Molee. Gen. Genetics 99, 76--87 (1967)

Inaktivierung BUdR-substituierter transformierender DNS durch monochromatisches UV-Licht verschiedener Wellenliingen HORST-I)IETER 1VIENI~IGMANN Institut fiir Mikrobiologie der Johann-Wo]fgang-Goethe-UniversitatFrankfurt a.M. Eingegangen am 2. Februar 1967

Summary. Incorporation of 5-bromodeoxyuridine (BUdl~) sensitizes the inactivability by UV of transforming DNA of Bacillus subtilis. The sensitization towards monochromatic UV between 230 and 350 nm has been studied for unifiliarly and bifiliarly substituted DNA. The results for irradiation with UV of 230 and 320 nm indicate that unifiliarly substituted DNA (TB) behaves like a one-to-one mixture of unsubstituted (TT) and bifiliarly substituted (BB) DNA. Since this is in accordance with what has been found (for longwave UV only) for phage ,~ we believe the result for 320 nm irradiation to mean that the UV induced lesions within the substituted strand interfere with the transcription rather than with the replication mechanism. This picture seems to be conclusive for phage ~ and is in contrast to what is known about the lesions induced in unsubstituted DNA by UV of 260 nm. The inactivation curve for TB for irradiation with UV of 260 or 290 nm simulates a one-to-one mixture of TT and BB only down to about 10% survivors. With higher doses the survival is lower than expected for a one-to-one mixture. This could indicate that at higher doses small amounts of photoproducts are produced in which both strands are involved. In contrast to phage ,~ transforming DNA will give the above results without a radioprotective substance. It is discussed in how far, in the case of phage 2, the greater local DNA concentration and the protein coat can be the reason for this difference. 1. E i n l e i t u n g Z u m e i s t ist die genetische I n f o r m a t i o n i n der D N S 1 niedergelegt. Es ist daher sinnvoll a n z u n e h m e n , dab V e r ~ n d e r u n g e n a n den ,,Sehriftzeichen" dieser Inform a t i o n (d. h. a n den B a s e n Adenin, GuaIfin, Cytosin u n d T h y m i n ) , wie sie d u r e h die verschiedenen S t r a h l e n a r t e n , Chemikalien usw. hervorgerufen werden k S n n e n , den Informationsgehal~ beeinflussen, u n d m a n k a n n daher n u r bei ganz geringffigigen Ver/inderungen a n diesen ,,Schriftzeiehen" erwarten, da$ n i c h t aueh der I n f o r m a t i o n s g e h a l t gleichzeitig ver/~ndert ist. E i n e solehe - - v o m S t a n d p u n k t des I n f o r m a t i o n s g e h a l t e s - - offensieh~lich geringffigige Ver/~nderung stellt die Subs t i t u t i o n der M e t h y l - G r u p p e i m T h y m i n d u t c h B r o m dar; d e n n dessen v a n der W a a l s ' s e h e r R a d i u s (1,95 A) u n t e r s c h e i d e t sich n i c h t erheblieh y o n d e m der M e t h y l - G r u p p e (2,0 A; PAVLI~TG, 1945), u n d aus inzwisehen zahlreichen P u b l i k a t i o n e n geht hervor, daI3 dieses T h y m i n - A n a l o g o n bei den verschiedenen Organism e n wirklieh i n die D N S eingebau~ wird. Zwar ist wegen dec )~hnlichkeit tier v a n tier W a a l s ' s c h e n R a d i e n der E i n b a u des Analogons i n die D N S mSglieh. T r o t z d e m aber h a t dieser E i n b a u fiir die D N S 1 Abkiirzungen: DNS = Desoxyribonukleinsgure; RSTS= Ribonukleins~ure; m-RNS = Boten-RNS; TdR = Thymidin; U = Uracil; FUdR = 5-Fluordesoxyuridin; BUdR = 5-Bromdesoxyuridin; TT = unsubstituierte D~qS; TB und BB = ein- bzw. zweistr'~ngig mit BUdR substituierte DNS; i+ und i-=informativer bzw. nichtinformativer Strang in der DNSDoppelhelix; OD575= Exti~ktion gemessen bei 575 nm.

