0sterr. Bot. Z. 116, 263--272 (1969)

Elektronenmikroskopische Beobachtungen zum Chromosomenbau* Von

Armin Resch, Darmstadt Mit 4 Textabbildungen (Eingegangen a m 2. F e b r u a r 1968)

Einleitung Der Feinb~u der Chromosomen yon Organismen mit echten Zellkernen ist noch immer nicht geniigend gekl~rt. Es lassen sich zwar bestimmte Grundelemente, die Chromonemat~, sowohl licht- als auch elektronenmikroskopisch nachweisen, abet deren morphologische Anordnung und die Veri~nderungen beim Formwechsel sind noch zu wenig bekannt. Dagegen sind die Chromosomenspalths die Chromatiden, recht gut analysiert. Die Chromonemata, an der Grenze der lichtmikroskopischen AuflSsung gelegen, kSnnen effektiv nur mit dem Elektronenmikroskop verdeutlicht werden. Dabei wird abet die Dfinnschnittechnik zum Handicsp fiir die Rekonstruktion der rgumlichen Anordnung. Isolations- und Spreitungsversuche fiihrten vorerst nicht zur entscheidenden Klgrung des Feinbaus intakter Chromosomen (dazu siehe GEITLE~, TSCHER~AK-WoEss und SITTE, 1967). Eher scheint die fermentative Skelettierung der Chromosomen zu einem Nachweis der Chromonemen geeignet zu sein und zwar schon fiir die lichtmikroskopische Anulyse (TRosKo und WOLF, 1965). Die Feulgen- und Karmintechnik ist das meist verwendete Mittel einer karyologischen Bearbeitung im Lichtmikroskop. Die K~rmintechnik mit der vorangehenden Alkohol-Eisessigfixierung l~{3t sich bei den relativ stabilen DNS-Strukturen auch fiir elektronenmikroskopische Untersuchungen verwenden (REsc~, 196r 1964b; l%Escg und PEV~LI~G, 1964). Auch bei Viren ist zur Hervorhebung der Nukleinsi~urekomponente die Alkohol-Eisessigfixierung vorteilhaft (PETE~S und BffTT~ER, 1965). * tterrn Prof. Dr. LOT~AR GEI~L~ in Verehrung zum 70. Geburtstag.

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A. RESCH:

In der Frage der Anordnung der DNS in den typisehen Chromosomen ist die Entseheidung fiber Einstrang-, Mehrstrang- oder Sehleifenanordnung noeh nicht gefallen. Sieher ist nur die semikonservative Reduplikation und damit die Funktionseinheit, die Chromatide. Allgemein anerkannt ist aueh der polynematisehe Aufbau der Chromosomen (ausffihrlieher GEITLEg, 1938), also die Existenz der ehromonematisehen Substruktur, jedoch weiehen die Angaben tiber die Anzahl der Chromonemata einer Chromatide voneinander ab, was sieh aus dem oben fiber die GrSl3enordnung der Chromonemen Gesagten ergibt. Da sieh die Chromosomen in der Metaphase stark spiralisieren, zeiehnen sieh die Chromonemata in diesem Stadium nieht gut ab. Man wird zum Studium des Feinbaues, wie allgemein iiblieh, die locker gebauten Prophase- und Telophaseehromosomen heranziehen miissen. In der Interphase ist die ehromosomale Zuordnung der dort gut siehtbaren Chromonemata wiederum nicht durehffihrbar. Im folgenden sollen nun einige Beispiele aus den mit Karminessig (Teehnik siehe RESCg und P~VELI~C, 1964) erhaltenen Beobaehtungen angef~hrt werden.

