Zeitschrift ffir Anatomie und Entwicklungsgeschiehte, Bd. 117, S. 36--69 (1953).

Istituto di Anatomia umana, d'Istologia ed Embriologia generMe dell'Universit~ di Genova (Direttore: Prof. F~gDI~A~D0 I%OSSI).

La reazione istochimica per la ~osfatasi acida nello studio dello sviluppo prenatale dell'uomo*. Di •o ROSSI~ Go llESCETTO @E. REALE. Con 17 figure e 4 sehemi neI testo i.

Introduzione. E ' s t a t o messo in luce, non s o l t a n t o d a noi p e r l ' U o m o , m a anche d a Mtri in a n i m a l i differenti, con ricca d o c u m e n t a z i o n e , lo s t r e t t o r a p p o r t o t r a il diL f e r e n z i a m e n t o istologico e l'organogenesi d a u n lato e l ' a z i o n e di enzimi dalI'Mtro. II complesso p r o b l e m a biochimico ed istochimico del differenziamento embrionale e dell'organogenesi g t u t t a v i a solo in piccola p a r t e risolto e p u r t r o p p o sino a d oggi quasi sempre all'infuori d e l l ' U o m o ; moltissimi p a r t i c o l a r i di esso ci sfuggono. L ' e m b r i o l o g i a dell'Uomo, p e r q u a n t o r i g u a r d a i primissimi s t a d i di sviluppo del germe, g ancora, nel suo complesso, un a d a t t a m e n t o teorico di illazioni d e s u n t e d a l l ' e m b r i o l o g i a c o m p a r a t a ; essa ~ comunque u n ' c m b r i o i o g i a p u r a m e n t e d e s c r i t t i v a . Se poi si considera il c a m p o chimico (bioehimico ed istochimieo) dell'embriologia, l ' U o m o non h a offerto sino a d oggi quasi p e r niente il suo materiMe alla risoluzione del p r o b l e m a p r o s p e t t a t o . L ' e m b r i o l o g i a chimica, come del resto quella sperimentale, si a p p u n t a p e r ora e p e r ovvie ragioni, all'infuori d e l l ' U o m o , ogni giorno p i h perfezionando la d i m o s t r a z i o n e di profonde differenze degli a s p e t t i istoehimiei dell'ontogenesi t r a specie e specie. E ' d u n q u e g i u s t i f i e a t a la n o s t r a p r e t e s a di cogliere qualche a s p e t t o del differenziamento istologico e dell'organogenesi nell'Uomo, p e r ora con la ricerea istochimiea ed in seguito certo anche con quella bioehimica. I n d u b b i a m e n t e questo e o m p i t o p r e s e n t a m o l t e difficolts m a gode perb di qualche facilitazione. Le p r i m e sono i n e r e n t i alla r a c c o l t a del m a t e r i a l e e d e t e r m i n a n o u n a r e l a t i v a limitazione alla ricerca; le facilitazioni sono offerte invece proprio dall'esperienza aequisita con le osservazioni all'infuori d e l l ' U o m o di cui ci si pub, in certo modo, valere. L e variazioni d e l l a / o s / a t a s i alcalina (il pifl aceessibile degli enzimi alle indagini istochimiche) p e r q u a n t o concerne sia la sua r i p a r t i z i o n e sia il suo tasso, ei sono a p p a r s e , nello sviluppo p r e n a t a l e dell'Uomo, precise e significative ~. Confrontati * Le ricerche di Embriologia chimica umana si svolgono col concorso della Rock4eller

Foundation (t{ossI). Glischemi cheillustrano questo lavoro sono opera del disegnatore e tecnico dell'Istituto, sig. A~G~Lo BOGLIO~E, che ringraziamo. 2 RossI, F., G. P~SC~T~rO e E. REiLE: L~ locMizz~zione istochimica della fosfatasi alcalin~elesuevariazionineleorsodellosvihppoprenatMedelFUomo. Z. Anat. 115 (1951).I processi di differenziazione e di org~nogenesi e le attivit~ enzimatiehe, l%icerche istochimiehe sulla fosfatasi alcalina nelFembrione e nel feto umano. Monit. zook ital., suppl. 59 (1951). - Histological studies on the phosphatase in the human embryo. 5. Internat. Anat. Congr., Oxford 1950. - - L'activit~ phosphatasique darts Fembryon human de neuf ram. Nouvelles contributions a nos recherches histochimiques sur les variations du taux enzymatique pendent l'ontogenese de l'homme. C.r. Assoc. Anat., 38. R4union, Nancy 1951. - - La localizzazione della fosfatasi alealina ed il suo tasso nelFembrione umano di 9 ram. Z. Anat, 116 (1951). - La fosfatasi acida nelle attivit& enzima~iche operanti .nell'organogenesi delFUomo. Atti Soc. ItM. Anat., ottobre 1951.

La reazione istoehimica per la fosfatasi aeida.

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inoltre i nostri reperti umani con quelli non umani di varl AA. abbiamo riseontrato un aeeordo eonfortante per determinati abbozzi e trovati plausibili i risultati divergenti eonseguiti per altri. Ma nel problema eui si ~ pifi volte aeeennato, l'attivits della fosfatasi alealina, se ha la sun importanza, non pub essere certo ritenuta da sola responsabile delle principali sollecitazioni o addirittura della determinazione dei fenomeni ontogenetiei. Da ricerche eomparse nella letteratura pi~ recente, sembrerebbe addirittura che gli elementi embrionali eontengano tutti i rappresentanti delle varie eategorie enzimatiehe e the, eorrelativamente all'evoluzione del germe, esista nn'evoluzione enzimatiea. Ma l'identifieazione qualitativa, quantitativa e topografica di eatalizzatori delle reazioni cellulari procede lentamente e limitatamente o quasi alle primissime fasi dello sviluppo; essa deve essere perseguita e, per quanto ~ possibile, anehe nell'Uomo, mettendo a punto le teeniehe speeifiehe. Noi riteniamo ehe tutti i tentativi eondotti con questo intento meritino di essere resi noti in qu0mto solleeitano quell'analisi critica the ha sempre determinato il perfezionamento della ricerca. Queste premesse si riferiseono in modo particolare, come 6 ovvio, a quanto 6 oggetto di questa nora e eio6 alla dimostrazione della/os/atasi acida in sezioni seriate di materiMe embrionario e fetale umano, eorrispondente ad un lungo periodo ontogenetieo. La teenica istochimiea the abbiamo adottato per l'indagine 6 quella ideata dal Go~o~I (i941), ehe per primo l'ha proposta. Le variazioni apportate dal GO•ORI per la dimostrazione della fosfatasi acida, alla metodologia eh'egli e eontemporaneamente TaKaMaTSV hanno eseogitato per la fosfatasi alcalina, sono lievi e ben note perch6 riportate ampiamente nella letteratural; l'avvertenza principale g quella di adeguare opportunamente il pj~ del liquido d'incubazione (p~ =4,7). Nel preparare la miseela d'ineubazione, in luogo del nitrato di Ca solubile a pg 5, s'impiega il nitrato di piombo. Coloro ehe gi~ utilizzarono questo metodo per la fosfatasi acida lamentano il fatto ehe esso, in eonfronto a quello per la fosfatasi alcalina, 6 meno preeiso, nel senso the aleatorio e ehe ds luogo faeilmente a fenomeni di diffusione dell'enzima o per lo meno del preeipitato di solfuro di piombo. Sono eritiehe, a nostro avviso, di notevole importanza soprattutto per indagini strettamente eireoseritte all'ambito d i u n a cellula; esse furono fatte, sebbene in misura minore, anehe alia tecnica per la fosfatasi alealina. Nel nostro easo, pur tenendone eonto, non riteniamo the questa aleatoriet~ del metodo (ehe del resto possiamo eonfermare) sin tale da pregiudieare i risultati delle rieerehe intraprese. I1 nostro studio si 6 iniziato dallo stadio di mm 9 CR, quando gli abbozzi degli organi sono gis quasi tutti presenti. I n tal caso ritenemmo suffieiente stabilire se un determinato abbozzo possiede, oppure no, eontenuto di fosfatasi aeida; ne seguimmo poi le variazioni durante le tappe ulteriori dello sviluppo. Per ridurre, per quanto possibile, le cause di errore abbiamo tenuto conto soltanto delle espressioni pifi significative della reazione enzimatica. i Fissazione in acetone a freddo. Substr~to: tampone all'acetato (acct. di Na-~ ae. aeetico), nitrato di Pb, aequa dist. e glicerofosfato di Na 3,2% ; tempo di incubazione di ore 24. Lavaggio in acqua distfllata, p~ssaggio in solfuro di ammonio per 2'. L'originale glicerofosf~to fu poi sostituito da taluno con diversi altri substrati: acido adenilieo, acido guanilico, aeido citidilico, acido ribonucleico e glucosio-l-fosf~to,etc.. )In non appare ancora ben chiarito quale sin l'importanza dei vari substrati proposti per la separazione delle singole fosfatasi. Zeitschr. f. Anat. u. Entwicklungsgesch. Bd. 117.

3a,

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F. RossI, G. P~so~To e E. R ~ L ~ : Analisi bibliografica.

L a l e t t e r a t u r a si 6 a r r i c c h i t a di notizie di ricerche e, quindi, di d a t i sull'att i v i t s della ]os/atasi acida in genere, p a r t i c o l a r m e n t e negli u l t i m i einque o sei a n n i ; p r i m d l ' a t t e n z i o n e 6 s t a t a r i v o l t a solo o quasi, alla fosfatasi alcalina. Le ricerehe p r e c e d e n t i alla n o s t r a sono s t a t e eseguite quasi t u t t e in soggetti a d u l t i (animali v a r i e d anehe uomo), poehissime si ri~eriscono a giovani soggetti ed in n u m e r o ancora minore sono quelle ehe concernono io sviluppo p r e n a t a l e e t e s s u t i c o l t i v a t i in vitro. Seorrendole si n o r a u n certo aeeordo nei p r i n c i p a l i rilievi; il che 6 senza d u b b i o signifieativo. Se la tecnica risulters in seguito f o n d a m e n t a l m e n t e e r r a t a , non a v r e m o ehe d a r i p u d i a r e in m a s s a t u t t o il ]avoro eseguito fine a d oggi. L e i n d a g i n i p u r a m e n t e teeniehe, e sono ormai molte, h a n n o nel eornplesso messo in e v i d e n z a gli errori di v a l u t a z i o n e negli s t u d i sulle fosfatasi, nei quali si p u b ineorrere p e r la deftcienza della m e t o d o l o g i a in use (GoMom 1941, 1949 e 1950; WOLF, KABAT, I~EWMA~ 1943 e 1950; EMMEL 1946; DA~IELLI 1946; CAPPELI~ 1947; GOTTSCHALK 1949 ; STAFFORD e ATKINSOI~- 1948 ; LlSON 1948 ; SELIGMA~ e ~/[ANHEIMEI~ 1949; GLICK 1949; I~ABINOVlTCH, JUNQUEI~A, F A Y ~ 1949; I~ALP~ 1949; DOYLE, OMOTO, DOYLE 1950; NEUMANN 1952, eee.). Su questo l a t e del p r o b l e m a ritorneremo pifl avanti, p u r s o t t o l i n e a n d o fin d ' o r a s o p r a t t u t t o l ' i m p o r t a n z a della Iissazione e della inc]usione in paraffina. Senza limitazioni a c c o r d i a m o con GLICX (1949) nel ritenere assai difficile la identificazione istochimica delle varie fosfatasi e l ' o p p o r t u n i t a di considerarle, come in questo case, in g r u p p i , in base a criteri differenziali pifl sicuri, che sono di conseguenza cireoscritti. Da poco sono apparse, nei vari paesi, anche-riviste eritiehe sulla le~teratura che ci interessa, p e r cui r i t e n i a m o ormai superfluo a n a l i z z a r l a qui t u t t a , come era nostr~ intenzione d a principle. Questo lavoro di analisi bibliografica 1 s t a t e perb d a noi f a t t o u g u a l m e n t e con a e c u r a t e z z a ; seguendo la lettera~ura r i s u l t a ogni giorno pifl s o r p r e n d e n t e l ' i n t e r e s s a m e n t o m o n d i a l e ai p r o b l e m i biologici funzionali connessi alla d i m o s t r a z i o n e chimica ed istochimica di varie a t t i v i t s enzimatiche. Sono del 1941 le prime ricerche, ormai notissime, del Go~o~I ehe, nell'illustrare il sue metodo per la dimostrazione istochimica, della fosfatasi acida, fs note di averlo sperimentato in materiale assai abbondante, prelevato oltre che all'uomo (con biopsie e autopsie) anche al cane, al gopher, ~l gaffe, al tope, al ground-bog. Nel complesso l~ fosfatasi acida fu da h i messa in evidenza in organi nei quali ~ presente anche la fosfatasi alcalina; la prima sembrerebbe tuttavia di tasso inferiore e la reazione per lo pih non uniforme. L'enzimu si localizza o ael nucleo o n e l citoplasma o anche in tu~te due le patti della eellul~, sot~o forma di grossi granuli; fu visto dal Go~oRI nella milza, nel legato, rene, corpo luteo, nella pros~ata e surrenale. Non fu messo in evidenza invece nella parete dei vasi (dove si dimostrerebbe solo eccezionalmente) e nel sangue, negli organi dell'apparato respiratorio, nel pancreas, nella maggior parte dell'appar~to genitale femminile, nei museoli, nelle ossa decalcificate e nella pelle con i suoi annessi. Fra specie e specie animali investigate, I'A. riscontrb sensibili dif. ferenze di attivits e di localizzazione della fosfatasi acida. Pure nel 1941 il MAzIx affermava che helle uova di riccio di mare ultracentrifugate l~ parte nueleata si presenta pifl povera di f. acid~, in eonfronto alia parte anueleata. Non abbiamo pur~roppo letto la memoria del M_~z~ e la conosciamo solo attraverso la eitazione del BRAeH~T; eomunque, data la tecniea cosl infida, il reperto che ~ assai fine meriterebbe conferma. I lavori degli AA. citati nell'Indice bibliogra]ico posto alla fine, sono stati da noi presi tuffi in considerazione.

La reazione istoehimica per la fosfatasi aeida.