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(und auch ftir die Zellen, siehe Diskussion) einige Konsequenzen, zu denen unter anderem die erhShte Sensibilit~t gegen verschiedene Strahlenarten gehSrt. I n der vor]iegenden Arbeit werden Versuehe besehrieben und diskutiert, in denen die Sensibilisierung der Transformationsaktivit£t yon DNS gegen UV-Lieht untersucht wurde, in die dieses bromhaltige Analogon des Thymidins, 5-Bromdesoxyuridine (BUdR), eingebaut worden ist. S~TLow und Bo¥oE (Bo¥c]~ und SETLOW, 1963; S]~TLOWund Bo¥c]~, 1963) untersuehten bei Bakterien und Bakteriophagen diese Sensibilisiernng in Abh~ngigkeit yon der We]lenl/~nge des eingestrahlten Lichtes. Sie fanden, dab sie sieh zwischen 230 und 290 nm kaum ~ndert, oberhalb yon 290 nm aber mit der We]lenl/~nge stark zunimmt. Wir haben entsprechende Untersuchungen mit transformierender DNS yon Bacillus subtilis vorgenommen, da in diesem System leiehter ein hoher Einbau von BUdI~ zu erreichen und bei freier D/qS eine eindeutige Trennung yon unsubstituierter (TT), in einem Strang (TB) und in beiden Str~ngen der Doppe]helix substituierter DNS (BB) mSglieh ist. Qualitativ gesehen entspreehen unsere Ergebnisse den erw~hnten von SETLOW und BoYc~. Dureh Einbeziehung der getrennten Untersuchung yon TB kamen wir jedoeh zus~tzlich zu einem Befund, der bier ausfiihrlieher dargelegt werden sell: bei Bestrahlung mit UV-Lieht einer Wellenl~nge, bei der TT kaum und BB noch stark inaktiviert wird (d. i. bei 320 nm), wird TB zun~chst mit verh~ltnism~f~ig starker Dosis-Abh~ngigkeit auf 50 % der urspriinglichen Aktivit~t, dann aber nur noeh mit der geringen, fiir TT eharakteristisehen Rate inaktiviert. I m Zusammenhang mit Ergebnissen anderer Autoren wird dieses Ergebnis dahingehend gedeutet, dab in der DNS-Doppelhelix nur ein bestimmter der beiden Str£nge seine Information weitergeben kann und dab nur deft, we dieser ,,informative" Strang selbst BUdI~ enthglt, die F~thigkeit zur Abgabe sinnvoller Informationen dureh die Bestrahlung zerstSrt worden ist. I n kurzer Form sind die in dieser Arbeit berichteten Ergebnisse und die daraus gezogenen Sehlul3folgerungen bereits friiher verSffentlicht worden (ME~IG~IA~N, 1963 U. 1964). 2. Material und Methoden Material. NB: 0,8 % Difeo Nutrient Broth, 0,5 % NaC1, 0,5 % Glucose, pit 7,0. VB: Minimal-Medium (VOGELand B o ~ , 1956). 2VBcaa: ,,VB" in doppelter Konzentration, angereichert mit 1,5% Difco Casamino Acids. NB-Agar: wie NB, plus 1,6% Difco Bacto-Agar. Mi-Agar: Minimal-Agar (SPIzlz~x, 1958). FUdR: 5-Fluordesoxyuridin (Hoffman-L~ Roche Inc.). BUdR: 5-Bromdesoxyuridin (Calbiochem, Los Angeles/Calif., USA). U: Uracil (Calbiochem). ZS: Zitrat-Saline (1,5 × 10 1M NaC1, 1,5 × 10-~ M Na-Zitrat). ZS(1/10): zehnfach verdiinnte Zitrat-Saline. CsC1und Cs~SO4: gereinigt durch Erhitzen mit Norit und anschliel]ende Umkristallisation. Bakterien: Bac. subtilis 168 (Wildtyp), 21 ind-und phenylala-. BUdR.Einbau. Vorku]tur der Zellen und BUdR-Einbau fanden in 2VBcaa bei 25°C unter hef~igem Schiitteln start. Eine station~re Kultur wurde zehnfach verdiirmt (dadurch OD~75= 0,25 cm-1), 5 Std bebrfitet, erneut dreifach verdiinnt (dadurch wiederum 0D575 0,25cm-1), die erforderlichen Chemika]ien zugegeben (FUdt~: 6×10-sM; U: 6xl0-S; BUdt~: 3 × 10-4 M) und so lange bebrfitet, bis die ODs7s nicht mehr weiter anstieg (nach ungefghr 8 Std Anwesenheit der Chemikalien; die ODs~s war in der Zeit um den Faktor 6 angestiegen). Au]arbeitung der DNS. Zur teilweisen Reinigung der DNS wurde die Methode yon MAR~Sg (1VIAI~lgUR,1961) verwendet. Analytische Dichtegradienten.Zentri]ugation der DN~q. Zentrifugiert wurde in der ana]ytischen Ultrazentrifuge Spinco Modell E bei 25oC und 44770 Up~ fiir 20 Std in einem Rotor,