Beobachtungen Pro- und Telophase yon Crepis vapillaris. Dieses Objekt ist karyologiseh gut bearbeitet (GEITLER, 1930; HEITZ, 1933 n.a.). Der Li~ngssehnitt dureh eine Periblemzelle der Wurzel zeigt einen lgnglichen (ellipsoiden) Prophasekern (Abb. 1). Das Karyoplasma erseheint leer, eine Wirkung des Fixierungsmittels, das die deutliehe Darstellung der ehromosomalen Komponenten begfinstigt. Die l~ngs oder sehr~tg getroffenen Chromosomen sind voneinander distanziert (Chromosomenareal@ Es sind Stellen mit kompaktem und fgdigem Chromatin zu erkennen. Erstere sind nieht unbedingt Chromozentren gleiehzusetzen. Der Vergleich mit den kleiner wiedergegebenen Folgesehnitten (Abb. 1 b, c) lehrt, da[~ sich bei diekeren Sehnitten die Abbildung vieler Chromonemata iiberlagert und tin kompaktes Chromatin erseheinen liigt. Wenn im dickeren Schnitt das Chromosom oder die Chromatide nur teilweise einbezogen ist, wird die Wirkung wie bei einem diinneren Sehnitt sein (so z.B. an dem zum Nukleolus fiihrenden Chromosom in Abb. 1 b). Durch eingehende Vergleiche konnte ermittelt werden, dab jede Chromatide aus 4 Chromonemata yon zirka 0,1--0,2 # Durehmesser besteht. Die Art der Sehraubenanordnung konnte jedoeh aueh an den Sehnittserien nieht analysiert werden. In der Telophase l~gt sieh der Aufbau einer (Tochter-)Chromatide aus zwei Chromonemata gut erkennen; sie sind locker plektonematisch umeinandergesehlungen (Abb. t d). Die Uberkreuzungsstellen erseheinen wegen der elektronenmikroskopisehen Projektion miteinander ,,verklebt". Es handelt sieh hier um die Sehwester-

Elektronenmikroskopisehe Beobaehtungen zum Chromosomenbau

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ehromatide zu der bei R ~ s c ~ (1964a) auf Fig. 2 links zu e r k e n n e n d e n e h r o m a t i d a l e n S t r u k t u r aus einem Folgesehnitt. Somit besteht d a s

Abb. 1. Crepis capillaris, Wurzelmeristem. a--c Prophase in Folgeschnitten. a Polynematische Chromatiden. b n/~chster, dickerer Schnitt in schw~cherer Vergr61~erung, zur Orientierung fiber die ehromosomalen Zusammenh~nge~ c vierter Schnitt aus der Serie. N Nucleolus; d Telophaseehromatide im L~ngsschnitt mit umeinandergewundenen Chromonemata. A E , K E , Epon

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A. P~ESC~ :

Telo- ( u n d A n a p h a s e - ) C h r o m o s o m v o n C. cc~pillari.s' aus insgesa.mt 4 dieser C h r o m o n e m a t a . Z w i s c h e n jeweils z w e i e n d a v o n iiegt der A n a p h a s e s p a l t . Die b e i d e n T o e h t e r e h r o m a t i d e n sind d e m n a c h bereits w e i r voneinander getrennt.

Abb. 2. Crepis capilla.ris, Wurzelmeristem. a Prome~aph~sechromosomcn; links : Querschnitt m i t Chrorn~tidenspalt ; rechts : l/~ngs m i t relational coiling, in eine E b e n e projiziert, Spalt durch ,,L6cher" a n g e d e u t e t ; b stark vergr61~ertes Detail aus einer 1/ings geschnittenen M e t a p h a s e c h r o m a t i d e m i t 0,15 ~ breiten zweistr/ingigen B~ndern u n d zirka 200 'A breiten U n t e r e i n h e i t e n . AE, KE, Epon

Elek~ronenmikroskopische Beobaehtungen zum Chromosomenbau

267

Abb. 3. B d l e v a l i a r o m a n a , Wurzelmeristem, Prophase mit Chromosomenanschnitten. Links yore vakuolisierten Nukleolus Chromosomen- und Chromatidenspalt (Pfeil); an anderen Stellen gewundene Chromonemata-Ansehnit~e. Briiekenbildung zwisehen den Chromagiden. AE, KE, Epon

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A. R E S e K :

Abb.

