgi non contengono insulina, ma solo fosfatasi acidapositiva e perciò si crede che siano lisosomi. E' stato dimostrato che il siero anti-insulina legato alla fluoresceina colora sia i granuli pallidi che quelli scuri. Pertanto entrambi contengono l'insulina immunoreattiva simile a quella liberata in circolo. Non si è osservata alcuna colorazione nel reticolo endoplasmatico o nell'apparato di Golgi, anche in cellule ~ notevolmente stimolate. Si conclude, pertanto, che I'insulina sia assente in queste strutture, o probabilmente che i suoi loci immunoreattivi siano bloccati, oppure che la sua concentrazione sia tanto bassa che non si possa visualizzare. Ricerche al microscopio ottico hanno dimostrato che la colorazione dell'aldeide fucsica è esattamente paragonabile a quella visualizzata con il metodo della immunofluorescenza. Ciò indica che l'aldeide fucsica colora l'insulina e conferma che l'insulina è assente dal reticolo endoplasmatico e dall'apparato di Golgi. R.M.

445