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der es gestattet, vier Proben gleichzeitig zu untersuchen. Die DNS wurde entweder in CsC1 der Dichte 1,758 g/ml oder in Cs2SO4 der Dichte 1,485 g/ml zentrifugiert. Priiparative Dichtegradienten-Zentri]ugation der DNS. Die DNS-LSsung wurde so stark mit ges~ttigter CsC1-LSsung verdiinnt, dal~ die Menge DNS pro der am st~rksten vertretenen Bande und pro Zentrifugen-RShrchen nicht mehr als 75 ~g betrug ~. Dureh Zugabe yon CsC1-Kristallen wurde die Dichte auf 1,758 g/ml (bei 25°C) eingestellt. Diese LSsung wurde 3 Tage bei 25°C im Rotor SW39 der Spinco-Ultrazentrifuge Modell L bei 35000 UpM zentrifugiert. Der Dichtegradient wurde dureh eine Kanfile abgelassen (SzYBAnSKI, 1960) und in 10-Trop~en-Fraktionenaufgefangen (ungef~hr 0,02 ml pro Tropfen). Von jeder Fraktion wurde die Extinktion bei 260 nm gemessen und Fraktionen mit DNS gleicher Konstitution (d. h. mit der Dichte yon TT, TB bzw. BB) vereinigt. Diese drei Pr~parationen warden zun~ehst in der analytischen Ultrazentrifuge auf Verunreinigungen durch D~S anderer Dichte untersueht. Dann warden sie gegen ZS (1/10) dialysiert. Beztrahlung der DNS mit monochromatischem U V-Licht. Als Quelle ttir monochromatisches UV-Licht wurde der Spektrograph des Argonne-National Laboratory, Lermont/Ill. (USA) benutzt (MONKand EmmET, 1956). Die Leistung des Instruments lug bei 0,21 ergs mm-2 sec-1 fiir 230 nm und bei 15,5 ergs mm-~ see-1 fiir 350 nm. Da dieser hier interessierende Spektralbereieh mit einer foealen Dispersion yon 0,1 nm/mm gleichzeitig zur Bestrahlung verfiigbar ist, konnten mehrere Proben auch gleichzeitig bestrahlt werden. Zur ]3estrahlung wurden die DNS-Pr~parationen auf gleiche optische Dichte eingestellt (OD~60= 2; das entspricht etwa 90 ~g DNS/ml), dann um einen Faktor yon 103 mit ZS (1/10) verdtinnt, so dab die DNSKonzentration etwa 0,1 ~g/ml betrug 3, und in Quarz-Kapillaren (mit einer Bohrung yon 0,5 ram) gefiillt, die dann an einem Ende mit einem zugeschweiBten Poly~thylen-Schlaueh verschlossen wurden. Zur Bestrahlung wurden Kapillaren mit den LSsungen der drei versehiedenen DNS-Arten im Abstand yon 5 mm parallel nebeneinander aufgeh~ngt, so dal~ also hinsiehtlich der Wellenlange des eingestrahlten Liehtes der Unterschied zwisehen den beiden gul]eren Kapillaren nieht mehr als 1 nm betrug. Beziiglich der Reinheit des eingestrahlten Liehtes s. Ref. MONKand E~R~% 1956. Wegen der gul3erst geringen optischen Dichte und der geringen Schichtdieke eriibrigte sieh eine entsprechende Korrektur fiir die eingestrahlte Energie. Trans/ormation. Eine unter kr~ftigem Sehtitteln in NB bei 37°C gewachsene stationare Kultur des zu transformierenden auxotrophen Stammes wurde erst mit NB dreifaeh und nach 2,5 Std t mit VB erneut dreifach verdiinnt und jeweils gleichermal3en weiterbebriitet. Naeh 2 Std, nach denen dann die Kultur ihre maximale Kompetenz erreicht hat, wurden in kleinere Reagenzgl~ser 0,2 ml dieser Kultur abgefiillt, in denen sich bereits 0,005 ml der zu untersuchenden DNS-LSsung befanden. (Bei der resultierenden DNS-Konzentration befindet man sich im Bereieh direkter Proportionalit~t zwischen DNS-Konzentration und TransformantenZahl.) Diese Mischung wurde unter st~ndigem Sehiitteln eine weitere 1/2 Std bebriitet, und darm wurden davon 0,1 ml auf Mi-Agar zur Bestimmung der Anzahl Transformanten und, nach geeigneter Verdtinnung, 0,1 ml auf NB-Agar zur Bestimmung des Keimtiters ausgespatelt. Die Platten wurden naeh zweit~giger Bebriitung ausgez~hlt. Da vergleiehbare Untersuehungen an normaler und BUdR-haltiger DNS naeh unseren Effahrungen nur dam1 verwertbare Ergebnisse liefern, wenn die DNS-Pr~parationen ganz frisch sind, wurden die Bestrahlungen und die Tests auf verbliebene Transformationsaktivitgt gleieh anschlie~end an die Aufarbeitung durchgefiihrt. Ist die Konzentration grSl3er, so ist die Trennung der einzelnen Banden voneinander schlecht, und damit einher geht unter Umst~nden sogar eine Umkehrung der Banden-Reihenfolge (Vertauschung der Reihenfolge ,,TT--TB--BB" in ,,TB---TT BB"). Pyknometrisehe Messungen ergaben, dab in einem solchen Fall auch der Verlauf des Diehtegradienten im selben Sinne unste~ig verlief. 3 Bei den Konzentrationsangaben in den beiden friiheren Publikationen ( M ~ I G ~ A ~ , 1963 u. 1964) war es irrtiimlieh vergessen worden, diesen Verdiinnungsfaktor zu beriieksichtigen, so dal] die dortigen Werte entsprechend zu hoch angegeben sind. Das angefiihrte Zeitsehema h~ngt stark ab yon den verwendeten Volumina (hier: 10 ml fiir die Kultur his zur Erreichung der station~ren Phase und 30 ml naeh jeder der beiden Verdfinnungen) und der Sehfittelfrequenz (hier: etwa 150 UpM).

