435 Table 1. Concentration of the elastase eA-proteinase inhibitor complex and the activity of elastase in synovial fluid. In addition, the concentration of the proteinase inhibitors and the granulocytes count are given

Joint diseases

Elastase 71-proteinase inhibitor complex Elastase activity detectable ~l-Proteinase inhibitor c~2-Macroglobulin Granulocytes

[gg/1] 2 (range) [nmol/1] [U/l, 37~ (range) [nmol/1] 2 (2 s) [nmol/l] 2 (2 s) [N/gl] 2 (range)

Results and Discussion. The concentration of the elastase 71proteinase inhibitor complex in synovial fluid ranges from 0 to about 100,000 gg/1 depending on the degree of inflammation and shows an approximately logarithmic distribution. As expected there is a significant correlation between the neutrophils (x) and the elastase inhibitor complex (y) (r = 0.85, log y = 1.02 log x 0.75). In inflammatory joint diseases an increase of the enzyme inhibitor complex is observed (Table 1). No elastase activity is detectable in synovial fluids from noninflammatory joint diseases, but our results show that in some cases of inflammatory joint diseases with a high count of granulocytes enzyme activity can be measured in the synovial fluid. The failure to detect elastase activity in recent studies [2] has been attributed to the fact that the released enzyme is neutralized outside the cell by complex-formation with proteinase inhibitors, mainly ~l-proteinase inhibitor. Elastase and cO-proteinase inhibitor react stoechiometrically and are bound covalently. The activity of the enzyme is completely abolished. However, the inhibition of the elastase activity by 72-macroglobulin only results in a steric hindrance of the proteinase active site. Thus the

non-inflammatory (n = 30)

inflammatory (n = 39)

41.4 ( 0 - 9 3 5 ) 0.5 (0 - 11.7) not detectable 21,500 (12,100) 468 (557) 3.3 ( 0 - 125)

9,947 (878-101,800) 124 (11.0 - 1,250) 1 . 6 - 1 3 0 (n =- 6) 38,600 (25,200) 944 (1,010) 4,520 ( 7 7 0 - 32,810)

activity of such complexes is much lower on protein substrates, but a well defined activity could be demonstrated especially towards low molecular substrates [5]. The proteinase inhibitors of elastase are present in the synovial fluid in a considerable excess, as shown in Table 1. Therefore it seems likely that the determined elastase activity is not referred to free elastase but due to complexes of the proteinase with e2-macroglobulin, which hydrolyze low molecular weight substrates.

References

1. Barett AJ (1978) Agents and Actions 8:11 2. Fehr K, Velvart M, Baici A, B6ni A: XVth International Congress of Rheumatology, June 1981, Paris, Abstract 0375 3. Neumann S, Hennrich N, Gunzer G, Lang H (1981) J Clin Chem Clin Biochem 19:232 4. Beatty K, Bieth J, Travis J (1980) Biol Chem 255:3931 5. Twumasi DY, Liener IE, Galdston M, Levytska V (1977) Nature 267:61

B 23

Fresenius Z Anal Chem (1982) 311 : 4 3 5 - 436 - 9 Springer-Verlag 1982

Determination of Very-Low-Density Lipoprotein Cholesterol

Table 1. VLDL-cholesterol concentrations in fasting sera determined by method A, B, C

Patient G. Hoffmann 1, E. Schleicher 2, and L. Weiss 1 1 Klinisch-Chemisches Institut des Stfidt. Krankenhauses Harlaching, Sanatoriumsplatz 2, D-8000 Mfinchen 90, Federal Republic of Germany 2 Klinisch-Chemisches Institut des St~idt. Krankenhauses Schwabing, K61ner Platz 1, D-8000 Mfinchen 40, Federal Republic of Germany Bestimmung yon Very-Low-Density Lipoprotein Cholesterin

In fasting sera, the total cholesterol can be classified into 3 major fractions: the atherogenic low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and the non-atherogenic very-low-density and highdensity lipoprotein cholesterol (VLDL-C and HDL-C). HDL-C is simple to determine by polyanion precipitation methods, while the differentiation of VLDL-C and LDL-C is still an analytical problem. LDL-C can be calculated from total cholesterol, if, in addition to HDL-C, VLDL-C is known. We have compared 3 different methods for VLDL-C determination (see Table 1):

1 2 3 4 5 6 7 8

Cholesterol Triacyl(g/l) glycerol 1.57 2.11 1.99 1.53 1,87 2.67 2.36 1.80

VLDL-cholesterol (g/l)

(g/l)

A

B

C

3,34 2.00 2.84 2.53 3.10 2.64 3.64 2.77

0.19 0.21 0.23 0.31 0.34 0.40 0.46 0.56

0.67 0.40 0.57 0.51 0.62 0.53 0.73 0.55

0.31 0.16 0.28 0.28 0.34 0.33 0.52 0.43

A, Ultracentrifugation at serum density and enzymatic cholesterol determination as a reference method (Beckman Spinco L 5 - 65, rotor SW65). B, Calculation procedure of Friedewald et al. [I]: VLDL-C (g/l) = triacylglycerol/5 (g/l).

436 C. Quantitative lipoprotein electrophoresis according to Wietand and Seidel [2]. A nomogram has been developed for the simple evaluation of electropherograms. Table I shows that, at triacylglycerol concentrations above 2 g/l, VLDL-C may be greatly overestimated (and consequently LDL-C underestimated), if the Friedewald method is used. In these 8 cases VLDL-C from ultracentrifugation is "triacylglycerol/7" rather than "triacylglycerol/5" with extreme values ranging from "triacylglycerol/5" to "triacylglycerol/18". In contrast, the lipoprotein electrophoresis yields values which correspond well to the ultracentrifugation data. Comparison of methods B and C in 51 patients showed a significant correlation (r = 0.781, P < 0.001). As a mean, pre-fl-cholesterol from electrophoresis was equivalent to one eighth of total serum tri-

acylglycerol yet with extreme values ranging from triacylglycerol/3 to triacylglycerol/24. From these data, it is concluded that VLDL-C can be determined by ultracentrifugation or lipoprotein electrophoresis, while, at least at triacylglycerol concentrations above 2 g/l, the Friedewald method often yields incorrect results.