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Nel 1943 WOLF, K_a]~XTe N]~w~A~, essendosi esercitati con la metodologia di GoMol~I, pubblicarono una lore modificazione del metodo di GoMo~i stesso, ehe trovb favorevolo aceoglienza. Ne aceenniamo brevemente per l'importanza ehe ha avuto nello sviluppo della ricerea istochimica della f. acida. Essa eonsiste nella ineubazione delle fette a pH 4,7 (in luogo di pH 5) per un periodo non inferiore a 19 ore, ma prolungabile sine a 24 ore, mentre il GoMogI us6 generMmente un tempo di 6 ore e solo in cam eccezionMi, un tempo pih lunge, sebbene mM superiore a 15 ore. Gli AA. utilizzarono tale tecniea su materiale normMe non umano e umano non normMe, proveniente da autopsia; essenziMmente sostennero di pater eorffermare i risultati positivi di Go~oRL ma d'aver trovato f. acida anche in altri organi e tessuti. Tra questi, in primo piano pongono il sistema nervoso e eio6 le cellule nervose

(citoplasma e nueleo) con i lore prolungamenti (ma non nella guMna mielinica) ; la reazione s~rebbe pig manifesta negli elementi di maggior dimensione. Gli AA. avrebbero dimostrato una reazione nucleare nellg nevroglia e helle cellule ependimMi. Nei plessi eorioidei t'enzima, oltre ehe nei nuclei, sarebbe presente anche nel eitoplasma. WOI~F, KABAT, N~WMANriseontrarono la presenza dell'enzima inoltre nei eorpuseoli di Malpighi della milza, nell'epitelio di rivestimento delle vie biliari, neI pancreas (pih helle isole the negli aeini), nell'epitelio polmonare, nel mioeardio sebbene irregolarmente, nel tessuto museolare liseio sempre, nel surrene e con prevMenza nella midollare, nei nuclei del parenehima renMe ma anehe nel eitoplasma per quanta solo helle eellule di rivestimento di quMehe tratto del tubule urinifero, nella prostata (nel nueleo e nel eitoplasma dell'epitelio), nell'epitelio (nel nucleo e nel eigoplasma) dei tubuli confetti del testieolo ed in quello delle vie semiIfifere, nell'epitelio uterine (nel eitoplasma e nel nucleo) ma anche in altre parti dell'utero, dell'ovaio, nell'epitelio della tuba, nella tiroide (anehe nella colloide), nel lobe anteriors dell'ipofisi (negativa la parte rimanente della glandula), nella paratiroide (con modiea reazione). Nel complesso gIi AA. mettono dunque in evidenza una targa diff~mione dell'enzima noneh~ la reattivit~, eostante del nueleo degli elementi ehe sane sede di f. aeida. Di reeente (1950) gti stessi AA. tornarono sull'~rgomento, fornendo interessanti elementi di valutazione della metodologia, desunti da varie esperienze da lore eseguite saggiando diversi fissatori (acetone, formMina, Mcool),variando il pit ed i tempi delle diverse reazioni;elaborarono pure una eritiea della letteratura. Essi avrebbero patuto eonfermare ehe il pI-I optimum a 4,7 e che con un pit anehe solo ]eggermente superiore si determinano effetti di banMe colorazione dei tessuti da parte del piombo, ehe maseherano o alterano quella speeifiea dell'enzima. Un fatto degno di rilievo risulta inoltre ben ehiaro da questa lore indagine: la f. aeida 6 o,pparsa prewlentemente in sede nucleate. Un'altra interessante rieerea, soprattutto per noi, 6 quella della ){oocr tanto della f, alcalina (e l'abbiamo eonvenientemente rieordata nelle nostre preeedenti pubblieazioni) quanta di quella aeida, nell'embrione di pollo, dM I ~ all'VIII~ giorno di ineub~zione. La 3/Iooe ne feee oggetto di due memorie: la prima del 1943 limitata al midollo spinale, la seconda del I944 di tutte le parti dell'embrione. La f. aeida le 6 apparsa, nel eomplesso, di tasso inferiore a quello delFalcMina. La MooG depreea la grande aleatoriet~ del metodo, ma assieura ehe attivando l'enzima con aeido aseorbieo, ~ riuseita a rendere la reazione pih uniforme; eib non pertanto la teeniea non ebbe sueeesso in quMche embrione. DMla n o s t r a analisi bibliografiea possiamo t r a r r e aleune eonelusioni, senza d u b b i o di notevole interesse. La teeniea per la f. aeida, come gi& affermammo da prineipio, si presenta di pitl dfffieile applieazione di quella per la f. alealina ed ha a v u t o sine ad oggi impiego r e l a t i v a m e n t e searso. E ' s t a t e dimostrato, per opera s o p r a t t u t t o di NEW~AX, K a r A T e WOLF, m a anehe di molti altri (DEANE e DEI~PSEg, A]3OLINS, e ABOLINS eee. eee.) quale influenza esereitino le variazioni del p H della miseela di ineubazione nel d e t e r m i n a r e artificiali spostam e n t i del precipitate di solfuro di piombo, per eui esso annerisee patti, sopratt u t t o cellulari, ehe n o n possiedono inveee t'enzim~ o lo possiedono i n m i n i m a q u a n t i t K Sembrerebbe ehe, m e n t r e con p H t r a 4 a 6 la f. aeida appare loealizz~ta s o l t a n t o nel nueleo (esperienza di ABoI~I~s e ABOLINS helle eellule dell'adenoipofisi), con p H superiori questa loealizzazione seompare quasi eompletamente. I1

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F. Rossi, G. PESClgTTO e E. REALE:

p H optimum 6 stato determinato in 4,7 da NEWMAN,KABAT e WOLF nel 1950 e questo reperto ebbe molteplici eonferme. Non altrettanto rigorosamente impegnativa sembrerebbe la tecnica per la fissazione, nei riguardi sia della scelta del fissatore sia della durata o addirittura nell'evitarla. Come fissatori iafatti diedero buoni risultati tanto la formalina al 20% (SMITH e LUTTIIEL 1947; SMITH 1948), anche salata (secondo EMM]~L), quanto l'acetone puro ed anche l'alcoo]. Perb recentemente NEWMAn, KARAT e WOLF avrebbero stabflito che ]a formalina distrugge le due fosfatasi alcalina ed acids, e ehe l'alcool a 95 ~ inattiva quells acids. Dovremmo quindi pratieare ta fissazione col solo acetone. Per il tempo furono registrati limiti utili di una eerta ampiezza, tra 15 minuti (per esempio nel caso di colture) e 48 ore ed anehe di pifl. Le indagini istoehimiehe su materiale non fissato (NoBAt~ e PAFF) sono ancora all'inizio. Esse richiederebbero l' apparecehiatura Jreezing drying, purtroppo assai costosa, per ridurre maggiormente quegli artefatti da fissazione su cui s i appunta la critics delle attuali rieerche istochimiehe. Le eonclusioni di NOBAK e PAFF sui fibroblasti di qualsiasi provenienza ehe non presenterebbero l'enzima nel nueleo tanto in materiale fissato quanto in quello non fissato, contrastano con quelle di Ju~QvEi~a che nei fibroblasti fissati (pit 4,5) avrebbe riscontrato, inveee, una 10calizzazione prevalentemente nucleate. Senza dubbio non @soltanto nella fissazione the si debbono rieercare le cause di reperti discordanti. Diversi fattori possono influire pih o meno sui risultati della teenica di GoMoaI (per esempio la durata del tempo di ineubazione e soprattutto il passaggio attraverso ]a serie degli aleoli per giungere Ml'aequa distfllata, prima di porte le fette ad incubate) e varie indagini sono state eseguite proprio per seoprire gli artefatti e ehiarirne le cause. Giustamente si dice the quasi ogni passo della reazione a eatena si accompagna ad una perdita di attivits enzimatiea (N~vMA~). I reperti di NOBAK e PaFF, ehe dimostrerebbero nei fibroblasti e soltanto in questi, una loealizzazione delia I. acida differente da quells riseontrata in molti altri tipi eellulari, non sono faeilmente spiegabili. Ulteriori studi-(GoMoRI 1950) avrebbero messo in rilievo anehe l'importanza della eoncentrazione del tampone nel substrato. Se il eonfronto tra reperti istoehimiei e quelli puramente ehimici (su omogenati) g di utilits esso laseia tuttavia un grande margine di congetture e non pub essere quindi risolutivo se non per interi organi o abbozzi di organi e, anehe per questi, con opportune riserve. Ci riferiamo, ad esempio, alle ricerehe di HEI~ZE~ sugli effetti della resezione dello seiatico, eseguite su sezioni mierotomiche e su omogenati, da eui risulterebbe un ben maggiore eontenuto enzimatico in vitro. La letteratura riporta diversi reperti analoghi anche per altri enzimi; essi lurono del resto eonvenientemente se non sufficientemente, analizzati e discussi g non @il easo di ritornarei sopra. Per queste indagini presenta infatti suffieiente interesse un raffronto dei dati ehe si possono rieavare analizzando con la stessa procedura tecnica, le variazioni del tasso enzimatieo dei singoli abbozzi durante l'ontogenesi. E' senza dubbio importante sapere che il tasso di f. acids di u n troneo nervoso, mentre neUe sezioni mierotomiehe appare modesto, 6 invece alto nell'omogenato (HEIN= z ~ ) ; ma agli effetti della rieerea speclfiea potrebbe essere anehe sufficiente stabilire le varlazioni del tasso e nei due moneoni nervosi, Wossimale e distale, e nel tempo. E ' questo concerto che desideriamo sottolineare in quanto su di esso sono state impostate le nostre indagini.

La re~zione istoehimiea per Ia fosfatasi acida.

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Ci sembra fuori di diseussione ehe dovremo per ora non insistere nel rieereare loealizzazioni detl'enzima troppo minute, per esempio in parti della eellula come nueleolo, eondrioma, apparato retieolare interno, membrane, eutieola, orletti, eee., per la eomprovata insuffieienza della metodologia a disposizione. Risulterebbe eomunque abbastanza aetertato ehe il nueleo di tessuti ed organi, sia embrionari sia adulti, 6 sede di notevole quantit~ di f. aeida, qualora si lavori ton 10~ opportuno. Non g eseluso ehe esistano due diverse f. aeide, una nueleare e l'altra eitoplasmatiea (WoLf e Coll. 1943; WACHSTEIX 1944; MO~TAGXA e NO~AK 1946 e 1948; S~IT~ 1948; S~.LmMA_~ e MA~mME~ 1949). Per quanto le indagini sloerimentali sul significato della f. aeida non abbiano approdato, sino ad oggi almeno, a risultati soddisfaeenti, non avremmo diffieolts ad ammettere un diverso metabolismo enzimatico tra nuclei di materiale embrionario e in rigenerazione e nuclei di materiMe adulto. I dati della Mooa noneh6 di StrLxIx e GAlaD~Et~ eonforterebbero questa nostra induzione the non trova inveee altrettanto eonforto in quelli di J~ZNqTZEIRA. Sembra emergere dalla letteratura ehe l'attivitg e la diffusione della f. aeida siano alquanto inferiori a quelle della f. aleMina. Sembrerebbe inoltre ehe la loeMizzazione nei diversi organi dei due enzimi non sia sempre esattamente la stessa; ei riferiamo soprattutto al sistema nervoso. Una eerta, non sistematica divergenza di reperti per le singole fosfatasi sarebbe stata messa in rilievo tra specie e specie animale. Pur lamentando ]a povertg delle nostre cognizioni sull'attivitg della f. aeida nei tessuti e negli organi animali ed in ispeeie per quelli embrionali e fetali, dobbiamo rieonoseere ehe qualehe lute sembra venire da indagini sperimentali, per eui da alcuni eompetenti 6 messa in rapporto con la situazione ormonita (SotrLAIRAe e Coll., per esemloio), con la seerezione delle proteine (B~AD~IELD 1950), con la secrezione di determinate glandole apotrine (MOSTAGSA e PARKS, 1948), col metabolismo dell'ae, nueleieo (WACgSTEI~ 1944). Va fatta menzione anehe di quelle indagini, quasi eselusivamente teeniehe, intese a determinare nelle sezioni istologiehe e con rigore in via diretta ed in via indiretta il tasso enzimatieo. Sono indagini eseguite con teeniehe diverse (GoTTSCHALK 1947; G o , o r e 1950; DOYLE 1948, 1950, 1951; DOYLE OS~OTO e DOYLE 1950) e con diversi intenti, applieate per lo pifl nello studio della f. aleatina, e ehe nel eomplesso per6 non hanno ancora raggiunto risultati soddisfatenti. Tuttavia esse sembrano eonfermare i rilievi ehe con diverso proeedimento sono stati fatti sulla notevole perdita di attivit~ enzimatiea e soprattutto di quella della f. aeida, eonseguente alle manipolazioni teeniehe. Per quanto eoneerne l'attivit~ della f. aeida durante lo ~viluppo p~enatale, le rieerehe sino ad oggi, sono state effettivamente assai searse. Si pub anzi affermare the soltanto quel!e della Mooc negli Uecelli hanno avuto svolgimento organico, in quanto eoneernono un intero e ben definito periodo dell'ontogenesi (dal I ~ a l l ' V I I I ~ giorno di ineubazione), mentre altri AA. si limitarono allo studio o di un solo stadio e assai preeoce (MAZIA 1941; EL~MA~ e C O ~ A V E I ~ 1947), oppure di un solo abbozzo ( L ~ D E M ~ 1949; JU~q~rE~A 1951; BA~OX e MOPPET, 1951). Nell'embrione di pollo l'attivits della L aeida inizia, secondo la MooG precocemente .sebbene con tasso modesto. Essa la dimostrb nella blastula non incubata gis al I 0 giorno. Del resto anche E ~ F $ ~ r e C o P ~ v ~ a (1947) trovarono la f. a.eida nella blastula di un anfiMo

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F. Rossi, G. PxSe~TWO e E. REALE:

localizzata al polo vegetative. M a a l I I ~ e I I I ~ giorno di incubazione l'enzima ~ presente in tutti i tessuti embrionari indifferenziati del pollo e si concentra nell'abbozzo della notoeorda o del tube neurale. ])el resto la morfogenesi e la differenziazione del nevrasse si accompagnano ad un metabolismo enzimatico alto e quindi significativo (Mooo). Interessante appare il rilievo della Mooo ehe l'enzima si loealizza nei neuroni motori ma anche in quelli pih grandi dei gangli spinali primitivi. BARRON e I~OTTET (1951) eonfermarono il reperto anehe con indagini sperimentali eseguite pure nell'embrione di pollo (da] IV ~ al XV ~ giorno), da eui risulterebbe inoltre che l'attivitfl enzimatica propria dei neuroni del corno anteriore ~ siouramente in relazione con la lore differenziazione. Del resto, anche nell'embrione di Ambliostoma punctatum la f. acida fu trovata da ELrT~A~ e C O P ~ v E I ~ nella porte ventrale del tube neura]e. Mentre il nucleo dei neuroni motori lion sarebbe reattivo, lo ~ invece, ed in mode uniforme gi& al I I ~ e I I I ~ giorno, quello di tutti gli altri elementi embrionali (Mooo 1943). Questo reperto, unitamente all'altro di localizzazioni circoscritte e poco colorate della f. aeida nel tessuto nervoso delle vescicole encefaliohe, che successivamente si differenziano, non sono faeilmente spiegabili. Va considerate perb the dal IV ~ all'VIII 0 giorno il tasso enzimatico dello encefalo diminuisce progressivamente e la f. acida seompare alla fine quasi del tutto. Come ~ sta~o visto da noi per la f. alcalina (1951) cosl si verificherebbe, secondo laMooG, anche per quella acida la eomparsa di attivit& euzimatica nel mesenchima indifferenziato, solo quando esso si addensa per entrare a far parte degli abbozzi degli organi. Tra gli abbozzi dell'embrione di pollo pih ricehi di enzima la MooG elenca il earpo diWoL~F, il legato, la tiroide, l'endoderma dello stomaeo e det proventriglio, il tenue, la gonade, ]'allantoide. Mentre i glomeruli del mesonefro e del metanefro con la capsula del Bow~A~ sono moderatamente colorati, la reazione b intensa a earico dell'epitelio del tubule nrinifero. Scarsa o ilulla l'attivits dell'endoderma del grosso intestine e del retto, quella del polmone, dell'uretere, del cuore e dello stesso apparato vaseolare (ivi compresi i sinusoidi del legato) noneh~ della milza. L'epitelio buecale sarebbe negative; leggermente reattivo e solo al IV ~ giorno, il mesenchima addensato della regione branchiale; alquanto colorato ~ l'epitelio del faringe, dell'abbozzo laringo-traeheale, dell'esofago. Altamente reattiva le ~ apparsa ta tiroide come pure l'epitelio e le glandule del primo e secondo stomaeo, quello del tenue specie all'VIII ~ giorno. La MooG estese ulteriormente le sue esperienze, associandosi anehe a ~TEINBACI%ricercandole variazioni del tasso della f. acida (oltre che di quella alcalina) in omogenati di embrione di pollo dal VII ~ al X I I ~ giorno di ineubazione. Gli AA. scelsero questo memento dello sviluppo in quanto le preeedenti indagini istoehimiehe avevano rilevato c h e l a loealizzazione enzimatica delle due fosfomonoesterasi, alcalina ed acida, si presenta ben definita dope il VII ~ giorno. L'applieazione ai tessuti di metodi assai fini di dosaggio, che avevano avuto esclusivo impiego in biochimica, sugli omogenati, delinea un nuovo orientamento delle indagini istoehimiche sull'attivits degli enzimi. I1 tentative di MooG e STEI~BACJ~, per la verits non potrebbe essere considerate, a stretto rigore, di ordine istochimieo. I1 dosaggio fu da lore effettuato tuttavia, su ben definiti granuli citoplasmatici isolati con centrifugazione frazionata, applieando il procedimento micro-chimico (micro-Kjeldahl) di LI~D~:ST~61u-LA~G e HOLTEa det Carlsberg-Laboratorium, in rapporto ai #gm di feno]o liberate per mgN in un determinate periodo. I1 punto di partenza 6 state il reperto che i granuli eitoplasmatici insolubili, ehe si ottengono mediante centrifugazione frazionata dello embrione di pollo, sono portatori di un enzima, l'adenilpiro/os/atasi. Per quanto coneerne la f. acida sembrerebbe ehe in quei granuli (i granuli pih grandi, quelli della prima centrifugazione) essa raggiunga il pih alto Lasso al X ~ giorno. I r e p e r t i della M o o G (1944), r e l a t i v i a l l ' a p p a r a t o u r i n a r i o d e l l ' e m b r i o n e di pollo, f u r o n o c o n f e r m a t i d a JIT~QuEII~A (1951) ehe li c o m p l e t 6 p e r q u a n t o corn c e r n e il p e r i o d o s u c c e s s i v e dello s v i l u p p o . L e r i c e r c h e di LINDEMANN (1949) SU o m o g e n a t i di r e t i n a del pollo n o n possono, s e n z a d u b b i o , essere f a e i l m e n t e m e s s e a r a f f r o n t o con q n e l l e della M o o ~ p e r c h 6 s a p p i a m o come, in g e n e r e , le r i e e r e h e i s t o e h i m i e h e n o n si a c e o r d i n o b e n e con q u e l l e b i o e h i m i e h e . C o m u n q n e p a r r e b b e ehe al X I I ~ g i o r n o dello s v i l u p p o

La reazione istochimica per la fosfatasi aeida.

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e m b r i o n a r i o si r i d e s t i u n ' a t , t i v i t s e n z i m a t i c a in q u e s t a p a r t e d e l l ' a b b o z z o dell ' o c c h i o che ~ di origine eerebrMe, e t h e p o i essa a u m e n t i sino al X I X ~ giorno, a t t i v i t ~ ehe s e c o n d o la M o o G e r a v e n u t a a cessare nel p r i m o p e r i o d o dello s v i l u p p o (dal V I ~ a l l ' V I I I ~ giorno). C o m u n q u e al V I I ~ g i o r n o dello s v i l u p p o del pollo, la l o c M i z z a z i o n e della f. acida, c o m e p u r e q u e l l a della f. alcMina, p r e s e n t a n o u n e v i d e n t e c a r a t t e r e f u n z i o n a l e . E ' u n f a t t o q u e s t o che o r m M p o s s i a m o r i t e n e r e a c q u i s i t o e sul q u M e n o n d o v r e b b e esserci pih d i s e u s s i o n e ; esso d e v e essere solo m e g l i o p r e c i s a t o . Per questo motivo vale la pena di rieordare qui anche le indagini della ZO~ZOLI (1951) che avrebbe riseontrato un aumento di attivit~ enzimatica nel legato del topo dM I I ~ al X X ~ giorno dopo la nascita; ma soprattutto quelle di SvL~I~ e G A R D ~ (1948) 1 e di J v ~ Q u ~ (1950). Questi AA., che esperimentarono su ~essnti differenti ma sempre tn~tavia in rigenerazione, mentre accordano nell'attribuire al nucleo il maggiore quantitativo di f. acida, divergono invece a proposito del tasso enzimatico ehe non muterebbe per JV)rQVEIXA, e si eleverebbe per SVLKI~ e GAI~DN~R, rispettivamente nell'epitelio di rivestimento delta coda di Bu]o marinus e nel legato di Ratto albino. Del resto questa divergenza non deve sorprenderci eccessivamente perchg diversi sono gli animali utilizzati nonch~ gli organi messi Mlo studio e diverse le condizioni dell'esperimento. Per cni viene a proposito la ei~azione delle ricerche di No~A~ e PAFF (1951) da cui risulterebbe un diverso eontegno della reazione per la L acida su ma~eriale fissato e non fissato nei riguardi di varie categoric di elementi tissurMi colgivati in vitro. ~ e n t r e Jtr~-Q~zEraA studib il contegno dell'enzima fosfatasico nei fibroblasti di code in rigenerazione, NOBAK e PAr~ (1951) lo studiarono in fibroblasti di coImegtivi escissi dM ratto adnlto, topo e ericeto nonchb da. tessuti prelevati ad embrione di polio al X V I I I ~ giorno e posti in cultura in vitro. Anche questi AA. utilizzarono la tecnica di Go51oRI con gli adattamenti di WOLF, KA~T e N~WN~Sr che conosciamo, sul materiale Iissato in acetone ed anche -- e cib 6 interessante -- su ma~eriMe non fissato e pos~o direttamente nella miscela

di inenbazione. Essi avrebbero visto che nei fibroblasti non fissa~i (di qualsiasi provenienza e con quMsivoglia tempo di incubazione compreso fra 2 e 72 ore) la f. acida ~ sempre presente e 1ocalizzata nel citoplasma. La presenza dell'enzima nel nucleo varierebbe invece a seconda della provenicnza dei fibroblasti, nonehb del tempo di incubazioi1e. Nei/ibrobla~ti /issati la reazione ~ apparsa loro in diretto rapporto con la durata della fissazione nonchb col tempo di incubazione, ma assM variabile per sede, vale a dire o nel nucleo o nel ci~oplasma. In nessuna Mtra cellu!a esaminata' dagli AA. (cpiteliMe, muscolare SIYLKIST e GAlagNER (1948) applicarono la teci1iea di Go~ro~ con le modificazioni di WOLF, K ~ X T , NEW)~A~ (praticai1do la fissazione in alcool a 80 o o in acetone, a Ireddo) sul legato di ratto albino e considerarono cellule I1ormMi e cellule di legato in rigenerazione. Essi affermano anzitutto la disuguale distribuzione dell'enzima nel parenchima epatico. Nelle cellnle epatiche I1ormMi la f. acida b loro apparsa comuaque pih cos~ante nel nucleo, dove localizzata per la massima parte I1ella cromatii1a e nei nucleoli; nel citoplasma l'enzima varierebbe invece assai di tasso da una cellula all'altra dello stesso fegato e da ailimMe ad animale. A differenza di quella aeida, la f. aleMina si troverebbe sopra~tutto nella membrana nucleare e negli stessi nucleoli. Nel legato in rigei1erazione dM I ~ al XV ~ giorno Essi riscoi1trarono una assai maggiore quantit~ della sola f. acida I1ucleare. TMi da~i dimostrerebbero, secondo gli AA., l'importanza dei due enzimi nel metabolismo delle nucleo-proteine. Si eollegano in eerto senso a queste indagini, quelle di JV~QUEIaA (1950) in~ese ad accertare eventuMi variazioni del tasso enzimatico delle fosfagasi alcalina ed acida tra la coda normale di girini di Bu/o marinus e quella in rigei1erazione dopo il Saglio. L'A. (che usb la teenica di G o g o ~ con fissazione in formolo al 10% a temperatura ambiente per 2 - - 4 ore ed incubazioi1e a 37 ~ a p z 4--5) non avrebbe perb riscoi1trato Meuna differenza, per quai1to riguarda i fibroblasti. L'enzima aeido, loealizzato soprattutto nel nucleo, non sembra interessato al processo rigenerativo della coda mentre lo ~ quello McMino. Deve esseresottolineato che I'A. evitb di inctudere le code in paraffina e quindi di tagliarle al microtomo; Egli le trasportb dal fissatore diretSamei1te nella miscela d'incubazione, previo lavaggio e le esaminb poi in toto.

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F. Ross~, G. P ~ s c ~ o

e E. R ~ E :

liscia, avventiziale, mastociti) la reazione differisce a seconda the si tratti di materiale fissato oppure no. Ricordiamo a questo proposito che RALP~ aveva gis comunicato nel 1949 alle LXII 0 Annual Sextion dell'Amer. Assoc. of Anat., di aver apprezzato nell'omento di eoniglio differenti reazioni a seconda della tecnica impiegata prima del passaggio nella miseela d'incubazione.' Egli si sarebbe eonvinto ehe si ottiene la rivelazione dell'enzima fosfatasico solo evitando la fissazione (congelando ed essiccando in aria) ; l'acetone e l'alcool portano a risultati negativi sullo stesso materiale. La stimolazione inoltre dell'omento, mediante sostanze estranee, determinerebbe la comparsa di nuove forme cellulari dotate di una attivits enzima~ic~, non precisata dall'Autore, I1 c a m p o d e l l ' a p p a r a t o nervoso 6 s t a t o i n v e s t i g a t o m o l t i s s i m o p e r q u a n t o r i g u a r d a l ' a t t i v i t ~ della f. acida, p e r cui si sono a c c u m u l a t i in pochi anni, specie a t t o r n o al 1947, v a r i e i n d a g i n i n o r m a l i e s p e r i m e n t a l i , concernenti t a n t o il nevrasse q u a n t o i n e r v i periferici. Ci l i m i t i a m o a segnalarle s e m p l i c e m e n t e in ordine cronologico in q u a n t o , t r o p p o minuziose nella i m p o s t a z i o n e sperimentale, n o n si possono riassumere in breve, e d a n c h e perch6 in genere esulano dallo scopo della n o s t r a i n d a g i n e : LASSEK e I-IA:RD 1945 e 1946; H ~ I N Z ~ 1947 ; BARTELI~]~Z e BENSLEY 1947; SMITH e LUT~R~LL 1947; LASSEK 1947; D ~ N u CA~~aM~u FOL~Y e S ~ R T H , 1948; S~IT~, 1948; SWanK e C ~ ~ Y ~ R , 1949; t t ~ , 1949; SI~I)~z~ e SC~An~E~ ~, 1949; TOLO~E e V E ~ , 1951; B~ozr e MOTT~T, 1951. Lo S~ITH (1948) d a solo e con L V T T ~ L L (1947) esperimentb, s e m b r a con buoni risultati, la f o r m a l i n a quale fissatore, p e f f o n d e n d o t a in soluzione al 20% nei vasi, o t t e n e n d o nolle sezioni al congelatore di p a r t i centrali e periferiche di t e s s u t o nervoso, la messa in e v i d e n z a della f. acida. I d a t i raccolti d a LASSEK e d HARD sulla localizzazione e sulle variazioni del tasso d e l l ' e n z i m a nel g a t t o subit0 d o p o la nascita, d a l I 0 al V I I ~ giorno, sono i n d u b b i a m e n t e p e r noi i pifi i n t e r e s s a n t i in q u a n t o d i m o s t r e r e b b e r o u n a relazione t r a fl processo di mielinizzazzione fisiologiea e i l tasso della f. a c i d a del nevrasse. Iqel complesso t u t t e queste ricerche m e t t o n o in luce u n a a t t i v i t ~ e n z i m a t i c a della f. a c i d a del t e s s u t o ne~voso, in p a r t i c o l a r e dei neuroni motori, a pifi alto tasso neg]i elementi di m a g g i o r s o m a e nel cilindrasse, che confermano q u i n d i i r i s u l t a t i o t t e n u t i d a WOLF, KABAT e ~qEW-M~N, riferiti in precedenza. Materiale e metodo. il materiale umano utilizzato per questa seeonda serie di indagini istochimiche, proviene, come quello che ha servito alle ricerche sulla fosfatasi a]calin~, dalla Clinica Ostetrica e Gineco]ogiea dell'Universits ]~u raccolto da uno di noi in condizioni di freschezza e subito posto in acetone anidro a 0% Esso comprende: 1 embrione di mm 9 CR 1 embrione di mm 36 C1% 1 embrione di ram 70 C1% 1 feto d i c m 36 CI-I I due primi embrioni furono fissati ed inclusi in paraffina in toto, le sezioni vennero racc01te in pih serie alternate, in modo da allestire preparati per la reazione di Go~o~I e per il controllo della reazione, nonch6 per comuni colorazioni di orientamento (ematossilina-eosina, Azan). Dell'embrione di mm 70 CI~ nonch6 de1 feto di cm 36 Ctt furono invece prelevati singoli organi ed anche di questi furono fatte sezioni in serie, con lo stesso procedimento usato per gli stadi pih precoei dello sviluppo. 1 Le ricerche di DE~z~r-B~owz~ e Coll., di SwAz~Ke CA~MEaMnYE~, di SI~I)EX e SCHA~E~ ci sono note attraverso il ]avoro di TOLOI~E e VENTR&.

La reazione istoehimiea per la fosfatasi aeida.

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La teeniea che abbiamo utilizzato per la dimostrazione della fosfatasi aeida 6 quella di GoMo~I (1941), con gli ad~ttamenti suggeriti da WOLF, KARAT e NEWIUA~ (1943) nonch6 dal LlSOST (1948). Si 6 tenuto eonto, inoltre, degli interessanti risultati della nostra analisi bibliografiea, soprattut~o per quanto riguarda le esperienze sulla durata della flssazione e dell'incubazione (NEw~Ax, KABAT, WOL~ 1950 e GONORI 1950). Ci riserviamo di eontroll~re i risultati di queste nostre ricerehe istoehimiehe con quelli ehe rileveremo in un seeondo tempo sul materiale embrionario e fetale non fissato. La nostra teenica comprende un breve passaggio (1 ora) in alcool assolu~o Ira il soggiorno in acetone e quello neeessario in benzolo. I1 passaggio in aleool assoluto, seeondo WOLF, KAraT e NEWman, inibirebbe la fosfatasi aeida ed anche il Llsox lo ha sconsigliato; d'altro canto questo passaggio non sarebbe necessario per il trasporto del materiale dall'acetone anidro in benzolo. I1 LlSo~ metre comunque in rilievo ehe WOLF, KABATe N~w~a~ si sono tuttavia serviti dell'aleool assoluto! Noi abbiamo limitato il soggiorno del materiale hell'Mcool assoluto ad una sola ora e riteniamo che eib non sia stato sufficiente a determinare l'inattiwzione rilevante dell'enzima. Del resto confermiamo anehe in questa oceasione che helle nostre indagini sulle variazioni del tasso degli enzimi durante I'ongogenesi deti'uomo, si tenuto eonto solo di valori di un eerto rilievo. Per l'esposizione dei risultati ei atterremo all'ordine seguito per le ricerehe sulla fosfatasi aleMina, eonsiderando eiascun apparato singolarmente durante il periodo dello sviluppo ehe abbiamo avuto in esame e ehe va dal 33/360 giorno al VII ~ mese. R i s u l t a t i dellc ricerche personali.