Inaktivierung BUdR-substituierter transformierender DNS

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3. Experimente I n einer Reihe von Experimenten ( M ~ I G M A ~ , 1965b) war ausprobiert worden, welehe Bedingungen einen giinstigen Kompromil3 darstellen zwischen

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Abb. 1. Inaktivierung der Transformationsaktivitat unsubstituierter (TT), einstr~ngig (TB) und zweistrangig (BB) mit BUdl~ substituierter DNS durch monochromatisches UV-Licht verschiedener Wellenl~ngen. Inaktivierung durch UV-Licht der Wellenl~nge 230 nm (a), 260 nm (b), 290 nm (c), 320 nm (d) und 350 nm (e)

350am :~ 5

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75o

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dem Grad des BUdR-Einbaues, dem Titer der diese Behandlung iiberlebenden Zellen und der spezifisehen Transformationsaktivitat substituierter DNS im Vergleieh zu unsubstituierter. Es war gefunden worden, da~ das unter Material und Methoden aufgeffihrte Verh£1tnis zwisehen anf~nglieher Keimzahl, FUdR-, U- und

1

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H.-D. MENNIGMANN:

BUdR-Konzentration bei der relativ niedrigen Temperatur yon 25°C einen guten BUdl%-Einbau liefert (80--100 % des TdI~ sind durch BUdl% ersetzt). Die anf~ngliche Keimzahl stieg zun~chst welter an, war aber zum Zeitpunkt, da TB und BB etwa in gleicher Menge vorhanden waren, nur auf den Ausgangswert abgefallen. Die Ergebnisse yon so gewonnener, gereinigter, fraktionierter und nach Bestrahlung mit monoehromatischem UV-Licht auf verbliebene Transformationsaktivit~t gepriifter DNS sind in Abb. 1 dargestellt. Jeder einzelne Wert stellt das Mittel aus 2--4 Einzelmessungen dar. Untersucht wurde die Transformation yon ,,Indol-Abh~ngigkeit" bzw. ,,Phenylalanin-Abh~ngigkeit" zur jeweiligen Unabhi~ngigkeit (d.h. zum Wildtyp). Da zwischen beiden MerkmMen kein signifikanter Untersehied bestand, wurden die Ergebnisse vereinigt. Die spezifische Transformationsaktivit~t (Anzahl Transformanten pro Menge DNS) betrug, wenn man diejenige ffir TT 100% setzt, ffir TB 85% und fiir BB 75%. Die zus~tzlichen durchgehend gezeichneten Kurven in Abb. I a und 1 d stellen ftir TT und BB die nach Augenmal~ bestpassendste Kurve dar. Diejenigen Kurven ffir TB und die gestrichelten Kurven in Abb. I b und 1 c sind aufgrund einer Hypothese, wie sie in der ,,Diskussion" dargestellt werden wird, errechnet worden. 4. Diskussion

a) Inalctivierung durch U V Der Einbau von BUdR in die DNS hat zur Folge, dal~ dadurch Organismen gegen die Wirkung von UV-Strahlen sensitiviert werden. Es konnte gezeigt werdcn, da~ diese Sensitivierung tats~chlich atrf dem Einbau in die DNS und nicht auf der Labilis~erung anderer Strukturen im Zusammenhang mit der Giftigkeit beruht (OPA~A-KVBINSXA et al., 1961). Angeregt durch die Arbeiten an BUdR-substituierten Bakterien (Bo¥cE und SETLOW, 1963) und Bakteriophagen (SETLOW und BoYcw, 1963), hatten wit die bisherigen Untersuchungen ffir 2537 A auf kleinere und grSl~ere Wellenl~ngen, und zwar getrennt ffir jede der drei DNSSorten, ausgedehnt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse aus Bestrahlungen bei l~ngeren Wellenl~ngen (320 nm) ]assen fo]gende Besehreibung dcr Kurve zu (Abb. 1 d): Die Inaktivierungskurve ffir TB entsprieht derjenigen einer heterogenen 1)opulation, die aus zwei gleieh grogen Teil-Populationen mit unterschiedlicher Sensitiviti~t zusammengesetzt ist. Es sollte, da die Endneigung der TBKurve der TT-Kurve gleich zu sein scheint, versucht werden zu analysieren, inwieweit formal gesehen diese I-Ieterogenitiit dutch die ttypothese erkl~rt werden kann, dab sieh TB wie eine Mischung aus gleichen Teilen yon TT und BB verhi~lt. Ffir solche Inaktivierungskurven, bei denen die experimentellen Daten mit der atffgrund dieser ttypothese errechneten Kurve in Einklang stehen, w~re man zu der Annahme berechtigt, dal~ jeder Strang einer DNS-Doppelhelix unabh~ngig yon dem anderen Strang durch die ]3estrahlung inaktiviert wurde. In Abb. 1 d sind die Inaktivierungskurven ffir Bestrahlung bei 320 nm wiedergegeben. Aus den Neigungen der Kurven ffir T T und BB ist die theoretische Kurve ftir eine Mischung aus gleiehen Teilen dieser beiden DNS-Sorten berechnet worden. Sie stimmt jedenfalls in ihrem zweiten Teil hinreichend genau mit den experimentellen Werten fiir TB fiberein. (~ber den ersten Teil kann wegen der geringen Zahl yon Versuchs-Punkten keine genauere Aussage gemacht werden