References

1. Friedewald WT, Levy RI, Frederickson DS (1972) Clin Chem 18: 499 - 502 2. Wieland H, Seidel D (1978) Inn Med 5:290--300

B24

Fresenius Z Anal Chem (1982) 311 : 4 3 6 - 437 - 9 Springer-Verlag 1982

Untersuchungen zur Spezifit~it der Vortrennung der Catecholamine mit Bors~iuregel und einem schwachen Ionenaustauscher

Tabelle 1. Retentionsvolumen einiger Testsubstanzen Substanz

~tg

W. Bauersfeld, U. Diener, D. Ratge, E. Knoll und H. Wisser Abteilung ffir Klinische Chemic, Robert-Bosch-Krankenhaus, Auerbachstr. 110, D-7000 Stuttgart 50, Bundesrepublik Deutschland Study on the Specifcity of the Pre-Purification of Cateeholamines on Boric Acid Gel and a Weak Cation-Exchanger

1. Einleitung. [mmobilisierte PhenylboronsS,ure wird zur Abtrenhung der Catecholamine im Urin und Plasma benutzt [1 - 3, 6]. Bei einer anschliegenden Bestimmung der Catecholamine mit Hochdruekflfissigkeits-Chromatographie und amperometrischer Detektion werden eine Reihe von St6rsubstanzen nachgewiesen. Aus diesem Grund wurde versucht, eine Abtrennung der Catecholamine mit einem schwach sauren Ionenaustauscher durchzufiihren. 2. Arbeitsweise. Auf das mit Waschpuffer (0,2 mol/l Natriumphosphatpuffer, pH 6,6)/iquilibrierte Bors/iuregel (3,5 x 0,9 cm) wurden in l ml Waschpuffer eine Reihe von Testsubstanzen aufgetragen und ihr Retentionsvolumen gemessen. Eluiert wurden in 7 ml Waschpuffer die S/iuren, Alkohole und AminosS, uren (Tabelle 1 a). Die Elution der Amine erfolgte anschlieBend mit 0,06 mol/1 Salzs/iure (Tabelle lb). Mit dem Ionenaustauscher (Amberlite CG 50 II, 2,5 • 0,9 cm) erfolgte die ,Aquilibrierung, das Auftragen der Testsubstanzen und Waschen der S/iulen in der gleichen Weise. Die Elution der Amine liel3 sich mit 0,8 mol/1 Bors/iure durchffihren. 3. Ergebnisse und Diskussion. Higa [2], der die Abtrennung der Catecholamine auf Bors/iuregel als erster angewendet hat, postulierte in Analogie zur Komplexbildung aliphatischer cis-Diole [5] die Bildung cyclischer Bors/iureester mit den phenolischen Gruppen der Catecholamine gemfiB (1 und 2)

4~B(OH)~ + H20 ~

~bB(OH)~- + H+

HO~]./R q~B(OH)~ +

~ HOf ~

~ O ~ R "~ q~-~ OH 0

(1)

+ 2H20

(2)

Menge

a) Im Waschpuffer eluiert 4-Hydroxy-3-methoxyphenethylen- 3,2 glycol 3,4-Dihydr oxymandels/iure 11,2 Homogentisinsfiure 10,4 3,4-Dihydroxyphenylalanin 0,48 5-Hydroxyindolessigsfiure 7,16 b) Zusammen mit den Catecholaminen eluiert Noradrenalin 166,4 Dopamin 181,6 Normetanephrin 50,7 Adrenalin 117,4 Metanephrin 53,0 3-Methoxytyramin 82,4 3,4-Dimethoxyphenylethylamin 400,0

Retentionsvolumen ml 3,5 3,5 3,6 3,6 5,1 4,7 5,0 5,0 5,0 5,2 5,3 7,0

Wfirde dieser Mechanismus zutreffen, so miiBten mittels Borsfiuregel Dihydroxyverbindungen von methylierten oder monohydroxylierten Verbindungen abgetrennt werden. Die Retention der O-methylierten Amine und das Ausbleiben einer Adsorption der Dihydroxyphenyls~iuren macht aber deutlich, dab unter den gegebenen Bedingungen die Ausbildung cyclischer Bors~iureester keine wesentliche RoUe spielt. Die von Roy u.a. [4] bestimmten Komplexbildungskonstanten des Brenzcatechins sind sicher nicht fibertragbar, wenn das angreifende Diol zugleich eine positiv geladene Aminogruppe enthNt. Vielmehr ist anzunehmen, dab die Salzbildung gemfiB (3) entscheidend ist ffir die Retention der getesteten Verbindungen. q~B(OH)~- + HaN+-R ' ~

-- [~B(OH)~HaN+-R ']

(3)

Je kleiner die Dissoziationskonstante des Salzes, um so gr613er muB das Retentionsvolumen des Amins sein. Entsprechend wird Dopamin, dessen Phenylborons/iuresalz wasserlOslich ist, frtih, das Dimethoxyphenylethylamin, dessen Phenylborons/iuresalz schwer wasserl6slich ist, sprit eluiert. Damit entspricht der Retentionsmechanismus dem eines schwach sauren Ionenaustauschers. Es ist damit auch verst~indlich, warum die Retentionsvolumina, die mit Amberlite CG 50 II