4/a--c

Elektronenmikroskopisehe Beobaehmngen zum Chromosomenbau 269 P r o m e t a p h a s e v o n Crepis c a p i l l a r i s . Hier ist ein Fall dargestellt, der in einem Bild L/~ngs- und Quersehnitt dureh ein Chromosom nebeneinander wiedergibt (Abb. 2a). Der Quersehnitt zeigt deutlieh die beiden Chromatiden dutch einen S p a r voneinander getrennt. Der Durehmesser des Chromosoms ist in der Achse senkreeht zum S p a r doppelt so lang wie parallel zu diesem. Damit ist die bandf6rmige (nieht zylindrisehe) Ausbildung der Chrolnosomen belegt. Dutch das ,,relational coiling" (der Chromatiden) sieht man im L/~ngssehnitt der Chromosomen nur an einzelnen Stellen den S p a r und zwar als ,,L6eher:', die man dutch zu starkes Erhitzen yon KE-Pr/iparaten in den liehtmikroskopisehen Bereieh vergr61~ern kann (G~ITL~R, 1949). Der L~ngssehnitt maeht aber noeh etwas anderes deutlieh. I m Zustand der sps Kontraktion ergibt sieh im Feinstrukturbild eine Versehleierung der ehromonematisehen Organisation, so dab deren Verlauf und r/~umliehe Anordnung k a u m zu analysieren ist. I{ier wird die Sehwierigkeit der elektronenmikroskopisehen Untersuehung an relativ grol~en und offensiehtlieh mehrfaeh gefalteten Strukturen (Ordnungen der Untereinheiten) deutlieh. Ein dfinnerer und s~i~rker vergr613erter Aussehnitt aus einem Metaphaseehromosom zeigt die feineren Elemente (Subehromonemata) distanziert und locker (Abb. 2 b), aber ebenfalls nieht unter einer erkenntliehen Ordnung. Einige parallellaufende Doppelb/~nder entspreehen in der Breite einem Chromonema. Jene sind wiederum dutch ,,Briieken" miteinander verbunden. Immerhin ist ein vorherrsehendes Grundelement yon 100--200 ~ zu erkennen, wie es aueh yon anderen Objekten beriehtet wird (Zusammenfassung: PEVEL~NG, 1968). P r o p h a s e y o n B e l l e v a l i a r o m a n a . Der ehromonematisehe Aufbau der Prophaseehromosomen zeigt sieh abet nieht immer so, wie es im ersten Absehnitt dargestellt wurde. Als Beispiel sei eine Prophase aus einem Wurzells von B. romana angefiihrt (Abb. 3). Deutlieh sind Quer-, L/~ngs- und Sehr/~gsehnitte dureh die beiden Chromatiden erkennbar. Diese sind jedoeh nieht dureh einen S p a r voneinander abgesetzt wie in Abb. 2 a. Es zeigen sieh vielmehr Briieken ehromatisehen Materials zwisehen den beiden Chromatiden. Solehe werden dutch andere Beobaehtungen postuliert und f[ir den Zusammenhalt der Chromatiden verantwortlieh gemaeht. Lebendbeobaehtungen maehen es unwahr-

Abb. 4. Oenothera biennis, Wurzelmeris~em, Prophase. a Ubersichtsbild, Heteroehromatin (Chromozentren) der Kernperipherie anliegend. Allm~hlicher Ubergang zum distalen Euchromatin. b--c st/~rkere Vergr6~erung. b Euehromatische Enden mit auseinanderspreizenden Chromatiden. c in der Ubergangsregion zwisehen I-Ietero- und Euehromatin Quer~ und L&ngssehnitte yon 0,1 # breit gewundenen stark kontrastierten Subchromonemata (Pfeile). AE, KE, Epon