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als die, dab sie den experimentellen Werten nicht widersprieht.) Da die Kurven fiir die ersteren beiden DNS-Sorten in dem untersuchten Bereieh gradlinig verlaufen, extrapoliert diese theoretisehe Knrve f fir TB zurfiek auf den Wert yon 50%. Da andererseits die entsprechenden Kurven ffir Bestrahlung bei kiirzeren Wellenlgngen nicht gradlinig verlaufen (Abb. l a--c), konnte erst eine solehe Reehnung zeigen, dag die Erklgrung zumindest ffir den anf/~ngliehen Tell der Inaktivierungskurven aueh fiir diese Wellenl/~ngen zutrifft. Eine Erkl/~rung daffir, dab sigh die Kurve ffir TB bei Bestrahlung mit UV-Lieht der Wellenlgnge 260 und 290 nm (Abb. 1 b und e) bei starker Inaktivierung nieht mehr so verhglt wie eine Misehung aus gleiehen Teilen der anderen beiden DNS-Sorten, sondern eine st/~rkere Neigung hat (d.h. dag die beiden Strange einer DNS-Doppelhelix vermutlieh nieht unabhangig voneinander inaktiviert werden), kSnnte darin liegen, dag bei dieser Wellenl/~nge aus dem BUdR mehrere stabile Photoprodukte entstehen (SMITH, 1961). Wenn yon diesen eines, das nur einen kleinen Anteil aller dieser Photoprodukte ausmaeht, aus einer Reaktion mit dem unsubstituierten DNS-Strang stammt (z.B. ein Inter-Strang-Dimeres), dann wiirde man ein solehes Ergebnis erwarten. Dagegen kann man bei Bestrahlung mit langwelligem UV-Lieht aufgrund der naehweisbaren Photoprodukte (WAoxE~ et al., 1962) eine solehe Reaktion aussehlieBen (weitere Diskussion siehe unten). Der Versueh, die Ergebnisse der Bestrahlung bei 230 nm zu verstehen, st6gt auf die Sehwierigkeit, dab uns Daten fiber die Photoprodukte dieser Wellenl~nge yon BUdRhMtiger DNS nieht bekannt geworden sind. Das aber dfirfte yon besonderem Interesse skin, da bier die einzelnen Str/~nge (wie bei 320 nm) offenbar unabh£ngig yon einander inaktiviert werden. Man wird somit zu der Spekulation verleitet, dag Inter-Strang-Verknfipfungen nur bei ,,mittleren" UV-Wellenl~ngen mSglieh sind (es sei denn, dab Verknfipfungen zwisehen zwei thymidinhaltigen Str/ingen anderen Gesetzm/~13igkeiten folgen als die zwisehen einem thymidin- und einem BUdR-haltigen). Die Deutung des Verhaltens yon TB kann im Zusammenhang mit Befunden fiber den Meehanismns verstanden werden, mit dem die in der DNS gespeieherte Information abgelesen wird. Betrachtet man die Inaktivierungskurve ffir 320 nm (Abb. 1 d), so entsteht - - wie oben gesagt - - aufgrund des Knrvenverlaufes der Verdaeht, dag die Population der DNS-Molekfile heterogen ist. Den Grund daf/ir wird man darin suehen mfissen, dag in einer Population yon TB-Molekfilen 50 % aller Doppelheliees den einen und 50% den dazu komplementgren DNS-Strang mit BUdI~ substituiert haben. Wenn man versueht ist, diese experimentellen Ergebnisse im t~ahmen eines Modelles zu verstehen, so stSgt man leider auf die Sehwierigkeit, dag mehrere Modelle mit den Befunden zu vereinbaren sind (s. unten). Diese Sehwierigkeit riihrt daher, dab ffir das Transformationssystem yon Bac. subtilis gefunden wurde (BoDME~ und GAN]~SA~, 1964; Bee, 1965), dab bei der Transformation die DNS als Einzelstrang inkorporiert wird. Da inzwisehen von anderen Autoren Untersuchungen an dem Bakteriophagen A vorgelegt wurden, die sieh ebenfalls mit der Sensitivierung dutch BUdR gegen langwelligeres UV-LiGht befassen, sei folgende Bemerkung bereits bier eingesehoben : t~fir den Bakteriophagen ~ wurde gezeigt (Fox und M]~SELSON, 1963), dag bei einstr/~ngig mit BUdt~ substituierter DNS dutch Bestrahlung mit langwelligem UV nieht mehr als 50% der Phagen inaktiviert 6 Molec. Gen. Genetics 99