II canale alimentare e i suoi anne~si. L'embrione di mm 9 CI~ (giorni 33/36), raeeolto fortunatamente in perfette condizioni, ei consentl di iniziare questo studio d a uno stadio assai precoee delto sviluppo. L a fosfatasi acida 6 gi~ presente, m a non lungo t u t t o il eanale; l ' e n z i m a fu d a noi d i m o s t r a t o in corrispondenza della bocca, dell'intestino anteriore (faringe ed esofago) e nello stomaco. Nel r e s t a n t e intestino medio ed in t u t t o quello posteriore 6 assente. Questo p r i m o rilievo, p e r q u a n t o generieo, ci s e m b r a eomunque significativo s o p r a t t u t t o perch6 stabilisee l'attivit& e n z i m a t i c a della m a g g i o r p a r l e del s e g m e n t o ehe precede l ' a n s a ombelieale. U n rilievo analogo a v e v a m o fatto a p r o p o s i t o della ~osfatasi alealina. P u r non volendo eonferire eeeessivo valore ai r e p c r t i pifi m i n u t i per le ragioni a d d o t t e nel p a r a g r a f o preeedente, aleuni di essi m e r i t a n o di essere riferiti. Ci si p r e s e n t b l e g g e r m e n t e eolorito dalla reazione l'epitelio d e l l ' a b b o z z o della gngua ed u n p o ' d i pifi il m e s e n e h i m a d e l l ' a b b o z z o stesso. Nell'eso/ago (fig. 5) e, pih eaud a l m e n t e , hello stomaeo (fig. 1) l ' e n z i m a fu t r o v a t o in searsa quantit& m a diffuso u n i f o r m e m e n t e t a n t o nell'epitelio q u a n t o n e l l ' a b b o n d a n t e mesenehima. I n e o r r i s p o n d e n z a dello s t o m a e o la reazione si estende al mezogasb'io dorsal,e, che a questo s t a d i o h a f o r m a di spessa l a m i n a m e s e n c h i m a t i e a . Nel complesso la reazione di queste p a r t i 6 d e e i s a m e n t e nueleare; la s t r u t t u r a del nueleo si p r e s e n t a o v u n q u e ben d e l i n e a t a pereh6 la p r e e i p i t a z i o n e del solfuro di p i o m b o non avviene in f o r m a massieeia. L a m e m b r a n a a p p a r e quindi n e t t a m e n t e p r o f i l a t a come u n a sottile linea seura; il c o n t e n u t o di g r a n u l i scuri irregolari 6 diffuso nel e a r i o p l a s m a meno r e a t t i v o . U n raffronto, che s a r e b b e s t a t o interessante, p e r q u a n t o concerne la t e s t a , ei mane5 nello stadio sueeessivo; l ' e m b r i o n e di m m 36 CI~, fu raeeolto d e e a p i t a t o . Nell'eso/ago la reazione era p o s i t i v a sia nell'epitelio sia nella l a m i n a museolare, n e g a t i v a inveee nel m e s e n e h i m a sottoepiteliale condensato. L a fosfatasi a e i d a dell'epitelio era in sede n u c l e a t e ed il e i t o p l a s m a a p p a r v e quasi ineolore. Nel-

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F. RossI, G. P~Se~TTO e E. I~EALE:

l'abbozzo dello stomaco l'enzima ei risultb limitato ai nuclei epiteliali the la reazione annerisee (fig; 12). Quivi sembra assente, oltre che dal mesenehima sottoepiteliale anehe dal tessuto museolare in via di differenziazione. Nel duodeno il contegno delFenzima 6 uguale ~ quello riseontrato nello stomaco; non si aloprezza una localizzazione eutieolare. Nell'ansa ombelicale invece il mesenehima ~ assai eolorato; ma poi, procedendo oltre, nell'intestino tefminale, la fosfatasi aeida testa localizzata ai nuclei epiteliali, molto scud ed anehe, bench6 in tasso minimo, nella lamina museolare. Merita forse un eenno l'osservazione ehe abbiamo fatto a proposito delle appendiei villose della tonaca mncosa helle quali la reazione

Fig. 1. Du u n a sezione t r a s v e r s a di e m b r i o n e u m a u o d i m m 9 C R hi corrisponclenza dell'abbozzo deno s t o m a c o e di quello clel f e g a t o . V e r s o l'alto sono p a r z i a l m e n t e v i s i b i l i i due m e s o n e f r i . L a reazione p e r la f o s f a t a s i a e i d a 6 i n t e n s ~ Ilel l e g a t o e helle veseieole I n e s o n e f r i d i c h e ; ~ p o s i t i v a n e i n u c l e i dell'epitelio e dei m e s e n e h i m a dello s t o m a e o . L a r e a z i m l e 6 p u r e p o s i t i v a n e i n u c l e i dell'epitelio del eanale di WOLI~F. Niierofot.

interessava in modo assai vivo e netto i due terzi liberi ed era invece lieve hell'nitro terzo o basale (fig. 2). Lo studio di mm 70 CR non ci ha aeconsentito rilievi utilizzabfli che per quanto concerne il tratto suecessivo all'abbozzo dello stomaco; helle parti precedenti la reazione preselitava infatti earatteri di troppa irregolarits Perb nel feto di em 36 C t I l a parete dello stomaco, istologicamente ben diiferenziata, non present a r a differenze di contenuto enzimatico n6 per sede n6 per tasso rispetto all'embrione di mm 36 Ct~, se si fa eeeezione per gli abbozzi glandulari della tonaca mucosa, in forms di eordoni. Questi eordoni ci apparvero eomplessivamente bene eoloriti per una distribuzione del sale di piombo al nueleo e al eitoplasma deUe cellule epiteliali. Anehe oltre il V ~ mese il mesenchima gis formato non risulta sede di fosfatasi aeida; come negli stadi precedenti si eolora lievemente la tonaea museolare (nei nuclei). Differenziandosi ulteriormente l'intestino, gis alla X I I a settimana la reazione metre in evidenza i nuclei degli abbozzi glandulari del tenue, cotora sempre intensamente l'epitelio dei due terzi liberi dei villi mentre laseia pallida la parte rim~nente e cio6 del rivestimento della radiee e della superficie mueosa tra un villo e l'altro (fig. 3 e 10). Lo stesso stroma dei due terzi liberi del villo aloloare eolorato assai pill di quanto non lo sin quello del terzo basale e della tonaea prol0ria

La reazione istochimiea per la fosfatasi aoida.

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della mueosa. Nel rivestimento epiteliale del tenue si apprezzano ad ilatervalli pieeole zone ehiare ehe potrebbero eorrispondere ad elementi non bene differenziati della parete e pih preeisamente alle future eellule ealieiformi ehe al I I I ~ mese stanno appunto differenziandosi; m a i l fatto potrebbe anehe essere attribuito a fattori eontingenti e banali del proeedimento teenieo. Nell'ulteriore sviluppo dell'intestine terminale e della cloaca non si verifieano spostamenti n6 dei valori enzimatiei (in sense relative, s'intende) n6 della sede dell'enzima il quale, nell'em-

F~g. ~.

Fig.. 3.

F i g . 2. L a r e a z i o n e p e r Ia f. a e i d a 0 n e t t a m e n t e I o e a l i z z a t a n e i m t c l e i d e l l ' e p i t e l i o d e l l a m u e o s a i n t e stina,le. S e z i o n e d i a p p e n d i e e v i l l o s a d i u n e m b r i o n e u m a n o d i m m 36 CIR.. l~Iierofot. F i g . 3. L e g p t o e n d i e i v i l l o s e d e l l a m u e o s a d e l t e n u e a p p a i o n o m o l t o e o l o r a t e d a l l ~ r e a z i o n e p e r l a f. a,e i d a . E m b r i o n e u m a n o d i m m 70 C R . M i e r o f o t .

brione di mm 36 CR, appare loealizzato nel nueleo dell'epitelio e nella lamina museolare. I1/egato 6 un organo ehe si abbozza preeoeemente e si presenta presto ad alto tasso enzimatieo. Allo stadio di mm 9 CR esso spieea nel eorpo dell'embrione per il sue intense eolore (fig. 1). Tuttavia l'enzima non sembrerebbe distribuito con uniformits ; si apprezzano infatti isole di parenehima pifl ehiaro, tramezzo a qnello assai reattivo ehe ~ nel eomplesso pih abbondante. La reazione eolora molto il nueleo e meno il eitoplasma dei eordoni epiteliali. Nello sviluppo ulteriore queste earatteristiehe sono eonservate. A mm 36 CR ~ possibile tuttavia distinguere un diverse tasso enzimatieo a seeonda degli elementi, e eiog assai p!~ alto helle eellnle mesoblastiehe a nuclei pieeoli, in eonfronto a quello delle eellule epatiehe e dei eordoni le quali sono pifl grosse e i nuclei appaiono meno seuri (fig. 12). La parete degli spazi vaseolari 6 assolutamente ineolore; qualehe nueleo degli endoteli capillari mostra tuttavia una leggera reazione positiva. L'abbozzo del pancreas entoclermico non 6 apprezzabile allo stadio di mm 9 CR; la sede nella quale dovr~ eomparire non offre reazione di sorta. A m m 36 CI~

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F. Rossi, G. P~SCET~O e E. I~XL~:

l'abbozzo presenta una netta ]oealizzazione enzimatica nel componenLe epitelia]e dei tubuli primitivi; il mesenchima cireostante non 6 reattivo (fig. 4). Lo stesso condotto escretore del pancreas ventrale 6 sede di attivits enzimatica, reperibile nei nuclei. Non abbiamo potuto seguire purtroppo i] contegno dell'enzima nell'ulteriore sviluppo della glandula.

F i g . 4. N e l l ' a b b o z z o d e l p a n c r e a s allo s t a d i o d i m m 36 C R I a r c a z i o n e p e r Ia f. a e i d a 6 l o e a l i z z a t a n e l c o m p o nente epitelia]e dei tubu]i primitivi. Sczione trasversa.

Merita un particolare riferimento l'interessante osservazione che abbiamo fatta a m m 9 CR, nel territorio degli archi branchiali, dell'intestino anteriore. Tanto l'epitelio endodermico quanto il mesenchima delle tasche sono assai reat-

tivi.

Questo mesenchima spicca

Microfot.

appunto, per la sua colorazione, da quello vicino, per esempio dal mesenchima cireostante rabbozzo epiteliale dell'esofago e della trachea the 6 incolore. Gis abbiamo riferito sulla reattivit~ positiva degli abbozzi della lingua derivati pure dall'intestino branchiale.

Le cavith nasali e l' apparecchio ~olmonare. Seguendo a tappe assai distanziate ]o svi]uppo delle cavit~ nasali e della boeea si sono potuti cogliere degli aspe~ti della reazione enzimatica in corrispondenza di questi abbozzi. A m m 9 CI~ i nuclei dell'epite]io delle ]ossette F i g . 5. D a u n a s e z i o n e t r a s v e r s a fli e m b r l o n e m ~ a n o eli m m 9 C R , ol]attive sono leggerehe ha eolpito i saechetti polmonari, e tra essi l'esofago, noneh~ i due m e s o n e ~ r t v i s i b i l i i n a l t o . L a r e a z i o n e p e r la f. a c i d a e o l o r a l ' e p i t e l i o mente colorati, come d e i s a e e h e t t i , n o n e h ~ quello d e l c o n d o t t o e s o f a g e o . I n a l t o e a quelli dell'epitelio dello s i n i s t r a s i a p p r e z z a 1~ c r e s t a g e n i t a l e p e r ] a s u a e o l o r a z i o n e s e u r a . I nuclei del mesenchima iormativo appaiono pure atquunto reattivi, stomodeo e del faringe. Mierofot. La trachea primitiva (ram 9 CR), rappresentata da un sot~i]e abbozzo epiteliale cavo, offre una reazione positiva, ma poco accentuata. I1 mesenchima circostante che coinvo]ge anche fl canale epiteliale esofageo, ~ reattivo; 4 un mesenchima ormai formato e cib spiega forse il fatto per cui nel vicino mesenchima non formato non si svolge attivit~ enzimatica.

La reazione istochimica per la fosfatasi acida.

49

I due sacchetti polmonari entodermici (fig. 5) che si presentano ormai riuniti in una massa mesodermica peduncolata presentano un contenuto enzimatico particolarmente abbondante nell'epitelio ma diffuso anche a tutti i nuclei del mesenchima. I1 processo morfogenetico e di differenziazione dell'apparecchio polmonare appare connesso in modo evidente alla presenza ddl'enzima, soprattutto per quanto concerne le ramificazioni epiteliali dei bronchi. I1 quadro istochimico si precisa maggiormente in seguito e cio6 a m m

70 CR e a cm 36 CH.

I1 mesenchima, lg dove appare interessato dal proeesso di organogenesi (come, per esempio, attorno alle ramificazioni epiteliali maggiori) diviene molto reattivo: Con le abituali riserve comunichiamo alcuni rilievi pig fini. Dai rami pig grossi andando verso i pig sottili la fosfatasi aeida si riduce in modo sempre pig netto al solo nucleo dell'epitelio. Soltanto n e i bronchi maggiori a pig file di cellule, gli alti elementi superfieiali di rivestimento del lume hanno colorato oltre al nucleo anche il citoplasma. Si tratta comunque di una reazione the non supera la media intensitg. La cartilagine dei bronchi maggiori 6 incolore; solo una

a

toni 70 CI~

abbiamo

sorpreso

Fig. 6. L a rcazione p e r la f. a c i d a 6 p o s i t i v a nell'-

leggera reazione del pericondrio epitelio del bronco e a n c h e nel pericondrio delle sue cartilagini. Sezione di bronco di embrione umano (fig. 6). Un modesto contenuto enzidi m m 70 01%. Microfot. matico sembra essere presente nel corredo muscolare in via di differenziazione dei bronchi. La parete dei vasi sanguiferi polmonari non offre reazione positiva in nessun momento ontogenetico eonsiderato. Delle glandule provenienti dall'intestino branchiale solo il timo ci ha permesso rilicvi suffieientemente attendibili. A m m 36 CR gli abbozzi sono seoloriti; nel feto dicm 36 CH la reazione aploarve invece positiva e diffusa a tutti i nuclei pifi per6 nella parte centrale che non nella periferica del loarenchima. Gli stessi, corl)uscoli di HASSAL mostrano un tasso enzimatico alto bench6 l'enzima non appaia uniformemente distribuito; mentre i nuclei sono tutti eolorati, la reazione interessa il citoplasma solo di alcune delle cellule pig grosse. Nel complesso questi corpuscoli formano delle vive macchie di colore helle sezioni degli abbozzi t i m i d per cui dobbiamo ammettere cite la reazione di questi organuli 6 assai signfficativa. A pparecchio urinario. L'urinario 6 uno degli apparecchi ehe si 6 10otuto meglio seguire nella sua complessa evoluzione. Sin dallo stadio di m m 9 Cg, quando nell'embrione sono Zeitsehr. f. Anat. n. Entwicklungsgeseh. :Bd. 117.