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A. REsc~ :

scheinlich, daft es sich nur um artifizielle Verklebungen h~ndelt (siehe GEITLER U. a., 1967, S. 18). Einzelne Stellen der Abb. 3 vermitteln deutlich distinkte Chromonemata, andere den L~ngsspalt der fiberns Teilungen in den Chromatiden (auch hier wieder mit Brficken). Je nach Anschnitt der Chromosomen, erkennt man kompakte, doppelte und fiberkreuzte Figuren. Das r~umliche Ordnungsprinzip bier herauszulesen, ist daher aufterordentlich schwierig. Die erw~hnten Typen kommen auch bei der meiotischen Prophase yon B. romana nebeneinander vor. Schnittfolgen machen zwar wahrscheinlioh, daft es sich um die Ansicht yon Tangential- und Medianschnitten, sowie Aufeinanderprojektion eincr Schraubenstruktur handelt. Es ist aber nicht auszuschlieften, daft im L~ngsverlauf des Chromosoms Parallellagerung ( A c h s e n s t r u k t u r ) u n d Schraubenwindungen oder Schleifen nebeneinander vorkommen. P r o p h a s e yon O e n o t h e r a b i e n n i s . Bei diesem Objekt erscheinen die Prophasechromosomen im L~tngsschnitt wesentlich anders (Abb. 4). Es ist deutlich zu erkennen, daft der Habitus durch Heterochromatin und Eucbromatin gepr~gt ist. I m prophasischen Bild sind die Chromozentren (an der Kernperipherie gelegen) schon metaphasisch und ohne erkennbaren Spalt. Gegen die euehromatischen Endcn lockert sich das chromatische Material auf und zeigt fs gut gef~rbten, schlieftlich verschwommenen, schwach gef~rbten Zustand. Gegen das Chromosomenende werden auch die beiden Chromatiden deutlicher (Abb. 4 b). Die Chromonemata sind lockerer und feiner als bei den vorgenannten Objekten und an einigen Stellen ist deren Querschnitt als Ring zu erkennen. Das l~ngsgetroffene Chromonema zeigt eine locker schraubige Struktur (Abb. 4 c). Bei Interph~sechromosomen sind die Unterschiede yon Chromonema- und Chromozentrenkernen entsprechend (R~scH, 1964b). An Oenothera bienni.3-Prophasekernen kann nun gezeigt werden, wie sich das Eu- und Heterochromatin der Prophasechromonemen im Elektronenmikroskop darstellt. Deutlich ist der Gradient vom proximalcn Mittelstfick fiber eine Ubergangsregion zu den im Lichtmikroskop diffusen Enden. Dieser Gradient ist bei Meioseprophasechromosomen im Lichtmikroskop gut sichtbar. Es ist zu vermuten, daft die l'Jbergangsregion zwischen typischem Heterochromatin (Chromozentren) und k a u m erkennbarem Euehromatin durch die Ausbildung kr~ftiger gef~trbtcr Chromonemata von lockerem Bau im Lichtmikroskop in Form yon Chromomeren erscheint. Innerhalb der proximalen Heterochromatinstiicke zeigen sich wieder die Substrukturen (Subchromonemata) des kontrahierten Metaphasechromosoms.

Diskussion Die bier vorgelegten Chromosomenstrukturen an Dfinnschnitte~ im Elektronenmikroskop nach Karmin-Kontrastierung sind eine Auswahl