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werden kSnnen. Da man annehmen mul3, dal] nur einer der beiden DIqS-Str/~nge als Informationsquelle bei der m-l%NS-Synthese dient, und da bei dem Phagen A beide Strange repliziert werden (Fox-K~LT.w~, 1964), ist es mSglich, aufgrund jener Ergebnisse (Fox und M~SELSON, 1963) zu dem Seh]uB zu kommen, dal~ es yon den beiden DNS-Funktionen - - die Steuerung der eigenen Replikation und die der Transkription in m-I%NS - - die letztere ist, die in BUdR-haltiger DIqS dureh langwelliges UV beeinflul~t worden ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit an BUdR-haltiger transformierender DNS stehen ebenfalls damit in Einklang. Im folgenden sei das fiir beide Systeme gleichzeitig diskutiert. In einer TB-Population yon Phagen oder Molekfilen transformierender DNS haben jeweils 50% der DNS-Doppelhelices das BUdl% im ,,informativen" (i+) und 50 % im ,,nicht-informativen" (i-) Strang. Waren die Phagen bzw. die transformierende DNS nicht bestrahlt, so erh~lt man, je nach der Annahme fiber die Anzahl der an der weiteren Replikation teflnehmenden DNS-Str~nge, eine bestimmte Verteilung der Eltern-DNS-Str~nge in der Nachkommenschaft. Zur ]3erechnung dieser Verteilung mul~ man im Zusammenhang mit den beiden DIqSFunktionen zun~chst wenigstens die folgenden Annahmen machen: 1. Der Meehanismus, der zum durch den Schaden bedingten AusschluB (yon der Transkription oder l%eplikation) eines der beiden Strange ffihrt, kann nicht zwischen i+ und i- unterscheiden. 2. Zwisehen zwei Replikationszyklen ist mindestens ein einmaliges Ablesen eingeschaltet. 3. Wenn das Ablesen einmal unmSglich war, dann findet auch keine weitere Replfl~ation mehr start. 4. Eine yon einem Phagen bzw. yon transformierender DNS infizierte Zelle wird zu einem Plaque bzw. zu einer Kolonie aus Transformantennaehkommen ffihren, wenn nach der ersten Replikation mindestens eines der Genome zu weiterer Replikation f/~hig ist. Ffir Bakterien, die mit bestrahlten Phagen bzw. bestrahlter ~ransformierender DNS infiziert sind, gilt obiges (auSer, dal~ im Gegensatz zum BUdR dessen Photoprodukt dem Tdl~ nicht mehr gleichwertig ist) und zus/~tzlich folgendes: 5. Wenn das Photoprodukt den Ablese-Mechanismus stSrt, dann ist ein Photoprodukt in i- ohne Einfluf~ auf das Ablesen yon i +. 6. Wenn das Photoprodukt den Replikations-Mechanismus stSrt, dann genfigt bereits die Entstehung eines Photoproduktes in einem der beiden Str/~nge, um die l~eplikation beider Str/inge zu verhindern. Mit Hilfe dieser Annahmen kSnnen die Werte ffir den zu erwartenden Prozentsatz der Uberlebenden nach Bestrahlung von TB ffir folgende Hypothesen errechnet werden: A. tIypothesen bezfiglieh der Reihenfolge yon Replikation und Transkription : Entweder: a) Erst Replikation, dann Transkription, oder: b) Erst Transkription, dann l~eplikation. B. Hypothesen bezfiglich des Einflusses der UV-L/~sion auf l~eplikation bzw. Transkription: Entweder: a) L/~sion verhindert Transkription. (Das Photoprodukt erlaubt nicht die Bildung vollst/~ndiger, ffir die Zelle sinnvoller m-RNS)

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oder: b) L~sion verhindert Replikation. (Das Photoprodukt erlaubt nicht die Synthese der zu ]edem ursprfinglichen Strang komplement~ren neuen Strange.) Bei den Phagen sollte man, da beide Strange an der weiteren Replikation teflnehmen, ein ~berleben yon 50% der Ausgangspopu]ation nur dann erwarten, wenn vor der ersten Replikation der infizierenden Phagen-DNS erst eine Transkription stattfindet. Das steht in Einklang mit dem, was man fiber die sog. ,,frtihen Proteine" naeh der Phagen-Infektion wei~ (Co~E~ und FOWLER, 1947; tIm~sHEY und MELEC~E~, 1957; MELECHE~, 1955; TOMIZAWA und SU~A~:AWA, 1956; TOMIZAWA, 1958). Danaeh muI3, damit phagenspezifische DNS synthetisiert werden kann, zuerst phagenspezifisehes Protein gebfldet werden. Das ist aber erst mSglich, nachdem yon der infizierenden Phagen-DNS zunaehst wenigstens ein Teil und wenigstens einmal die Information abgelesen, d.h. naehdem m-RNS gebildet worden ist, bevor die erste Replikation stattfinden kann. Weiterhin l~Bt sicb zeigen, dal] der Sehaden die Synthese normal funktionsf~higer m-I~NS gest6rt haben muG, und nieht etwa den Replikationsmeehanismus. Das steht im Gegensatz zu denjenigen UV-Schaden, die bei Bestrahlung normaler DNS mit Wellenlgngen < 3 0 0 n m bei Bakterien (SETLOW etal., 1963) und Primer-DNS (BoLLuM und SETLOW, 1963) hervorgerufen werden: diese stSren die l~eplikation der DNS. Da bei der Transformation yon Bac. subt. nur einer der beiden Strange inkorporiert wird (BODMEt~und GANESAN, 1964; BUC, 1965), ist es nicht mSglich, eine solche Entscheidung zu treffen; denn mehrere Kombinationen aus obigen ttypothescn lassen ein Uberleben yon 50 % erwarten: man wgre also nur zu einem AnalogieschluB berechtigt.