4

50

F . R o s s I , G. PESCETTO e E . R E A L E :

presenti tanto il mesonefro quanto il metaneffo, questi due abbozzi presentano un'attivit~ fosfatasica ad alto tasso. I1 corpo di WOLFF occupa, a questo stadio, una zona assiale molto estesa; lo abbiamo seguito in direzione caudale a partire dai sacchetti polmonari. Le vescicole mesonefridiche ed i rispettivi canalicoli contorti mesonefridiei con i loro glomeruli sono ricchi di fosfatasi acida (fig, 1). L'epitelio del cana!icolo ci ~ sembrato pifl scuro del glomerulo con la sun capsula. Mentre nel vicino canale di WOLFF l'enzima ~ localizzato nettamente bench4 in modesta quantits nei nuclei (fig. 1), la reazione del mesonefro assai pifl intcnsa, ha carattere diffuso. Questa intensa attivit~ fosfatasica accompagna l'ulteriore evoluzione del mesonefro. A m m 36 C1%l'organo ingr~ndito ~ ancora assai reattivo.

Fig. 7. Vescicola m e s o n e f d d i c a e canalicolo f a c e n t e c a p e al c o n d o t t o di •VOLFF. E m b r i o n e u m a n o di m m 36 CR. II glemerulo arterioso a p p a r e m o l t o r e a t t i v o e eolorati p u r e seno i nuclei epiteliali di queste formazioni. 1Viierofot.

I1 precipitato nero di sale di piombo ci risultb particolarmente abbondante in corrispondenza dei glomeru]i capillari arteriosi (fig. 7). Iqei eanalicoli principal! soltanto i nuclei spiccano per l'alto tasso enzimatico, lo stesso rilievo abbiamo iatto pel canale di WOLFF al quale falmo capo i canalieoli. I vasi sanguiferi di ordine superiore a quello capillare offrono nu]la o debole reazione; negativo 6 il mesenchima che accoglie il canale di WOLFF. I1 metane/ro reperibile caudalmente al canale di WOLFF (mm 9 C1%), Subito ventralmente alla corda dorsalc, in forma di due tozze vesciche cave, presenta una reazione positiva tanto nell'alto strato epiteliale a pifl file di cellule quanto nel mesenchima formativo circostante, che contrasta con il mesenchima non impegnato nell'organogenesi del metanefro, mesenchima che appare invece quasi incoloro. La reazione ~ di uguale intensits nei due componcnti. L'ulteriore sviluppo del metanefro si accompagna ad attivits enzimatica notevolissima. A m m 36 Ctt questo abbozzo si presenta come una formazione molto scura benchd in modo non uniforme (fig. 13). Esaminandolo minutamente ci si accorge che nel blastcma renale l'enzima 4 localizzato nei glomeru]i arteriosi e nella capsula di BOWMA~ nonch6 nei primi tubuli epiteliali uriniferi (fig. 8); il mescnchima piuttosto abbondante, nel quale si svilupperanno i vari ordini di canali, d invece pallido. La parte del metanefro che deriva dal canale di WOLFF, e clod i canali

La reazione istoehimica per la fosfatasi aeida.

5~

eollettori e papillari nonch6 i ealiei, appare a bassissimo tasso enzimatico. Alla X I I a settimana (ram 70 CR) la ripartizione della fosfatasi acida si 6 ancora meglio preeisata. I vasellini glomerulari non sono pih anneriti come prima; la reazione appare era n e t t a m e n t e epiteliale. Anehe i nuclei dell'epitelio delia eapsula sono molto bene evidenti. Nei canalieoli contorti l'attivitg enzimatiea d assai pii~ alta nel I ~ tratto, t a n t o the il precipitate ~ diffuse a t u t t a la eellula, interessando nucleo, eitoplasma e membrana. Nel segmento successive l'enzima ~ limitato M solo nueleo.

Vie di eserezione della glandula renale. I1 canale di WoLFg non ha pratieamente contenuto enzimatico allo stadio di m m 9 CR. Vi si apprezza una reazione nueleare dell'epitelio ed anehe, bench~

Fig. 8. Sezione del metanefro di embrione umano di mm 36 CR. Un glomerulo e l'epitelio del tubule urinifero adiacente appaiono anneriti dalla reazione. Microfot.

minore, del mesenehima circostante allo stadio di mm 36 CR. I due canali si seguono era bene helle sezioni in serie, specie quando si trovano impegnati nel mesenehima della piega urogenitale, aceompagnati dai eondot~..i del ]V[i~LLEN. Essi sboeeano nella veseiea orinaria ehe si innalza al d a v a n t i della piega urogeni~ale ed il eui epitelio, gi~ a pifl file di eellule, ha nuclei sferiei reattivi. U n pb reattivi sono anche i nuclei del mesenehima ehe entra nell'abbozzo noneh~ quelli delle fibroeellule dello strato esterno museolare ehe st~ differenziandosi. Gli ureteri sia nell'embrione di m m 36 CR sia nell'ulteriore sviluppo, presentano un tasso enzimatieo traseurabile, da riferire eomunque al nueleo delle eellule epiteliali. L a parete del eanale u~ogenitale, e del ~eno urogenitale (ram 36 CR), aeeolta in una massa di mesenehima, oi sono apparse alquanto pih reattive; i nuclei dello stesso mesenehima sono colorati.

L'wretra, ehe abbiamo esaminato solo nell'embrione di m m 36 CR, mostra una reazione eireoseritta ai nuclei dell'epitelio e modesta ; tale reazione non g differente eomunque da quella dell'epidermide con eui tale epitelio si continua attraverso il meato (fig. 9). 4:*

52

F . I~OSSI, G . PESCETTO e E . t ~ A L E :

A pparecchio genitale. La ricerca 6 iniziata fortuitamente dal primo abbozzo della gonads, vale a dire della eresta genitals che si solleva dall'epi~elio celomatico, medialmente al mesonefro, proprio verso il X X X 0 giorno dello sviluppo (fig. 5). L'area germinativa

Fig. 9. Sezione sagittale dei genitali esterni di un embrione umano di mm 36 CR. I nuclei del mesenehima formativo nonch@ quclli dell'epitelio dell'uretra appaiono anneriti dalla reazione per la f. acida. Mierofot.

Fig. 10. Abbozzo della g o n a d s congiunto, dMla piega genitals, al mesonefro. 2~ sinistra la sezione dell'intestino. L a reazione @ n e t t a m e n t e localizzata nell'epitelio intestinale; i nuclei della g o n a d s indifferenziata sono p u r e assal r e a t t i v i . E m b r i o n e u m a n o di m m 36 CB. Nicrofot.

si palesa, oltre the istologicamente, anche attraverso la reazione positiva per la fosfatasi acida dei nuclei dells sue cellule. Ma l'attivitg enzimatica 6 eonclamata nell'abbozzo della gonade (eminenza genitals) allo stadio di m m 36 CR. Si eolorano i nuclei the essendo perb numerosi e ravvicinati, conferiseono all'insieme una forte tonalits di colors. Anehe i nuclei dell'epitelio celomatieo, allineati alla superfieie, sono molto seuri. Dal raffronto col vicino mesonefro risulta the i due abbozzi presentano una reazione tintoriale di quasi uguale intensit~ (fig. I0).

Lu reazione istochimica per la fosfatasi acida.

53

N o n si apprezzano differenze tra i nuclei dei diversi tipi cellulari rappresentati a questo stadio nella gonade. La piega genitale, i eondotti del MiiLLEI~ ehe vi sono contenuti, il cordone genitale, il eanale, derivato dalla fusione dei condotti del MOLLEI~, the si apre nel seno urogenitale, sono tugte formazioni the abbiamo apprezzato solo nell'embrione di m m 36 CR; l'enzima 6 loresenge nei nuclei dell'epitelio loro in quantit~ a ssai modesta. L'ovaia ~ stata studiata nel feto d i c m 36 CH. Ess~ ha a questo stadio un eontenugo di f. aeida diffuso a t u t t i i nuclei del mesenchima noneh6 a quelli dell'epitelio celomatico. Nei follicoli oofori primari si colorano ]eggermente i nuclei delle eelhle follicolari nonch6 quelle dell'oogonio, Nello stesso feto abbiamo

Fig. II. L'abbozzo del cuore allo stadio di ~Im 70,r appare too]to reattivo. La localizzazione nel irliocardio 4 essenzialmente nucleate. Sezione condott,a in corrispondenza di nn ventrieolo di eui evidente I~ eavit~ anfrattuosa per la sejMment~zione del miocardio. ~Iicrofot.

esaminato la tuba uterina derivata daI condotto del MiJLLER; esso~ mostra reattivits modesta m a diffusa nei nuclei :t~ngo del mesenehima quanto dell'epitelio interno. II citoplasma delle eellule epiteliali ci 6 apparso solo lievemente colorato.

A pl~arecchio vascolare. Cuore. L ' a b b o z z o del euore allo stadio di m m 9 C1% ~ ]eggerissimamente colorato, molto meno di t u t t i gli altri abbozzi confinanti. La reazione ~ nucleate e poieh6 gli elementi del mantello mio-epieardico non sono stipati, ne risulta un quadro istologico pallidissimo. I vasi maggiori non si eolorano affatto. A m m 70 C1% e a cm 36 CH i nuclei del mioeardio ei sono apparsi molto reattivi (fig. 11). Tra gli stessi vasi ve ne sono aleuni il cui mesenchima formativo ha nuclei molto eolorati, altri invece eonservano paregi del gut,to w i v e di enzima. Abbiamo esaminato tango quelli maggiori ]iberi (aorta e suoi rami, vv. ombelieali, loolmonari, eee.) q u a n t o i vasi parenehimali, per esemloio del Iegato, loanereas, polmone, rene, ece. Per stadi intermedi non abbiamo reloerti tali da eonsentire un preeiso giudizio sulla reazione. Possiamo t u t t a v i a c o n c h d e r e ehe lo sviluppo dell'appareechio vaseolare non 6 aeeompagnato da attivitk dell'enzinla Iosfagasieo aeido the limigatamente al euore, nel eui abbozzo esso inizia preeoeemente.

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F . ROSSI, G. I)ESCETTO e E . ]:~EALE:

II sangue e la milza. A m m 9 CR gli elementi del sangue non sono reattivi; ma lo sono invece allo stadio di mm 36 CR. La fosfatasi acida @soprattutto localizzata nel loro caratteristico nucleo sferico. A m m 70 CR gli elementi nucleati sono pifl rari e la reazione del sangue non 6 pifi positiva. Abbiamo potuto esaminare l'abbozzo della milza solo allo stadio di mm 36 CR ; esso non dava reazione positiva (fig. 12). L' apparecchio scheletrico e quelto muscolare.

Fig. 12, L a reazione p e r ls f. a e i d a colors intensam e n t e l'abbozzo dells glsn41fla s u r r e n a l e e quello del legato. Nella sezione si a p p r e z z a inoltre il piccolo abbozzo della m i l z a n o n r e a t t i v o e quello parziale dello s t o m a e o , la cui m u c o s a d e l i m i t s c o m e u n orlo scuro la cavitY. E m b r i o n e u m a n o di m m 36 CR, Microfot.

La ricerca delia f. acida nell'apparecchio scheletrico ed in particolare in quello assile, il primo a comparire durante l'interessante periodo della condrificazione degli abbozzi mesodermici, non ci h a offerto larga messe di osservazioni. Abbiamo accertato che il mesenchima formativo dello scheletro, tanto del tronco quanto degli arti, allo stadio di mm 9 CI~ 6 sede di f. aeida. I nuclei addensati si colorano assai, eosl da conferire all'abbozzo in genere una earatteristica tinta seura. La corda dorsale, ehe si presenta a questo stadio come un eordone pieno fatto di eellule epiteliali, ei 6 apparsa brunastra, a diiferenza del mesenchilna eireostante quasi incolore. Questo mesenchima privo di iosfatasi acida sembra aneora addensarsi deI non resto attorno Ml'abbozzo epiteliale

della corda per costituire l'abbozzo membranoso della colonna vertebrale. Negli sclerotomi manea quindi qualunque segno di attivit~ enzimatica, mentre nei somiti, da eui in questo giovane embrione stanno differenziandosi i miotomi, invece presente la f. acida. I miotomi appaiono ben visibfli come segmenti mesodermici appiattiti e a]lineati lungo il corpo dell'embrione, t r a i l tubo neurale e la eorda dorsale da un lato e la superficie eutanea dall'altro. L'attivits enzimatiea negli abbozzi dello sche]etro ehe senza dubbio in fase preeoce dello sviluppo non 6 molto intensa eessa poi rapidamente. Allo stadio di into 36 CI~ il tasso della f. acida appare in genere ridottissimo; i nuclei della corteccia di blastema degli abbozzi cartflaginei dello scheletro degli arti assumono una leggerissima colorazione bruna. Nelle parti dello scheletro appendieolare, helle quali 6 in alto un processo di ossificazione (eondrale), si osserva un annerimento cite per6 si verifica anehe nei eontrolli. I n quanto a] tessuto muscolare striato i soli nuclei delle fibre sono reattivi.

L~ reazione istochimic~ 13er1~ fosfatasi ~eida.

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Non abbiamo esaminato ]?arti dello seheletro assile di feti pifi avanzati nello sviluppo; perb la nostra osservazione si 6 rivolta allo seheletro eondrale dei viseeri e eio6 a quetlo dell'aploareechio respiratorio, rilevando nel feto di em 36 CH la persistenza dell'enzima aeido nel l~erieondrio delle eartflagini.