Elektronenmikroskopische Beobachtungen zum Chromosomenbau 271 aus einer Serie yon Beobaehtungen dieser Art und Technik. Die gew~hlten Beispiele sind repr~sentativ ftir die Gesamtheit der bisheriger~ Ergebnisse. Es wurde nicht vers~umt, die t~bliehen und modernen elektronenmikroskopischen Pr~parationsteehniken mit heranzuziehen. Ein Fixierungs- und Kontrastierungsvergleieh ist an anderer Stelle ver6ffentlieht (RESCH und PEVELING, 1964). Weitere Untersuchungen mit den allgemein fiblichen Techniken brachten ffir die Teilungsstadien keine entscheidend neuen Ergebnisse; auch dort begegnet man dem chromonematischen oder polynematischen Aufbau der Chromosomen. Einzig das Ph~nomen der Matrixsubstanz ist mit Glutaraldehyd und N~chkontr~stierung wieder in den Vordergrund gertiekt (PEvELIXG, 1967). Die ersten elektronenmikroskopischen Chromosomenuntersuehungen leugneten die Existenz der Matrix. In diesem Punkt dtirfte die Alkohol-EisessigFixierung nicht geeignet sein, da die Matrix wahrscheinlich ebenso wie: das Karyopl~sma herausgelSst wird. Es liegt aber kein Grund vor, die Elektronenmikroskopie der Alkohol-Eisessig-Fixierung und KarminKontrastierung zu vernachl~ssigen, solange fast ~lle lichtmikroskopisehen Untersuehungen des Zellkerns und der Chromosomen ~uf dieser Methode basieren. Dieser Standpunkt muB so lange aufrecht erhalten bleiben, big sich in der lichtmikroskopischen Karyologie eine andere Technik als besser erweisen wird. Es wurde schon in der Einleitung erw~hnt, dad fiir die Darstellung von DNS-Strukturen Mittel wie die Alkohol-EisessigFixierung bessere oder mindestens adequate (~quivalent-)Bilder ergeben. Die weithin oft einzig erfolgreiehe Methode ist bei karyologischen Untersuehungen naeh wie vor das Essigkarmin (GEITI,EI~, 1962). Selbstverst~ndlich gibt es bei jeder Fixierung irgendwelehe Artefakte, auch bei Alkohol-Eisessig. Sie sind aber bekannt und signifikant (siehe ebenfalls GEITLEI~, 1962). Sie werden im Elektronenmikroskop viel leiehter und deutlicher erkannt als im Lichtmikroskop. Hier kann aus eigener Erfahrung beigetragen werden, da~ unter Anwendung der in RESCH und PEVELING (1964) gegebenen l~ezepte ffir die Essigkarminfixierung nieht alle Objekte brauchbare l~esultate ergeben. Die damals an Hordeum vulgare erprobte Methode zeigt z. B. bei Vicia /aba-Wurzeln keine gute Erhaltung der chromosomalen Strukturen, weil bei diekeren Wurzeln leieht praemortMe Fixierungsseh~den auftreten. Andererseits braehte die Methode bei Driisen der Epidermis, da sie aus dem Gewebe herausragen, gute Fixierung, w~hrend die Epidermis-Zellkerne des gleiehen Stfiekes verklumptes Chromatin zeigten, weil hier das Fixierungsmittel sehleehter, d. h. langsamer in die Zellen eindringt. Aus der hier wiedergegebenen Abbildungsserie und den beigeftigten Legenden ist ebensowenig wie bei der Anwendung anderer Methoden eine endgtiltige Kls des Chromosomenfeinbaues abzulesen. Es ist darauf verwiesen worden, daft dieser Umstand mit der Diinnsehnitt-

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A. I:tESCH: Elektronenmikroskopische Beob. zum Chromosomenbau

teehnik u n d der elektronenmikroskopisehen A b b i l d u n g s a r t zusammenh~ngt. Das Anliegen ist vielmehr, einen Ansatz fiir weitere U n t e r s u c h u n g e n zum C h r o m o s o m e n f e i n b a u zu suehen u n d dabei zu den g~ngigen F a k t e n Hetero- u n d E u e h r o m a t i n , sowie Polynemie u n t e r dem Gesiehtsp u n k t der f u n k t i o n e l l e n Rolle dieser S t r u k t u r e n elektronenmikroskopiseh a u s w e r t b a r e Pr~iparate zu erhalten. l~Iit Unterstfitzung der Deutsehen Forschungsgemeinschaft. Literaturverzeichnis

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