b) Schutzsto]]wirlsung Bisher ist nicht hervorgehoben worden, dab die Experimente (Fox und Ms~sv~LsoN, 1963) an dem Bakteriophagen ~ nur dann zu einem minimalen ~berleben yon 50 % ffihrten, wenn w~hrend der Bestrahlung der Schutzstoff 2-Amino£thyl-isothiouronium-bromid (mit Cysteamin als aktiver Komponente) anwesend ist. Ohne diese Substanz sinkt der Anteil der l~lberlebenden mit weiterer Bestrahlung st£ndig ab (persSn]iche Mitteilung der Autoren, zitiert in HoTz, 1964). Bei unseren Experimenten war w~hrend der Bestrahlung keinerlei Strahlen-Schutzsubstanz anwesend. Der vermeintliche Widerspruch, dal~ trotz der unterschiedlichen Versuchsbedingungen bei beiden Systemen dasselbe Versuehsergebnis erhalten wurde, liegt wohl an der untersehiedlichen Anordnung der DNS in den beiden Systemen und mSglieherweise an der physikaliseh-chemischen Struktur des Photoproduktes. In einem Phagen-Kopf ist die D~NS in der wohl diehtest mSgliehen Form gepaekt, d.h. die 5rtliche DNS-Konzentration ist yon der GrSl3enordnung 1 g/ml. Bei unseren Experimenten mit transformierender DNS dagegen betrug die DNS-Konzentration nur 10-7 g/ml. Im Phagen-Kopf haben also die verschiedenen Teile der aufgefalteten DNS voneinander nur einen Abstand yon hSchstens einigen ~, w~hrend bei transformierender DIqS der Abstand zwischen verschiedenen Bruchstiicken einige ~ betrug. Die Photo-Reaktionen, die in Anwesenheit yon Cysteamin ablaufen, sind also offenbar DNS-konzentrationsunabh~ngig, w£hrend die, welche bei Abwesenheit von Cysteamin zus~ttzlieh ablaufen kSnnen, konzentrationsabh~ngig sind. 6*

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H.-D. MEN~GMANN:

Bestrahlung BUdR-haltiger DNS mit UV der Wellenlange 260 nm liefert mehrere Arten yon Photoproduktcn (SMITJ~, ]961). In BUdR-haltiger DNS wurde dagegen nach Bestrahlung mit langwelligem UV nur eine Veranderung festgestellt, namlich Uracil (WACKV.~ et al., 1962). Das besagt nicht, dab das Uracil das primare Photoprodukt ist, welches fiir den Orga~fismus letal wirkt. Zumindest muB das Vorhandensein dieser Base in der DNS nicht grundsatzlich zu einer biologisch inaktiven DNS fiihren; denn man hat sogar natiirlich vorkommende D ~ S mit Uracil start Thymin gefunden (TAKAHAStII, 1963; TAKAHASHI und MAR~V~, 1963a und 1963 b; LA~G~IDGE and MARMU~, 1964). AuBerdem wiirden Photoprodukte wie das Wasseraddukt das Uracfls bei der Spaltung der DNS in die Basen und anschlieBender Chromatographic zerstSrt werden und auch als Uracil erscheinen. Jedenfalls aber sind alle Photoprodukte langwelligen UVs dehalogeniert. Als primare Photoprodukte sind darum das Uracil- und das Brom-Radikal anzusehen. Von diesen beiden dtirfte das Uracil-Radikal als dasjenige Photoprodukt anzusehen sein, das oben als ,,konzentrationsunabhangig" bezeichnet wurde, well es in der DNS ,,fixiert" ist und folglich nut an Ort und Stelle weiterreagieren kann. Das Brom-Radikal dagegen kSnnte auch an anderer Stelle weiterreagieren - - es ware also ,,konzentrationsabhangig". Das wird im Falle der transformierenden DNS aber nur selten eintreten, da als Reaktionspartner zum Beispiel Wasser im UberschuB vorhanden und daher die Lebensdauer eines solchen Radikals verhaltnismaBig kurz ist. Innerhalb eines Phagcn-Kopfes besteht aber wegen der hohen 5rtlichen DNS-Konzentration eine viel grSBere Wahrscheinlichkeit,daB ein solehes Brom-Radikal wieder mit der DNS reagiert - - und zwar wegen der DNS-Faltung auch an einer anderen Stelle der DNS als der seiner Entstehung. Hinzu kommt, daB eine solche sekund~re Reaktion des Brom-Radikals fiir Phagen auch deshalb eine viel grSBere Wahrscheinlichkeit hat, letal zu sein, weft bei Phagen zur Erhaltung der Aktivit~t das ganze Genom mit einer Lange von ungefahr 50 ~ unbeschadigt sein muG. Die transformierende DNS dagcgen hat 1. nur eine Lange yon ungef~hr 5 ~, 2. wird nur ein Tell davon nachher in die zelleigene DNS inkorporiert, und 3. tragt nur etwa jedes ffinfzigste der Molekfile das untersuchte Merkmal. Aus dem Gesagten folgt, dab die Schutzwirkung des Cysteamins darin bestehen kSnnte, im Phagen-Kopf die Brom-t~adikale abzufangen und dadurch sekund~re Reaktionen zu vermeiden, die bei transformierender DNS wegen der geringen Konzentration sowieso nicht auftreten. Da sich Phagen und transformierende DNS aber auch noch durch den ProteinMantel ersterer unterscheiden, besteht als andere ErklarungsmSglichkeit, dab das Brom-l~adikal nicht mit der DNS wciterreagiert, sondern seine Energie auf das Protein fibertr~gt. Sie kann dann auf diesem weitergeleitet werden, so dab an einer g£nzlich anderen Stelle eine l~eaktion geschehen kann (J. S~AVFF, pers6nliche Mitteilung). Auf diese Weise kSnnte z.B. der Adsorptions- oder Injektionsmechanismus beeinfluBt werden. Es ware abet auch denkbar, dab das BromRadikal als Energiequelle zusatzlich zu der Energie aus der UV-Bestrahlung das Protein in einen angeregten Zustand versetzt, der es ihm erlaubt, leichter mit der DNS zu reagieren (J. STAUFF, persSnliche Mitteilung). Ffir die Bestrahlung yon Bakterien mit UV der Wellenlange 260 nm hat man zeigen kSnnen, dab tatsaehlich eine Verkniipfung zwischen DNS und Protein stattfinden kann (AnEXAND]~g und