Organi interrenali e/eocromici. Nella zona interl0osta alle loieghe mesonefritiehe o meglio t r a le ereste genitali e la radiee del mesentere dorsMe, nella quale si sta differenziando bilateralmente, allo stadio di m m 9 OR, l'abbozzo della glandula surrenale, non si a!gl0rezzano

F i g . 13. D a ulaa Sezione g r a s v e r s a l e de1 t r o ~ e o di a n e m b r i o u e u m a l t o di m m 36 CR. Si apprezzalao gli a b b o z z i dei m o t a n e f r i f r a cui 6 l ' a o r t a e i r c o n d a t a s t r e t t a m e n t e d a f o r m a z i o n i p a r a g a T N l i a r i v o l ~ m i n o s e e reattive I n alto, v i c i n o alia sezicne dell'aorta, due g a n g l i delia c a t e n u del s i m F a t i c o . I g l o m e r ~ ] i m e t a n e f r i d i o i s p i c c a u o Izer l ' i n t e n s a colorazicne. I a sezicne laa coll0itoiI lzaciuetto d i s i n i s t ~ a . Microfot.

elementi a reazione positiva per la f. acida da attribuire con certezza agli abbozzi di quest'organo. Non mancano tuttavia in questa zona elementi a nueleo nn po'pifl eolorato degli altri del mesenehima; essi tuttavia non sono ammassati. Nell'embrione di m m 36 CR le surrenali si presentano in forma di due abbozzi gig votuminosi ad Mto tasso enzimatico (fig. 12). Si distinguono assai bene, sis istologicamente sia istoehimieamente, due p a t t i dell'abbozzo una periferica ed una eentrale. La parte periferiea ~ rappresentata da uno strato di elementi pieeoli, a grosso nueleo, disposti in modo irregolare; tra essi si trovano nnmerosi vasi sanguiferi. La reazione per la f. aeida ~ positiva nei nuclei di eui eolora oltre ehe la membrana anehe il eontenuto. I1 eitoplasma inveee sembra ineoldro o debolmente eolorato. La parte eentrale 6 earatterizzata da elementi grandi per abbondante eitoplasma, disposti in trabeeole o cordoni e intrecciati e delimitanti larghi spazi ehiari. Tali elementi sono provvisti di f. acida tanto nel nueleo quanto nel eitoplasma. La reazione del loro nueleo 6 sensibilmente pih intensa di quella del nneleo degli elementi dello strato periferico. Nello stadio suceessivo (ram 70 CR) il tasso enzimatico d tuttora a,ltissimo nell'abbozzo della midollare, mentre nella parte periferiea (abbozzo eor~ieo-snrrenate) le earatteristiehe della reazione sono le stesse di quelle osservate nell'embrione meno sviluppato. Nella parte eentrale

56

F. Ross~, C. ~SCETTO e E. REA~ :

il tasso enzimatico sembrerebbe essersi anzi elevato; infatti reagisce positivamente anehe lo stroma reticolare che si 6 differenziato.. Nell'embrione di m m 36 CR, attorno all'aorta, si sono formate numerose raecolte di cel]ule che si possono facilmente distinguere in due categorie. Le une, pig vicine al contorno vertebra]e, hanno le stesse earatteristiche delle ccllule dei gangli della catena de] simpatico; sono addensate ed i loro nuclei presentano una reazione debolissima per la f. acida. Le altre, in genere poste in una situazione pifl ventrale rispetto alle precedenti, ed all'aorta stessa, sono formate di elementi a nuclei pift distanziati fra di loro, pifi grandi degli altri e in genere assai reattivi (fig. 13). Ci troviamo quindi di fronte, anche in questo caso, ad elementi differenziabili istologicamente ed istochimicamente. Con ogni verosimiglianza i primi sono simpatoblasti ed i secondi cromaffinoblasti. La distribuzione topografiea di questi due tipi di elementi non 6 ovunque cosl ordinata; anzi abbiamo visto ganglietti di simpatoblasti aderenti alla superficie di ammassi pifi voluminosi di cellule che. riteniamo eromaffinoblasti. L'intensa reazione del tessuto cromaffine contrasta, oltre che con. quella della raceolta di simpatoblasti paraortiei, anche con ]a reazione, altrettanto debole, dei vieini gangli della catena del simpatico.

A pTarecchio nervoso. Apparecchio nervoso centrale. Lo sviluppo dell'apparecchio nervoso centrale fu potuto seguire solo durante un periodo re]ativamente precoce e cio6 dallo stadio di m m 9 CR a quello di m m 36 CR; non sappiamo quindi purtroppo quale sia la reazione istocbimica per la f. ~eida suecessivamente alla I X a X a settimana. Ma i rilievi fatti in questi due embrioni sono in accordo ed appaiono assai interessanti. Nell'embrione pift giovane (mm 9 CI~) il tubo neurale ~ u n poco t u t t o reattivo, sebbene non uniformemente. La reazione conferisee a]la parete del canale midollare nel eomplesso una tinta bruno chiara. Lo strato pro/ondo, con cellule a earattere epiteliale in intensa attivit~ riprodhttiva nonch6 la membranella limitante interna appaiono a]quanto pifi colorati in confronto allo strato del mantello ed alla ]imitante esterna. Ma in una zona dello strato del mantello, corrispondente alla parte ventro-centrale della lamina/ondamentale, dove distintamente sono migrati e si differenziano i neuroblasti del corno anteriore, si apprezza una reazione assai viva e eircoseritta in modo netto e signifieativo (fig. 14). L~ lamina del pavimento, gis molto ridotta, ~ anche sede di particolare attivits enzimatica, mentre nessuna cellula della lamina tegmentale e di quella alare si diiferenzia per un pih alto tasso fosfatasico. I n questa zona eommessurale sono particolarmente colorati i nuclei profondi, da riferirsi allo strato del differenziamento nonch@ filamenti nervosi gi~ ben evidenti e ehe rappresentano le future fibre della commessura anteriore del midollo spinale. Gli abbozzi dei gangli cerebro-spinali si presentano nettamente reattivi e spiccano quindi nel mesenehima incolore che avvolge la superficie ]aterale del tubo neurale (fig. 14 e 16). I neuroblasti dei gangli appaiono colorati nei nuclei; i loro prolungamenti c o m e quelli extramidollari degli elementi somato-motori spinali (radiei anteriori) sono ben visibfli nelle sezioni mierotomiche per il loro ricco eontenuto enzimatico.

La reazione istochimica per la fosfatasi acida.

57

I1 velo marginale, privo di nuclei, costituito da un semplice reticolo nevroglico, 6 ineoloro fatta eccezione per i cilindrassi dei neuroblasti che lo attraversano. P~isMendo Ml'ence/ato si nora the la vescicola romboence/alica ~ gig bene manifestata e possiede una spessa loarete ventro-laterMe derivata per differenziazione dMle lamine fondamentMi ed Mari. La reazione istochimica vi ~ positiva e, come nel midollo spinale, 6 particolarmente accentuata nella parte che corrisponde alla lamina del pavimcnto (fig. 15). Nello strato del mantello della lamina fondamentale le cellule formano dei raggruppamenti in punti determinati, corrispondenti a quelli che saranno i nuclei motori dei nervi encefalici caudMi. La reazione istochimica soprattntto F i g . 14. L a r e a z i o n e di Go~ioRr p e r ]a f. a(~ida nucleare li differenzia in modo assai netto,

La lamina tegmentMe che former~ la volta del IV ~ ventricolo, appare a questo stadio (ram 9 CR) gig assai sottile ed d priva di f. acida ; la lamin~ del pavimento, invece, rido%a a una

a r m e r i s c e n o n u n i f o r m e m e n t e il t u b o n e u r a l e . E s s a appare molto intensa nella zona di differenziazione dei neuroni somatomotori e4 in corrisi)ondenza della lamina del ~)avimento. I gaugli cerebro spinali soup

pureassaireattivi. Sezionedi embrionedimm9CR. ~cro~ot.

stretta zona commessura]e, loresenta una spiccata reattivitg ehe trova corrispondenza con quella segnalata per la parte omologa del tubo midollare. Di Into alia vescicola rombo-ence-

fMica spicca, per il sup contenuto enzimatico, la vescieola acustica, il eui alto epitelio, destinato alla formazione dell'abbozzo dell'oreeehio interno, 6 colorato tanto nei nuclei quanto nel citoplasma (fig. 15). Anche il vicino ammasso gangliare, dell'VIII ~ e del V I I ~ 6 nettamente delimitabile dalla vivace reazione Meno

delle sue cellule,

reattiva ei 6 apparsa

la

yes-

F i g . 15. S e z i o n e d e l l ' e m b r i o n e u m a n o di m m 9 C R condotta attraverso il quarto ventrieolo. Nell'epitelio neurale ]a reazione non 6 nniforme; appare

accentuata in corrispondenza della lamina del pavi-

cicola mesence/alica, pochissimo quella m e n t o . S i a P p r e z z a n o te d u e v e s e i e o l e a e u s t i e h e , p u r e reattive nell'epitelio di delimitazione, ed in basso proence/aliea. In quest'ultima 6 pos- d u e n u c l e i d i n e r v i e r a n i c i m o l t o s e n t i . M i c r o f o t . sibile distinguere l'abbozzo del dienee[alp da quello del telence/alo e ci ha sorpreso il fatto che la veseieola telencefalica fosse addirittura incolora. Ma questa diminuzione progressiva del tasso enzimatico dalla I I I a alla I a vescicola encefalica, se pus far pensare subito ad un banale artefatto, appare invece attendibile se si considera che la parete del

58

F. RossI, G. P~SC~TTOe E. REALE:

eanale ottico, il caliee ottieo nonch6 l'abbozzo della leate hanno presentato una reazione positiva. I due foglietti del caliee ottico, sono di queste parti le pifi reattive. Tall nostre osservazioni sul nevrasse dell'embrione di mm 9 CR, poterono essere estese a stadi sueeessivi solo per quanto riguarda fl midolto spinale e limitatamente, purtroppo, allo stadio di mm 36 C]g. In questo embrione la parete del tubo midollare era aneora moderatamente reattiva; ben pifi reattivi ei si presentarono gli abbozzi dei gangli spinali, le eui eellule sono intensamente eolorate nel nueleo. Per quanto riguarda l'apparecchio nervoso peri/erico risulta gi~ da quanto si 6 esposto chela differenziazione sia delle radici sia dei nervi encefalo-spinali stessi e cosl pure dei ]oro gangli, sembra accompagnarsi ad un metabolismo enzimatico eleFig. 16. Si a p p r e z z a u n ganglio cerebro-spinale cui giunge dal tubo n e u r a l e la radice. I n e u r o b l a s t i sono m o l t o colorati. E m b r i o n e 4i m m 36 CR. Micro~ot.

vato,

t&llto

~ l~etta

e viva

la

loro

I nervi periferici a m m 9 e 36 CI~ sono molto seuri e helle sezioni, ad esempio, dell'abbozzo degli arti, si pub seguire agevolmente il loro decorso beneh6 il mesenchima dell' abbozzo stesso sia pure reattivo (fig. 17). Lo stesso reperto si rieav6 nell'embrione pifi sviluppato di mm 70 CIr. I1 sistema simpatico fu pure oggetto di indagine tanto nell'embrione di mm 9 CI~ quanto in quello di mm 36 CR. La reazione dei gangli della catena leggermente positiva, assai meno perb di quella dei gangli encefalo-spinali. Questa attivits enzimatiea modesta degli abbozzi del simpatico fu eonferata anehe pei ganglietti simmpatiei perivasali e parenehimMi Fig. 17. Sezione longitudinale 4ell'abbozzo di u n a r t o di messi in evidenza in questo e m b r i o n e di m m 36 CR. I t r o n c h i n e r v o s i appaiono a n n e r i t i materiale (fig. 13). dalla reazione p e r la f. acida. ~iicrofot. eolorazione.

Considerazioni e conclusioni.

La tecnica della reazione di Go~oaI per la [. acida 6 stata da noi applicata allo studio dello svfluppo prenatale dell'Uomo, su materiale di diffieile raccolta, perch6 assai raro ad aversi soprattutto in eondizioni di fresehezza. Si presentarono a noi quindi numerosi piccoli problemi tecniei da risolvere di primo acehito, dovendo

La reazione istochimica per la fosfatasi acida.

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eseludere senz'altro la possibflits per le ragioni addotte, di sperimentare preventivamente la metodologia. Questa i m a g i n e ha fat~o seguito a quelle sulla f. alcaliaa pnbblieate neI 1951 ed ~ la prima, da quanto ei risulta, esperita fine ad oggi nell'uomo. Abbiamo potuto approfittare perb dell'esperienza di numerosi rieercatori ehe nell'ultimo deeennio e in partieolare negli ultimi 4 o 5 anni, hanno saggiato, eritieato, modifieato la teenica originale di Go~o~I, applieandola su materiale adulto ed anche embrionario non umano. Le ragioni della aleatorietE del metodo per la f. acida in eonfronto a quello per la f. alealina non sono tutte forse aneora ben note; disponiamo tuttavia di norme per evitare le principali cause di insuccesso e gli artefatti. Sappiamo, soprattutto dai eoafronto con le indagini bioehimiche su omogenati, quanto enzima va perduto (inattivato) helle diverse manipolazioni; sappiamo rieonoseere fenomeni di diffusione dell'enzima stesso, come anche distinguere tra banale impregnazione tissutale da parte di joni di piombo (PaLADE 1951) e eorretta eolorazione del precipitate di fosfato di Pb. Pi~l diffieile ~ senza dubbio apprezzare il grade della perdita inevitabile di enzima, ehe per la f. aeida pub essere assai alto ; ma per queste indagini, ehe eoneernono tutti gli apparati ehe si abbozzano, ehe si differenziano e ehe iniziano anehe in parte a svolgere una funzione nel eorso dell'ontogenesi, l'errore nel quale saremmo ineorsi non pus pregiudieare seriamente le eonclusioni alle quali siamo giunti. La determinazione quantitativa del tasso enzimatico nelle sezioni microtomiehe ~ u n problema assai diffieile da risolvere. Coloro ehe se ne sono interessati, e rieordiamo tra gli altri Go~o~I, MOOG, DOYLE, hanno proposto e utilizzato eomplessi proeedimenti ehe riehiedono esperienza o]tre ehe apparecchiature non eomuni. Ad ogni mode si deve eonvenire ehe l'interesse vivissimo degli Studiosi in questo nuovo eampo delia rieerea ha po~uto essere gi~ appagato da risultati eonsiderevoli. Per quanto eoneerne la nostra esperienza nel materiale umano essa 6 stata eonfortante. Non si 6 lamentato nessun ease di insueeesso vero e proprio ed a questo risultato siamo giunti anehe per aver ineluso, specie il materiale pih voluminoso, in tanti pezzi siagoli e per avere suddiviso le serie di sezioni su molti vetri portaoggetti. La prhna eonsiderazione di ordine generale ehe seaturisee dall'esame dei nostri preparati 6 e h e l a f. aeida appare molto diffusa nell'embrione e nel fete umano, per eui pratieamente non vi 6 parte del eorpo ehe ne sia assolutamente priva. D'altro canto per6 il tasso enzimatieo non raggiunge nei singoli abbozzi quei valori ehe abbiamo aeeertato, sia pure con una valutazione grossolana, per la f. alealina, in determinati momenti dell'ontogenesi ed in eerti abbozzi. Ma non 6 il ease di sottolineare eeeessivamente il fatto, date ehe sappiamo dalle rieerehe di WOLF, KaBAT, NEW~tLr (1943), LlSON (1948), ehe durante lo svolgimento delle reazioni a ea~ena va perduta una notevolissima quantit~ eli enzima (seeondo DOYLE, O~OTO, DOYL~ 1950 sine al 60%). La seeonda eonsiderazione f a t t a e ehe d'altro canto 6 in un eerto sense legata alla prima, riguarda la prevalente loeMizzazione nueleare dell'enzima. Laddove in un abbozzo e'6 f. aeida, sempre abbiamo apprezzato l'imbrunimento pih o meno mareato della membrana e sovente dello stesso eontenuto nucleate. I1 citeplasma, in genere, appare pih di rado eolorato, anehe se l'abbozzo ha alto

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F. ROSSI, G. P:ESCETTOe E. REALE:

contenuto enzimatico. Cib dipende senza dubbio anehe dal fatto ehe le eellule embrionali sono per lo pifl a grande nueleo ed in attivitg moltiplieativa. I~ieordiamo ~uttavia ehe nell'abbozzo surrenate, Mlo stadio di m m 36 Ct/,, gli elementi di origine neuro-eetoblastiea hanno un citoplasma molto abbondante il quale reagisce positivamente, mentre @ del tutto ineoloro nei eontrolli allestiti senza substrato. Nella letteratura abbiamo trovato varie segnalazioni di una localizzazione prevalentemente nucleate della f. acida in materiale proveniente da animali sia adulti sia neonati o addirittura Mlo state embrionale e fetale: WOLF, KARAT, N~WMAN (oltre che nell'uomo anehe in roditori vari), Mooe (nell'embrione di polio), SIn, KIN e GARD~Ea (in roditore), DEA~E e DE~ps~u DEA~E (in roditori come il tope, ratto, coniglio e poi nel gatto, serofa, seimmia, pipistrello), Mo~:rACNA e NOBAK (roditori e uomo), NO~TAC~A e P A ~ s (cane), JIJNQuEn~A (Bufo marinus), SOULAI:aAC, TItlBAUD, TEYSSEYI~E (ratto), ABOLINS e ABOLINS (carla). L'unico reperto diseorde 6 forse quello di NOBAK e PAFF i quail sostengono ehe la presenza di t. aeida nel nueleo 6 nna partieolare earatteristica solo di ben determinati elementi tissutali ed anche solo di eerie specie animali, e the nel ease di fibroblasti eoltivati in vitro la reazione 6 nettamente eitoplasmatica, qualora non si pratiehi preventivamente la fissazione. Un terzo rilievo di ordine generale si rieava da queste indagini ed 5 quello delle variazioni piutt0sto limitate della sede e del tasso della f. aeida durante fl periodo dello sviluppo indaga~o. ~ Questo fatto merita una eerta eonsiderazione. Nel case della f. alealina, infatti, la s e d e e il tasso mostrarono invece di variare notevolmente nell'ontogenesi dell'uomo e r]uscimmo anehe a mettere in rilievo un ralcporto di taluna di queste variazioni con un precise memento dello sviluppo. Fu dunque pure possibile prospettare agevolmente il probabile signffieato di quella attivit~ enzimatica. Poieh5 fl contegno della f. aeida @risultato diverse e nel complesso, come affermammo, meno soggetto ad improvvise, grandi variazioni, dovremo eoneludere ehe il sue meeeanismo d'azione e il sue compito diiferiseono assai da quelli delia f. alealina. Potremmo perb anche prospettarei il dubbio di non avere eonseguito una perfetta rivelazione della f. aeida; ma a questo dubbio rispondono esaurientemente risolvendolo le rieerehe di Mooc e di MooG e STm~~ a c ~ in omogenati di embrioni di pollo, dalle qtlali risutia eonfermata la no• stabilit~ dell'enzima the gi~ al VII~ giorno di ineubazione ha la sede ed il tasso earatteristiei dello state iunzionale dell'organo. I1 quarto ed ultimo rilievo di ordine generale ~ di earattere comparative nei riguardi delle due Iosfatasi alealina ed aeida. Malgrado la notevole dfffusione degli enzimi stessi nei tessuti e negli abbozzi degli organi embrionali e fetMi umani, solo in pochi abbozzi e in eerte parti degli abbozzi stessi, riseontrammo una eoineidente distribuzione ed un pressoeh6 uguale earieo di enzimi. Questo g il case, ad esempio, di aieune glandu]e come la gonade, la surrenale, il rene. Ma 6 una coineidenza per lo pifl apparente, grossolana; pereh~ l'analisi minuta ha messo poi in luee spesso della dffferenze ehe in eifetti eontraddistinguono un diverse impiego, oltre ehe una indubbia diversa parteeipazione quantitativa, dei due gruppi enzimatiei al ricambio de] fosforo, durante lo svfluppo embrionale. Ci rfferiamo in partieolare all'appareeehio urinario.

La reazione is~ochimiea per la fosfatasi acida.

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Seeondo la MooG la f. aeida 6 gig presente nella blastula non ineub~ta di pollo ed al I I I ~ giorno si @ diffusa in tutti i tessuti non aneora differenziati, eoneentrandosi neli'abbozzo della notoeorda e del tubo midollare. Alla fine del primo mesa dello sviluppo embrionMe dell'uomo (mm 9 C/~ = schema I ~ l'attivitg della f. aeida @gis notevole ed assai diffusa, ma con profonde difterenze distributive. Nel tubo digerente, ad esempio, il metabolismo enzimatieo @limitato ali'intestino branehiale ed all'intestino anteriore del troneo, sino Mlo stomaeo eompreso; presso a poeo l'attivit& si arresta in eorrispondenza dell'ansa ombelieale. ~[yelenee20hMon

/ ~ De Wolfl

Schema I.

S c h e m a d e l l a d i s t r i b u z i o n e d e l l a f. a e i d a n e g l i a b b o z z i d i a ! e u n i a p p a r e e e h i n e l l ' e m b r i o m e u m a n o di m m 9 CR.

La locMizzazione iniziale per molti organi risulta eertamente nell'epitelio ed @da ritenere ehe eib valga per tutti o quasi gli abbozzi. Negli s~adi sueeessivi la 1. aeida si estende Ml'intero tubo intestinale, con una graduallY& progressiva per tasso e superfieie (sehemi I I ~ I I I ~ IVO). Per quanto riguarda il mesenehima non eondensato e eondensato, salvo poehe eeeezioni (lingua, esofago, stomaeo) e per un primo momento dello sviluppo, esso non possiede the searso enzima. Consideriamo anehe questo 1afro come molto earatteristieo del contegno della f. aeida nei eonfronti della f. alealina ehe antra inveee in grande quantits nel mesenehima formativo ehe sta eondensandosi e ehe g gig eondensato. I1 tessuto museolare liseio in via di dilferenziazione 6 reattivo helle varie patti det ~ubo digerente (a partire dallo s~adio di m m 36 C~). Anehe questo 6 un earattere ehe dillerenzia la f. acida da quella alealina, la quMe non si loealizza in questa lamina. Reperto identieo ottennero WOLF, K A ~ T e N m ~ A x nelI'adulto. Un mesenehima assai reattivo @ quello del territorio degli arehi branehiali; sembrerebbe dunque ehe solo il mesenchima il quale antra nella eomposizione dell'intesthm branehiale e dei suoi derivati, abbia un rieeo eontenuto enzimatico.

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F. gosse, G. P~se~o

e g. R~AL~-

L'epitelio glandulare di tutto il canale offre una reazione nettamente positiva. SegnMiamo, per la sua singolarit~, l'assenza di f. acids dall'orlo cutieo]are dell'intestino, una zona quests hells quale vi 6 nettamente localizzato e ad alto tasso la f. alealina e the fu vista reattiva per la f. acids in vari animali adulti (nel duodeno da DEANE e I)EI~IPSEY, 1945 e in vari organi da DEANE, 1946). I nostri reperti nell'Uomo accordano con quelli della MooG negli Uecelli, in particolare nel reperto di una intensa attivit~ degli epiteli glandulari della parete della prima metg del eanale Mimentare, e hells progressiva diminuzione del tasso enzimatieo proeedendo lungo il erasso, verso la cloaca. Come negli Uceelli (MooG) cosl nell'Uomo l'abbozzo del legato Medulla spin. Oesophagus (sehemi I ~ I I ~ IV ~ 6 precoeemente sede di vivaeissima attivits fosfatasica, the si eonserva anehe nella :arenalis vita extrauterina, come sappiamo dalle rieerehe di Go~oaI, D E A ~ e ~rieulus ~)EMPSEY, I ) E A N E , SULKIN e GARDNER e, particolarmente, da quelle ',reas della Zo~zonI, la quale avrebbe er accertato un ulteriore incremento di ;enitalis. attivit~ fosfatasica subito dopo la nascita, nel topo nero (1951). Dai reperti nostri e di Mtri risulta the, mentre la f, acids ha nel legato un metabolismo attivo preeoce, il quMe nei diversi animali messi Mlo

studio, perdura anche nell'adulto quells aleMina 6 presente nell'Uomo solo all'inizio dello sviluppo, perch@ dopo la decima settimana seompare definitivamente; comunque 6 sempre assente dMla parete dei vasi. L'epitelio degli abbozzi del Tancreas entodermico a 36 m m CR 6 sede di f. acids e eib 6 pure in aeeordo con i reperti sugli embrioni di polio (MooG). Per quanto eoneerne il pancreas adulto, mentre Gol~Iol~I nel 1941 non vi avrebbe trovato f. acids (in uomo, cane, gatto, eec.), l'attivit~ enzimatiea fu inveee messa in evidenza, perb pifi nelle isole ehe negli aeini, da WOLF, I(a~aT e N~WmAN (1943) noneh6 da NOBAK e MO~TaGNA (1947) nell'uomo e in vari goditori. Passando dM eanMe alimentare con i suoi annessi, Ml'esame dell'apTarecchio polmonare, il eontegno enzimatieo durante l'ontogenesi appare anMogo, forse ancora pit1 ehiaro. La differenziazione e 10 sviluppo sono infatti accompagnati dulls presenza di f. acids ehe se dapprima interessa la sola parte epiteliMe dei saechetti, si estende poi anche al mesenehima ehe eireonda le ramifieazioni bronehiali maggiori ed entra nella eomposizione della loro parete (sehemi I c, I I ~ ~ IV0). Negli ueeelli l'attivits fosfatasica dell'apparecehio polmonare inizia preeocemente, ma rests modesta (MooG). I reperti quindi nell'uomo e negli uecelli nel eomplesso accordano. Dobbiamo convenire ehe quests reazione enzimatiea del polmone, se 6 espressiva di un proeesso istogenetieo, dovrebbe mutare a svfluppo ultimato. Le ricerche the sono state eseguite tanto nell'uomo quanto in vari Mtri Schema II. Rafs schematics dell'attivitg fosfatasica (in nero) nell'embrioneumano 4 i m m 36 CR.

La reazione istochimiea per la fosfatasi acida.

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animali adulti, da rieereatori partieolarmente competenti quali sono il GoNo~I e WOLF, KABaT e N~WMAN, non sono a tale riguardo del tutto in aeeordo. Mentre infatti per GOMORI la f. aeida non si dimostra, i seeondi avrebbero messo in luce la presenza dell'enzima nell'epitelio, bench6 a tasso modesto. Bisogna tuttavia preeisare ehe, mentre WOLF, KABA~ e NEWMA~ affermano di avere utilizzato materiale umano non normale, el5 non risulta per Gormal. Nemmeno la f. alealina parteeipa in mode rilevante alla differenziazione ed allo sviluppo dell'appareechio traeheo-bronehiale ed a quello del polmone. Questa modesta attivits della f. alealina 6 limitata inoltre ad un periodo preeoee dell'ontogenesi, ~ ~ _ dope di ehe (al I V ~ mese) eessa eo~ eompletamente. Puhno Dagli abbozzi glandulari di derivazione branehiale abbiamo esaminato soltanto il time ehe diviene sede Suprar. di f. aeida, pare, solo in un periodo Ventrieulus tardivo dello sviluppo (schema IV~ Come per l'appareeehio polmonare, eosl anehe per questa glandula la reazione di Gogo~I per la f. aeida .Duodenum offre un reperto alquanto diverse da quello ehe abbiamo ottenuto per la f. Mealina. La differenziazione del SchemaIII. Raffigurazione sehematiea dell'attivith timo, il sue successive sviluppo e la d e l l a f. a e i d a n e l l ' e m b r i o n e u m a n o allo s t a d i o di m m 70 C R , i n e u o r e , p o l m o n e , g l a n d u l a s u r r e n a l e , sua attivit~ funzionale si aeeompagmetanefro,uretere, stomaeo, intestine tenue. nano infatti a metabolismo dell'enzima alealino. WOLF, K ~ a T e N~w~A~, ehe indagarono le altre glandule di origine branehiale dell'uomo adulto, non aeeennarono al time e forse non hanno visto resti timiei. Uno degli appareeehi la eui eomplessa evoluzione presenta, nei riguardi della fosfatasi, il maggiore interesse 6 senza dubbio quello urogenitale. Come per la f. alealina, anehe per qnella aeida abbiamo avuto la possibflitg di valutare l'attivitg enzimatiea in abbozzi di organi transitori quali il mesonefro, il eondotto di WOLFF, l'allantoide, il eondotto di MOLL~., il seno urogenitale, oltre s'intende al metanefro, all'uretere, alla veseiea ed all'uretra, ehe sono abbozzi di organi permanenti. Mentre da principle (mm 9 CR) il eorpo di WOLFF ha un alto metabolismo fosfatasieo tanto alealhlo quanto aeido, a earattere diffuse (schema I~ sueeessivamente il eontegno dei due enzimi 6 diverse. La f. ale~lina resta loealizzata nell'epitelio del primo tratto dei singoli eanalini uriniferi (eanMe seeretorio) e seompare quindi dai glomernli; quella aeida offre inveee una reazione sempre vivaeissima in tutto il glomerulo vaseolare e nell'epitelio della eapsula e dei eanalieoli. I1 eanale di WOLFF 6 privo di f. alealina, ma possiede quella aeida. Anehe il metanefro 6 un organo ad alto tasso enzimatieo (schema I I ~ III~ La f. aeida vi 6 diffusa durante tutto 1o sviluppo, con earatteristiehe tuttavia alquanto diverse da memento a memento e da parte a parte del nefrone; alla fine del I I I o mese la parte a pih alto tasso 6 quella epiteliale, tanto della eapsula

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F. Ross~, G. P~scs:rTo e E. REALE:

glomsrulare quanto del canalicolo urinifero, specie dsl primo tratto contorto. I1 metanefro ha inizialmente (mm 9 CR) un modesto metabolismo fosfatasico alcMino, ehe per6 aumenta s si diffonde presto (II ~ mess) ; poi si loealizza nsttamsnte nell'orlo cuticolare, nella membrana basale e helle granulazioni citoplasmatiche dsll'epitslio. Tra il IV ~ e il V ~ mese la f. alcalina appare limitata all'epirelic del tubulo contorto. L'urstere, l'allantoide e i l eondotto allantoideo, la vescica urinaria, l'uretra, sono tutte vie di escrezione helle quali, mentre manca la f. alcalina, ~ presente, benchg in tasso poeo elevato, l'enzima acido. I reperti delia MooG per ls f. acida nell'appareeehio urinario dell'embrione di pollo accordano nel complesso con quelli nostri sull'nomo. L'Autrice, ehs ha elaborato dells interesssuti Tabelle dei vslori enzimatici, mette il corpo di WOLSF sssisme al fegsto e all'allsntoide, tra le formszioni a pih alto tasso enzimatico. Per qusnto concerne l'Uomo, noi porremmo in primo piano l'abbozzo della surrensle e quello del legato, in un sscondo il mesonefro ed il metsnefro. Secondo la lV[oo~ il metabolismo della f. scids dal IV ~ al V ~ giorno di ineubazione si accentua nell'epitelio e soprsttutto nel bordo a spazzola del tubulo secretorio del mesonefro. La capsula di Bow~Aar non 6 reattiva in tutti i eorpuscoli ed i glomeruli hanno un tasso enzimatico modesto. A noi la reszione ~ apparsa farsi invece poco a poeo pifi spiccsta nei glomeruli, mentre nell'epitelio dei canslini come del resto nel csnale di WOLFS, la loealizzazione si preeisa nettamente nuelesre. Questa rsattivit~ dei glomsruli mesonefridici 6 una earatteristica eui vorrcmmo attribuire un certo valore perchg g propris della f. acids e dei soli vasi del glomerulo arterioso. Nells parers dei vssi sanguiferi anche eapillari la reazione per la f. acida in genere negativa, mentre ci 6 risultsta positiva la reazione per la f. alcalina nella parete (endotelio) dei vasi sanguiferi pifi piccoli di molti abbozzi. Anehe nel metanefro il corpuseolo conserva durante lo sviluppo embrionale e fetale un suo patrimonio di f. acids. Questo reperto dell'attivitg della f. acids nel metanefro fetale, indurrebbe a ritenere the l'enzims sia presents nel rene snehe dopo la nascita. Effettivamente el5 fu dimostrato da WosF, KABAT e NEW~A~ (nei nuclei dsl parenchima, ma anche nel citoplasma di cellule epiteliMi di qualche tratto del tubulo urinifero) e da D ~ a ~ s DE~rSEY (nell'epitelio dell'ansa del tubulo urinifero). La gonade indifferenziata (schema I I ~ ~ resttiva tanto nell'Uomo, come sbbiamo visto noi, quanto negli uccelli (MooG). La f. scida ci g apparss nettamente localizzata nei nuclei; la reazione 6 psrb meno vivace di quells della f. alcalina la quals, come fscemmo noto a suo tempo, g cosl intensa e diffusa da snnerire e mascherare le strutturs minute. Purtroppo non abbiamo potuto essminare gonadi differenziate se non nel feto d i c m 36 CH, nel quale l'enzims g attivo in varie pargi dsll'ovMo (schema IV~ Le nostrs conoscenze quindi sulls partecipazione delia f. acida al processo morfogenetico e di diffsrenziazione dell'apparato genitale sono sssai limitate. Dalla letteratura risulta che nells gonadi di alcuni animali adulti l'enzima ~ presente. I1 Go~oR~ infatti raise in evidenza la f. acida nel corpo luteo della cavia e del cans adulti, in modesta quantitY; la gonads maschile gli g risultsta negativa nsll'uomo e nella csvia e positiva nel gatto. Anche WOLF, KABAT e N~w~A~ trovarono l'enzima e cio~ nsll'epitelio dei tubuli con~orti del testieolo, delle vie seminifere e hello stesso ovaio. Nel

La reazione istochimics, per l~ fosfatasi acida.