Inaktivierung BUdR-substituierter transformierender DNS

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Moxoso~x, 1962; SMITI~, 1962). I n w i e w e i t diese B e o b a c h t u n g allerdings biologische B e d e u t u n g h a t , ist schwer zu beurteilen. I n t e r e s s a n t e r w e i s e w u r d e auch beoba c h t e t (SMITI~, 1964), dal3 P r o t e i n u n d D N S selbst d a n n eine feste Verknfipfung eingehen, wenn sie beide einzeln oder aueh n u r einer y o n i h n e n g e t r e n n t v o m a n d e r e n b e s t r a h l t wurden. D a b e i erwies sieh B U d l ~ - h a l t i g e D N S gegeniiber d e r Verknfipfung m i t P r o t e i n als ffinffach sensitiver (SMITI~, 1964). U n d selbst diejenige B U d R - h a l t i g e D N S , die erst isoliert u n d d a n n U V - b e s t r a h l t w u r d e , w i r d noeh bei einer erst sp/~ter erfolgenden C h r o m a t o g r a p h i e zu einem sehr viel hSheren G r a d e a n m e t h y l i e r t e s A l b u m i n g e b u n d e n als die gleicherweise b e h a n d e l t e u n s u b s t i t u i e r t e K o n t r o l l - D N S (OPARA-KuBINSKA e t a ] . , 1963). Bei diesen z u l e t z t g e n a n n t e n m6gliehen V e r ~ n d e r u n g e n a m P r o t e i n w~re es d e n k b a r , d a b das C y s t e a m i n seine S c h u t z w i r k u n g ausfiben k a n n , ohne in den P h a g e n - K o p f eing e d r u n g e n zu sein. Bei der Durchfiihrung dieser Arbeit ist mir von mancher Seite Unterstiitzung widerfahren. Allen Beteiligten sei daffir aufrichtig gedankt: der Rockefeller Foundation, New York (USA) ffir ein Forschungsstipendium in den Jahren 1961/62 - - Herrn Dr. W. SZYBALSKI, MeArdle Memorial Lab., Madison/Wise. (USA) fiir einen Arbeitsplatz in seinem Labor - Herrn Dr. H. E. KUBITSCI~EK,Argonne Natl. Lab., Lemont/Ill. (USA) ffir seine Gastfreundsehaft wghrend der Bestrahlungsversuche und fiir seine aufgrund des strengen Winters 1961/62 zus~tzlich erforderlich gewordene Hilfe - - Herrn P~uI~ ELLWANGER,Argonne Natl. Lab., Lemont/Ill. (USA) ffir die Durchfiihrung der Bestrahlung mit dem Spektrographen des Instituts und die Dosimetrie - - meiner Frau fiir ihre unermiidliche Hilfe bei der Durchffihrung und Auswertung der Versuche - - Frau Z. OPAI~A-KuBIlgSKAfiir die ~3berlassung der BakterienStgmme - - und schlieBlich den Herren Professoren IZ. W. KAPI,A~, J. STAU~ und W. SZY:BALSKIfiir ihr stets fSrderndes Interesse und ihre anregenden Diskussionen. Literatur ALnXA~D~, P., and H. MOROSO~: Cross-linking of deoxyribonucleic acid to protein following ultra-violet irradiation of different cells. Nature (Lond.) 194, 882--883 (1962). BoDM~, W. F., and A.T. GA~SAN: Biochemical and genetic studies of integration and recombination in Bacillus subtilis transformation. Genetics 50, 717--738 (1964). BOL~UM, F. J., and R. B. SETLOW: Ultraviolet inactivation of DNA primer activity. I. Effects of different wavelengths and doses. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 68, 599--607 (1963). BoYcE, R., and 1%. S~TLOW: The action spectra for ultraviolet-light inactivation of systems containing 5-bromouracil-substituted deoxyribonucleic acid. I. Escherichia coli 15 T-A-U-. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 68, 4 4 6 ~ 5 4 (1963). Bue, H.: On the mechanism of DNA integration in Bacillus subtilis transformation. 9th Annual Meeting of the Biophys. Sot., 1964 (Abstracts). Biophys. J. 5, WG 1 (1965). CO~E~, S. S., J. G. FLA~S, H. D . B A ~ , M. R. Lo~n, and J. LIC~nNST~I~: The mode of action of 5-fluorouracil and its derivatives. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.) 44, 1004--1012 (1958). - - , and C. B. t~own~l~: Chemical studies on host virus interactions. IV. Tryptophan requirements in stages of virus multiplication in t h e Escherichia coli - - T 2 bacteriophage system. J. exp. Med. 85, 771--784 (1947). Fo x, E., and M. ~¢[]~S~LSON:Unequal photosensitivity of the two strands of DNA in bacteriophage A. J. molec. Biol. 7, 583--589 (1963). Fox-KEI~L~I~, E.: Single-burst analysis for semiconserved phage. Virology 22, 649--659 (1964). H~l~SltnY, A. D., and N. E. M ~ I ~ C ~ : Synthesis of phage-precursor nucleic acid in the presence of chloramphenieol. Virology 3, 207--236 (1957).

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