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complesso i reperti di questi I~icercstori ricavsti dall'ovajs dells donna sdulta non divergono molto dsi nostri, ricavati nel feto. Sis s noi sis alla MooG il canale di M/2Lr,ER @appsrso reattivo; ls differenziazione dell'orgsno si aecompagna snehe ad sttivit& di f. aleslina, Ia quale alla fine del I I ~ .mese offre anzi uns reazione vivaeissima. Seeondo G o ~ o z I ls f. acida 6 presente nells milza dell'adulto (Uomo, cane, gopher, gatto, topo, ground hog), ci6 ehe confermsrono WOLF, KABAT e NEWMAN i~ seguito, precissndo ehe l'enzima si loealizzs nei corpuseoli di Malpighi. Ls MOOG osserv6 una debole reazione dell'sbbozzo splenico degli Uccelli. Noi, che esaminammo l'abbozzo di quest'organo solo nell'embrione umano di mm 36 CR, lo trovsmmo privo di f. acids. Questa diversitb, di reperti in materisle embrionsrio non ci sembrs tuttavis di grande rflievo. L s ragione potrebbe risiedere nel fatto the i dsti stessi concernono snimsli appartenenti a due specie ben lontane frs loro, ms pifl verosimilmente nel fatto the, disponendo noi di un solo csso, ci riferiamo esclusivamente allo stsdio di mm 36 CR. Ls differenziszione dells mflzs non precoce e si svolge lentamente; i primi segni di differenziazione nell'Uomo si apprezzerebbero in embrioni di mm 37,5 CI~. Possiamo quindi snche legittimsmente supporre che l'attivit~ dells f. acids inizi Schema IV. l ~ a f f i g u r a z i o n e s c h e m g t i c a d e l l ' a t t i v i t ~ d e l l ~ f. a e i d ~ n e l f e t o u m a n o d i m m col processo di differenziazione dell'ab360 CYf i n c u o r e p o l m o n e , t u b o i n t e s t i n a l e , legato, t i m o , ovaia e tromba ~terina. bozzo ed anehe pih tsrdi. D'sltro canto ricordiamo ehe nelle ricerehe sulls f. alcslins, mentre nell'embrione umano l'abbozzo indifferenziato ha un alto tasso enzimatico (BossI, 1DESCETTO,REALE) negli Uccelli ssrebbe invece poverissimo (MooG). Lo sviluppo dells surrenale si sccompsgna sd un slto metsbolismo enzimatico (schems I I ~176 Gis segnalsmmo il fatto s proposito delle ricerche sulls f. alcslins ed ors ripetiamo ls segnalazione anehe per ls f. acids. Precisiamo inoltre che ls reszione hells surrensle o meglio nell'abbozzo midollsre, 5 non solo nel nucleo ms snche nell'sbbondante citoplssma dei suoi elementi voluminosi. I1 fstto merits un rilievo perch6 di pochissimi sltri elementi embrionsli e fetsli la reszione per la f. acids colors anche il citoplasma. Ls MooG osserv6 nell'embrione di pollo un aumento dell'attivits della f. acida nell'sbbozzo surrenale dall'inizio sino sl V I I I ~ giorno, oltre il qusle non estese Is rieercs. Ms dursnte questo periodo, the 6 sbbastanza lungo, I'A. non pot6 sorprendere csrstteri istochimici differenzisli dei vari elementi. Dovremmo quindi concludere c h e l a differenziszione istologics ed istochimics nell'uomo e negli uccelli si svolge in modo non del tutto corrispondcnte. La letteraturs ei informs the nells surrensle di diverse specie di animMi e dello stesso uomo, continua nell'adulto l'attivit~ dells f. acida

~or Pu~m l o. ~ - V e n k r / c u / u . ~

Zeitschr. f. Anat. u. Entwicldungsgesch. ]3d. 117.

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F. l~ossI, G. P~SC~TTOe E. KEaL~:

(GO~OIKI, WOLF, ~A~RAT e N~EWI~AI% ~OULAII~AC, THIBAUD, TEYSS~Y~E) che]a MooG e noi abbiamo messo in evidenza durante ]o sviluppo prenatale. Anzi, seconds WoL]~, K_aBAT e NEW~AN, la parte midollare, the noi abbiamo trovato pih ricca di enzima, sarebbe la pill reattiva anehe hell'adults. Assai interessanti ci appaiono i reperti ottenuti nel camps del tube .midol[are e delle sue diiferenziazioni (schema I ~ II0). La f. acida vi 6 presente gig alla fine del I ~ mese in quantitg moderata, fatta eccezione per la zona di diiferenziazione dei neuroni somatomotori che spicea per la sua maggior reattivitg e eolorazione. Quests rfiievo era state latto dalla MooG negli ueeelli ed aequista quindi maggiore importanza; ebbe psi conferma in ricerehe eseguite hell'adults (WOL~, KABAT, N~wMA~ e molti ~Itri AA.). Seconds la Moo~ l'enzima presente ne]l'apparato nervoso centrale sull'embrione di polio diminuisee di tasso, sine a ridursi a traceie, dal IV ~ all'VIII ~ gismo di ineubazione. I n contrasto con il rilievo da noi fatto a proposito della f. alealina, essere of06 la lamina clel ~avimento priva di enzima, nel case della f. aeida questa parte ridotta del tube neurMe 6 inveee sede di particolare attivitg enzimatiea. La reazione positiva anche in quelle porzioni della parete delle vescicole encefMiche che ne sons derivate, come 4 positiva del rests in eorrispondenza dei nuclei dei neuroni motori ehe vi si vanno differenziando. Purtroppo le nostre rieerehe sul nevrasse eoneernono solo u n breve periodo (da m m 9 a m m 36 CR); nnlla sappiamo sfflla attivitg nel periodo successive dello sviluppo. La MooG, come gig rieordammo, la vide diminuire sine quasi ad esaurirsi verso t ' V I I I ~ dells sviluppo embrionale det polls. Ma noi sappiamo d'attro canto da numerosissime indagini, che hell'adults, Uomo compress, I~ f. acida 6 attiva nel nevrasse. Bisognerebbe qnindi concludere ehe o negli uccelli adulti il sistema nervoso 6 privo di attivitg fosfatasica aoida, el6 ehe non sappiamo, o che, come 6 pifl probabile, lo affievolimento dell'attivitg dell'enzima riseontrata dal V I ~ MI'VIII ~ dalla MoocL sia un fenomeno transitorio. Non saremmo esaurienti se non ricordassimo anehe in queste eonclusioni, come la reazione per la f. aeida; nel camps delle veseicole encefaliche, ci sia apparsa deereseere in intensitg dalla vescieola meseneefaliea a quella teleneefMica. Non sappiamo se la MooG abbia farts un rilievo analogs negli ueeelli, in quanto l'Autriee si limita semplicemente ad affermare (;he helle veseieole eneefaliche delFembrione di polio l'attivitg enzimatie~ non 6 uniforme come non to 6 nel midollo spinMe. Tanto nel aistema nervoso ~oeri/erico quanto in quelto simpatico t'attivitg della f. acida 6 stata da noi bene doeumentata; la reazione ci 6 risultata eomunqne nmlto pih vivace in quells di diretta provenienza nevrassiale. Vale la pena di mettere in evidenza che helle raecolte edlulari paraaortiche inter-renali 6 possibile distinguere due tipi di elementi the noi abbiamo interpretato, anehe per la diversa reazione, come simpatoblasti e eromaffinoblasti. L'appareeehio vaacolare oifre lo spunto ad interessanti eonsiderazioni. Abbiamo visto ehe i vasellini dei glomeruli del mesonefro e del metanefro sons molto reattivi. La reazione per6 6 massieeia, vale a dire the eoinvolge tutto il glomerulo. In Mtri abbozzi, quali ad esempio il legato, la milza, la surrenale, non si ebbe mai la prov~ di un annerimento dell'intima dei vasi, come si verifiea invece per la f . aleMina in un periods preeoce dells sviluppo. L'intera parete mioeardiea 6

La reazione istochimiea per la fosfatasi acida.

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reatgiva (schema I ~ I I ~ ~ IV ~ come 6 reattivo, in stadi precoci, quel mesem ehima addensato subito all'intomo di certi vasi di piccolo e medic eMibro e the evidentemente si differenzia per far parte della parete, l%icordiamo chela f. alcalina invece, non partecipa per niente al proeesso formativo dell'appareechio cardiovascolare. Nel sangue la f. acida 6 prescnte nel nucleo dei suoi elementi, ma solo in un breve periodo dello sviluppo, ehe sembra eompreso fra ]a fine del primo mese e quella del quarto mese. Nel sangue dell'animale adulto GoMoaI non ~rovb traccia di enzima. Go~ioRi eselude la presenza di f. acida tanto nella parete dei vasi quanto nel sangue dell'adulto.

Conclusioni. 1. Nel materiale embrionario e fetale ]a fosfatasi 6 presente ed appare soprattutto locMizzata nei nuclei delle cellule. 2. Nel tube midollare si nota un'attivit& della f. acida in uric stadio precoce dello sviluppo (ram 9 CI~) e cire0scritta in mode assai significativo nella zona delle eellule radicolari anteriori nonch6 alla ristretta lamina basale. I1 tasso e ]a localizzazione sembrano non subire variazioni sensibili durante l'ontogenesi, a differenza di quanto 6 state dimostra~o da noi per la fosfatasi alcMina. 3. I1 tube digerente ~ sede di f. acida in mode particolare in tutto il segmento che precede l'ansa ombelicale. Gli abbozzi del legato, del pancreas e lo stesso appareechio polmonare hanno un contenuto enzimatieo notevole in tutti gli stadi di sviluppo esaminati. 4. La reazione 6 positiva l~el mesonefro, nel metanefro e debolmente nella parete del canale di WOLFF, dell'uretere e della vesciea urinaria. Si no~a attivit~ fosfatasiea nella gonade indifferenziata, attivitg the permane anche dope i] differenziamento dell'abbozzo. 5. L'abbozzo della surrenale g assM ricco di f. acida come log d'altra parte di f. alcMina. 5:el time l'enzima ~ presente nei corpuscoli di Hassal e, bench6 in quantitg minore, nei nuclei del parenchima. 6. Nell'abbozzo del cuore, a differenza di quanto abbiamo rilevato per la f. alcalina si dimostra la presenza di f. acida nei nuclei delle fibre muscolari. La parete di tutti i vasi, compresi quelli di ordine eapillare, non presenta alcuna reazione. 7. I1 mesenchima formativo non sembra interessato nei proeessi organogenetici, da attivit~ della f. acida nella misura e nell'evidenza the abbiamo rilevato per la f. Mcalina. 8. Da queste osservazioni risulta dunque the anche l'enzima fosfatasico acido, come quello alcalino, 6 assM diffuso nel feto e nell'embrione umano; esso non sembrerebbe perb legato ai processi di morfogenesi e di differenziazione degli abbozzi degli organi, nella stessa maniera della f. alcMina.

Ergebnisse. t. Bei Embryonen und Feten ist Phosphatase vorhanden und erscheint vor allem in den Zellkernen lokalisiert. 2. I m Fiedullarrohr beobaehtet man ein Auftreten yon saurer Phosphatase in einem friihen Entwicklungsstadium (9 ram), und bezeichnenderweise iokalisiert auf das Gebiet tier Vorderwurzelzellen bzw. auf die Grundpla~ce begrenzt. 5*

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F. Ross~, G. PESC]~TTOe E. REALE:

Konzentration u n d LokMisation soheinen wghrend der Entwicklung keinen merklichen Sehwankungen zu unterliegen, im Gegensatz zu den yon uns fiir die alkalisehe Phosphatase erhobenen Befunden. 3. ])as I)armrohr enth~ilt auffallender Weise saure Phosphatase in dem ges a m t e n Segment vor der Nabelsehleife. Die Anlage der Leber, des P a n k r e a s u n d ebenso der A t m u n g s a p p a r a t weisen i n alien u n t e r s u e h t e n Stadien einen b e m e r k e n s w e r t e n E n z y m g e h a l t auf. 4. Die I%eaktion ist positiv i n der Urniere, in der Nachniere u n d schwaeh in der W a n d des WoLF~sehen K a n a l s , des Ureters u n d der t I a r n b l a s e . I n der undifferenzierten Keimdriise finder m a n P h o s p h a t a s e a k t i v i t g t , die auch n a c h der Diiferenzierung der Anlage weiter besteht. 5. Die Anlage der N e b e n n i e r e ist sehr reich a n saurer P h o s p h a t a s e wie auch a n alkMischer Phosphatase. I m T h y m u s finder sieh das E n z y m i n d e n tIASSaLschen K S r p e r e h e n u n d , w e n n auch in geringerer 5Ienge, in den K e r n e n des Parenchyms. 6. I n der t t e r z a n l a g e k a n n m a n im Gegensatz zu dem, was wit fiir die alkMisehe P h o s p h a t a s e festgestellt h a b e n , die A n w e s e n h e i t y o n saurer Phosp h a t a s e i n den I ( e r n e n der ~ u s k e l f a s e r n naehweisen. Die W a n d Mler Gefage einsehlieglich aller Capillaren gib t keine positive R e a k t i o n . 7. ])as formative lV[esenchym seheint hinsiehtlieh der A k t i v i t ~ t y o n saurer Phosphatase bei d e n o r g a n b i l d e n d e n Vorggngen n i c h t i n dem Mag u n d m i t der Deutliehkeit beteiligt zn sein, wie wir sic fiir die alkalisehe Phosphatase hervorgehoben h a b e n . 8. A n s diesen B e o b a e h t u n g e n geht Mso hervor, dag aueh die sanre Phosphatase, wie die alkalisehe, in menschliehen F e t e n n n d E m b r y o n e n sehr verbreitet ist. Sic diirfte aber wohl n i e h t i n der gleiehen Weise m i t den morphogenetisehen u n d den Differenzierungsvorg~ngen der O r g a n a n l a g e n v e r b u n d e n sein wie die alkalische.

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